Nghiên ứu đặ điểm vi khuẩn lati sinh tổng hợp gamma aminobutyri aid và ứng dụng

Trang 1 TRẦN THỊ NGOANBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- TRẦN THỊ NGOANCÔNG NGHỆ THỰC PHẨMĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN LACTIC SINH TỔNG HỢP GAMMA-AMINOBUTYR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Trần Thị Ngoan

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN LACTIC

SINH TỔNG HỢP GAMMA AMINOBUTYRIC ACID VÀ ỨNG DỤNG

L I C

th y cô giáo trong Vi

u ki n thu n l i cho tôi trong quá trình h c t p

Công ngh Sinh h c Vi sinh, Vi n Công nghi p Th c ph m và cô giáo PGS.TS H

tôi trong su t quá trình nghiên c u và hoàn thành lu

Cu i cùng tôi xin chân thành c

ng viên, khuy n khích tôi trong su t quá trình h c t p và nghiên c u

Xin chân thành c

Hà N i, ộ ngày 25/8/2014

Tr n Th Ngoan

i dung nghiên c

có b t k v gì x y ra, tôi xin ch u hoàn toàn trách nhi m

Tr n Th Ngoan

M C L C

L I C i

ii

M C L C iii

DANH M C B NG BI U vii

DANH M C HÌNH NH viii

B NG CÁC CH VI T T T ix

L I M U 1

PH N I T NG QUAN 3

1.1

1.1 L ch s phát hi n.1 ị ử ệ 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá 4

1.1.3 M t s y u t ộ ố ế ố ảnh hưởng t i s ớ ự sinh trưởng c a vi khu n lacticủ ẩ 5

1.1.4 L i ích c a vi khu n lacticợ ủ ẩ 7

ic

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Cơ chế tác d ng và vai trò c a probioticụ ủ 8

1.2.3 Tiêu chu n l a ch n ch ng probioticẩ ự ọ ủ 9

- Aminobutyric Acid

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Hình d ng và c u trúc c a GABAạ ấ ủ 11

1.3.3 Quá trình t ng h p GABA trong nãoổ ợ 12

1.3.4 Cơ chế hoạt động c a GABA 13 ủ 1.3.5 Chức năng của GABA 13

1.3.6 Các ngu n sinh t ng h p GABAồ ổ ợ 14

1.3.7 Sinh t ng h p GABA t vi khu nổ ợ ừ ẩ 15

16

1.4.1 Gi i thi u v cám g oớ ệ ề ạ 16

1.4.2 Lên men vi khuẩn trên môi trường cám g oạ 17

PH U

2.1.1 Môi trường MRS 19

2.1.2 Môi trường sinh t ng h p ổ ợ GABA: Môi trường MRSS 19

2.1.3 Môi trường nutrient broth 20

2.3

2.3.1 Phương pháp xác định GABA b ng TLC (Thin layer chrotomagraphy) 21 ằ 2.3.2 Phương pháp xác định hình thái t bào b ng soi kính hi n vi 22 ế ằ ể 2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram 22

2.3.4 Phương pháp xác định ki u hình lên men 22 ể 2.3.5 Phương pháp xác định kh ả năng lên men ở ph pH , nhiổ ệt độ 22

2.3.6 Ki m tra kh ể ả năng sử ụng đườ 23 d ng 2.3.7 Phương pháp xác định tên loài b ng trình t 16S rDNA 24 ằ ự 2.3.8 Phương pháp xác định kh ả năng sống trong môi trường d ch d dày và ị ạ d ch ru t gi l pị ộ ả ậ 24

2.3.9 Phương pháp xác định kh ả năng bám dính 25

2.3.10 Xác định ph ổ tương tác với m t s kháng sinh 26 ộ ố 2.3.11 Ki m tra kh ể ả năng ức ch m t s ế ộ ố chủng vi sinh v t gây b nhậ ệ 28

2.3.12 Phương pháp thu nhận d ch chi t cám g o (Rice bran extract RBE) 29 ị ế ạ –

2.3.13 Phương pháp lên men lỏng môi trường MRSS RBE quy mô phòng thí

nghi mệ 29

2.3.14 Xác định GABA bằng phương pháp HPLC 29

PH N III K T QU VÀ TH O LU N 31

3.2.1 Đặc điểm hình thái 33

3.2.2 Các đặc điểm sinh lý c a ch ng 33 ủ ủ 3.2.3 Kh ả năng sử ụ d ng các nguồn đườ 34 ng 3.2.4 Định tên ch ng NCDC3 35 ủ 3.3.1 Khả năng sống sót trong d ch d dày và d ch ru t gi l pị ạ ị ộ ả ậ 36

3.3.2 Kh ả năng bám dính trên màng nhầy ru tộ 37

3.3.3 Ph ổ tương tác với m t s kháng sinhộ ố 39

3.3.4 Xác định kh ả năng ức ch m t s vi sinh v t gây b nhế ộ ố ậ ệ 40

Lactobacillus plantarum

3.4.1 Xác định thành ph n MRSS thích h p cho s sinh t ng h p GABA 41 ầ ợ ự ổ ợ 3.4.2 L a chự ọn môi trường cám g o thích h p cho quá trình lên menạ ợ 43

3.4.3 Ảnh hưởng của Vitamin B6 đến kh ả năng sinh tổng h p GABAợ 44

3.4.4 Xác định pH thích h p cho quá trình lên men 45 ợ

3.4.5 Xác định nhiệt độ thích h p cho quá trình lên men 46 ợ

3.4.6 Xác định nồng độ MSG thích h p cho quá trình lên men 47 ợ

3.4.7 Xác định th i gian thích h p cho quá trình lên men 48 ờ ợ

3.4.8 Sơ đồ quy trình lên men ch ng NCủ DC3 trên môi trường d ch cám g o ị ạgiàu GABA 50 3.4.9 Xác định GABA trong d ch lên men b ng HPLC 52 ị ằ

PH N IV K T LU N VÀ KI N NGH 55 TÀI LI U THAM KH O 56

h lên men

33

Hình 3.3 Lb plantarum 51

DNA Deoxyribo nucleic Acid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

HPLC High performance liquid chromatography

Vi khu c coi là an toàn, t c ng d ng r

nghiên c u v vi khu n lactic ng d ng cho s n xu t các lo i s n ph m ch

ch a các h p ch t có l i cho s c kh e ã và c quan tâm r ng rãi trên th

gi i M t s ch ng vi khu n lactic có kh

amino butyric acid

H p ch t gamma-aminobutyric acid (GABA) là lo i amino acid không tham

truy n neuron (neurotransmitter) c a h th ng th

ph m có ch a GABA có tác d ng b não và b th n kinh, c i thi n gi c ng

s ch ng Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc… c phân l p t nhi u lo i

th c ph m lên men kim chi Hàn Qu c paocai và s: , Trung Qu c shochu c, a

Nh t B n Nh ng s n ph m lên men ch a GABA t

probiotic Trong nghiên c u này, ch ng vi khu n probiotic Lactobacillus plantarum

Mục đích và nội dung c a nghiên c u t p trung vào nh ng vủ ứ ậ ữ ấn đề sau:

- Tuy n ch n ch ng vi khu n lactic sinh t ng h p gamma-aminobutyric acid

g i là Lactococcus lactic) là vi khu n lactic T nh ng nghiên c u trên

m chung v vi khu n lactic: là nh ng vi khu

ng và không sinh bào t , là lo i vi khu n k khí tùy nghi, có kh

thành peptide và acid amin, ho t tính này các loài là khác nhau, ng tr c khu n là cao nh t c bi t có kh

Trong t nhiên, vi khu n lactic phân b r ng rãi trong các s n ph m lên men

chua th c v t, s a, th u Ngoài ra vi khu

trong niêm m c mi ng, niêm m c ru t c a i, gia súc, gia c m

Ngày nay v i k thu t công ngh hi i con ng

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

nh phân gi i carbohydrate và sinh ra acid lactic Acid lactic sinh ra có th d ng

sinh ra acid lactic thì t t c các vi khu u là vi khu n lên men b t bkhông ch a các cytochrome và enzyme catala Chúng là các vi khu n k khí se

không b t bu c Khu n l c c a vi khu n lactic tròn nh

Lactobacillaceae Các chi chính bao g m Lactobacillu , Leuconostoc, Pediococcus, s

carbohydrate Acid lactic luôn là s n ph m cu i cùng c a quá trình lên men Ngoài

ra m t s loài c a Lactobacillus, Leuconostoc ho c Streptococcus có kh o

c acetoin ph n l n vi khu n, acetoin

chúng không thu nh ng nh quá trình hô h p Chúng không t ng h

c nhân hem, do không có cytochrome hay nh ng enzyme ch a nhân hem khác

Chúng có th ti n hành m t s ph n ng oxy hoá m t s ít các h p ch t h

khác nh flavoprotein Các ph n ng này không kèm theo vi c t ng h p ATP

Riêng vi khu n lactic tuy catala âm tính song l i có m t enzyme khác là se

peroxida b n ch t là flavoprotein Enzyme này là trung gian xúc tác quá trình oxy se

ch u acid r t t t Nh ng vi khu n lactic hình c u có th ng trong m

c tính sinh acid và ch u acid r t t t giúp vi khu n lactic c nh tranh v i vkhu

chúng thành hai lo i:

10 - 35 0C

1.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

 Ảnh hưởng của oxy

Vi khu n lactic thu c nhóm hô h p tu ti n, t k n vi hi

m này b nh b i s không có m t c a h enzyme y hoá - ox kh cytochrome

catala trong tse bào Quá trình oxy hoá vi khu n lactic x ng kèm theo s hìn

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

enzyme

nhi phát tri n c a vi khu n lactic khá r ng: m t s loài có th phát tri n 550C

có th phát tri n trong kho ng nhi 0 t 15 n 400C

 Ảnh hưởng của pH

ng m nh c

vi khu n lactic M i gi ng vi khu n lactic khác nhau thì có pH t i thích khác nhau

acidophile) và nhóm k acid (alkaliphile)

-

-1.1.4 Lợi ích của vi khuẩn lactic

t o nên nh ng ng có l i cho v t ch K t khi xu t hi n, khái ni

trong các n ph m khoa h c: (i) theo Fuller 1989 [20

c h t ph i hi u v sinh lý, vi sinh v ng d dày - ru t và quá trình tiêu hó

còn vi sinh v ng d dày - ru t (gastrointestine- GI) có th là có l i, có h i và trung tính

Vi sinh v t trong ru t non và ru t già hoàn thành n t quá trình tiêu hóa M t

s vi sinh v t có kh n xu t vitamin và chúng là vi khu n có ích S

ch t c a chúng không ph i là quá trình làm th i r a, s có m t c a chúng liên h

ng ru t có vai trò quan tr ng trong b o v s c kh e, phòng ng a b nh t t Vai

do v y t u ki n không thu n l i cho vi khu n gây h i Probiotic còn có vai trò

b o v ch t nh ng ru t nh s t ng h p và ti t ra các peptide có tính kháng

ru t

ng d dày- ru t có b m t l n ph ch t nhgi

truy n (atopic dermatitis), và phòng ng a ti n kh i trong d ng di truy n (atopy),

d ng phòng ng a ti n kh i trong d ng di truy n d a trên nh ng tri u ch ng lâm sàng; làm gi m nh ng d u hi u viêm t i ch

i ch t c a vi sinh v ng ru t cung c p

bào bi u mô ru t k t (colonocytes) b ng cách lên men carbohydrate thành acid h u

i v i s c kh e do probiotic mang l i là gi m các tri u ch ng v suy h p thlactose, kích thích tiêu hóa, kìm hãm ch

cholesterol trong máu [14]

1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng probiotic

Bacillus, Lactobacillus

Gamma - Aminobutyric Acid1.3.1 Định nghĩa

Gamma - aminobutyric acid, vi t t t là GABA, là m t amino acid không

Tên IUPAC: 4-aminobutanoic acid

Công th c phân t : C4H9NO2

m nóng ch y: 203,70C (4770K, 3990F)

Hình 1.1 C u trúc phân t c a GABA GABA là ch t c ch d n truy n th n kinh chính trong h th ng th n kinh

ng v t có vú [68] Là m t lo i amino acid không th thi

neuron th nkinh [35 ]

1.3.2 Hình dạng và cấu trúc của GABA

GABA có c u trúc g m 4 cacbon Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin

nh n proton (hình 1.1) Hình d ng c a GABA ph thu c nhi u vào u ki n môi

ng Trong tr ng thái khí, GABA cu n l i nhi u l n thành hình g p

thái r n, GABA có hình d ng m ch th ng, v i m t c u trúc d ng trans nhóm amin

cu i và d ng cis nhóm rboxyl k t thúcca d ng l ng GABA t n t i nhi u d ng

c u trúc khác bao g m d ng g p khúc, d ng m ch th ng Chính nh kh

t i nhi u d ng c u trúc khác nhau này t o cho GABA có nhi u ch

h c quan tr ng [35, 37 ]

1.3.3 Quá trình tổng hợp GABA trong não

c t ng h p t acid L -glutamic nh ho ng c a enzyme glutamiacid decarboxylase (GAD) và pyridoxal phosphate (d ng ho ng c a vitamin B6)

GABA shunt là m t nhánh t t c a chu trình Krebs Các GABA shunt là m t

n ch

trong chu trình Krebs) nh -oxoglutarate transaminase (GABA-T) thành

acid L-glutamic Ti p theo GAD xúc tác chuy n hóa acid L-glutamic thành GABA

t n ngu n cung c p s n c a GABA, quá trình chuy ng x y

hình thành l i acid glutamic Vì v y, m t phân t c hình thành ch khi

Succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) t

th tái nh p l i chu trình Krebs hoàn thành các vòng l p [37, 62 ]

1.3.4 Cơ chế hoạt động của GABA

nó b ng cách g n vào hai th th riêng bi t, GABAA và GABAB Các th th

các protein Khi GABA g n vào th th GABAA trên màng t bào th n kinh kích

ho t m kênh ion Cl- n s c c màng gây c ch Các lo i thu c ch ng lo âu

GABAA và GABA Các th th GABAB thu c h th th chuy

có c u trúc g n gi ng c u trúc th th chuy n hóa glutamate Th th GABAB trú t i

ti n synap và h u syn dap n t i m

r t m nh [35 7 , 3 ]

1.3.5 Chức năng của GABA

kinh và có gi c ng ngon Cùng v

gi các vùng ti p nh n tin c a các t bào này, kh ng ch các vùng ti p nh n tin Vì

và an th n [26, 56, 68]

1.3.6 Các nguồn sinh tổng hợp GABA

c phân b r ng rãi trong t nhiên GABA có nhi u nh t trong não

v y ngu n sinh t ng h p GABA t vi sinh v t chi m nhi

Lactobacillus brevis, Lb paracasei, Lb plantarum, Lc lactis là nh ng

ch ng vi khu n lactic c nghiên c u và ng d ng s n xu t th c ph m giàu

c ph m t ng h p GABA

1.3.7 Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn

Glutamic acid decarboxylase (GAD) chuy

ng h p GABA khác nhau, và có loài có th sinh t ng h p GABA,

Lactobacillus Lb.) ( và Lactococcus (Lc.)

men, có

66, 72] Lb delbrueckii subsp bulgaricus, Lb plantarum và Lb paracasei

su t lên men GABA là 660 mM [42 ]

1.4.1 Giới thiệu về cám gạo

Nam chi m kho ng 5,6% c a toàn th gi i, sau Trung Qu c (30,7%),

ng trên Thái Lan (4,4%) V xu

34 tri u t n thóc g o, th i ra kho ng 3 tri u t n cám t quá trình xay xát và ch s

Hi n nay, cám g c bi t quan tâm và nghiên c u nhi c

t cám g c ch ng minh là có l i cho s c kh e trong nâng cao s

gan, s i th n, các b nh v tim m ch [33] M c dù cám g o có nhi u thành ph n b

1.4.2 Lên men vi khuẩn trên môi trường cám gạo

khu n probiotic nh m t o ra các s n ph m có giá tr

c s d

có l i cho h tiêu hóa Vi khu n probiotic sinh ra h enzyme phytase có tác d ng

gi i phóng phosphate t phytase, th y phân ph c ch nh hình b i phytate, ion kim lo i ho c cation, làm cho các ch t d

phép trích ly t p h p các ho t ch t ch ng oxy hóa, mu i khoáng, vitamin, ch

hòa tan t cám Các ho t ch c trích ly t cám lên men có tác d

Hinguyên li u cám g o lên men b i ch ng vi khu n probiotic sinh t ng h p GABA

29gam/100gam m m lúa [58] Ngoài ra, m t công b g a nhóm nghiên c u

ng nghiên c u khá m i Vi t Nam Nhóm tác gi TS Tr n

ng - i h c khoa h c t nhiên tìm ra ch ng Lactobacillus plantarum KLEPT

MSG [3]

2.1.3 Môi trường nutrient broth

Ghi chú: Ch ủng trao đổ i là ch ng vi khu n lactic nh ủ ẩ ận đượ ừ s h p tác nghiên c u c c t ự ợ ứ ủa

Việ n Công nghi p Th c ph m v ệ ự ẩ ới các đối tác

cách mép trên b n m ng kho ng 1cm thì d ng quá trình ch y s c ký Phun dung

th màu

Đọc k t qu : ế ả

i ch ng là h n h p MSG và GABA chu n M u lên men sinh GABA s

m GABA song song v i ch t chu n, tùy theo m sinh GABA cao ha

sinh GABA trung bình; GABA(+/-): sinh GABA y u; GABA(-): không sinh

GABA

2.3.2 Phương pháp xác định hình thái tế bào bằng soi kính hiển vi

Pasteur, Hà N i, Vi t Nam; và s d ng khóa phân lo

Determinative Bacteriology

2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram

2.3.4 Phương pháp xác định kiểu hình lên men

c vào, 30

0C trong 24h và quan sát S n i b t trong

ng Durham, ch ng t ch ng có sinh CO2, s cho k t qu

men d hình ng Durham không n i b t ch ng t ch ng không sinh CO2 s cho k t

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng lên men ở phổ pH , nhiệt độ

 Kiểm tra ảnh hưởng của phổ pH:

Ki m tra ng c a pH th c hi n trên ng eppendorf có ph paraffin

bromocresol 0,17g/l t i 300C các ph pH 4; 5; 6,5; 8,5; 9,6

i ch ng âm là m u không b sung vi sinh v t, không lên

Đọc k t qu : ế ả

ng xanh tím, ký hi u (-) Ch ng vi sinh v t lên men s ch

ng sang màu vàng, ký hi u (+)

 Kiểm tra ảnh hưởng của phổ nhiệt độ:

Mannitol Sacharose Rhamnose Lactose

trong 48h Sinh kh i khu n l

ng, có b sung ch t ch th màu Bromocresol 0,17 g/l Tr u

 Tách chi t DNA t ng s : ế ổ ố

c ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút thu sinh kh i DNA t ng s c x lý

b ng kit promega [www.promega.com]

GeneAmp® PCR System 9700 (PE Applied Biosystem, M ) s d ng c p m i ph

940C trong 2 phút k ti p là 35 chu k nhi t (940C trong 30 giây, 520C trong 30

giây và 720C trong 1 phút) Quá trình khuy c hoàn t0C trong 7 t 72

v i t ng m i 16S-8F và 16S-1510R S

GeneBank thông qua giao di n tìm ki m BLAST nucleotide-nucleotide

2.3.8 Phương pháp xác định k ả năng sống trong môi trườh ng d ch d dày và ị ạ

d ch ru t gi l pị ộ ả ậ

c áp d ng theo Kos và cs (2000) [43], có c i bi n

ng d ch d c chu n b 3g Pepsine trong 1 lít dung dglycine-HCl 0,2M; pH 2

ng d ch ru t gi l p s d ng 1g/l pancreatin (Sigma) trong dung

d ch 0,5% w/v NaCl ch a 0,3% Ox bile dried pure (Merk) pH 8 (1g Ox bile x p x

10g mu i m

Ch ng vi sinh v c lên men 24h t i 300

t bào kho ng 108 109 (CFU/ml) Sinh kh i sau lên men ly tâm t i 10.000

thu sinh kh i t bào Sinh kh i t

m PBS (0,02% KCl; 0,144% Na2HPO4; 0,8% NaCl; 0,024% KH2PO4; pH 7) Sau

c hi n ki m tra kh ng sót c a ch ng vi sinh v

d ch d dày gi l p 120 phút và d ch ru t gi l p 240 phút t i nhi0C K t 37thúc th i gian , ti n hành trang c

 Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật:

D ch lên men vi sinh v t m t bào kho ng 108 109 (CFU/ml) L y

20ml d ch ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút t i 40C, r a 2 l n trong dung d ch

HEPES 10mM, pH 7,4 và hòa l i sinh kh i trong 4ml dung d ch này L y m u,

ki m tra m t bào b y trên MRS agar,trong dung d ch NaCl 0,85% pH 6,5 th i gian 48-72h t i 300C

 Đánh giá khả năng bám dính của tế bào vi khuẩn trên màng nhầy:

sung 0,4ml d ch sinh kh i vi sinh v t, t i 370C trong 1h K t thúc th i gian

, th c hi n r a 2 l n nh m tách các t

sung 0,4ml dung d ch HEPES 10mM pH 7,4 ch a 0,1% Triton X vào gi tách

loãng m u b ng dung d ch NaCl 0,85% pH 6,5 trong 0,1% Triton X Trang c y trên

m t bào bám dính, phi n b n m c x lý và ch m SEM (Scanninelectron microscope, Hitachi 4800)

 Chụp ảnh SEM mẫu tiêu bản bám dính của vi sinh vật:

d ch HEPES 10mM, pH 7,4 t i 40

sung d ch sinh kh i vi sinh v t, t i 370C trong 1h Dùng dung d ch HEPES 10mM

r a, l p l i quá trình r a 2 l n L y phi n b n ra kh i gi ng và th c

(Scanning electron microscope, Hitachi 4800) theo quy trình c

b n, ph màng cacbon và ch p nh

2.3.10 Xác định phổ tương tác với một số kháng sinh