luận văn thạc sĩ nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp kctc 9161

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2013 z LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ tơi q trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên hƣớng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi q trình thực nghiệm nhƣ chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học hồn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến z MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Khái quát acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose .5 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đƣờng 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose .9 1.4.1 Đại cƣơng Actinoplanes .9 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 10 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 11 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 12 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 12 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật 16 1.5.3 Các phƣơng pháp tinh thu nhận acarbose 17 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nƣớc 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Chủng giống 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Môi trƣờng 23 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 z 2.2.1 Lên men chìm ni cấy vi sinh vật 25 2.2.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 25 2.2.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 26 2.2.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy 26 2.2.5 Ảnh hƣởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 26 2.3 Gây đột biến NTG .26 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC 27 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose .27 2.6 Tách chiết tinh acarbose 28 2.6.1 Tách chiết tinh sơ 28 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột 29 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 31 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hƣởng từ hạt nhân 31 2.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 33 3.2 Tối ƣu thành phần môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 35 3.2.1 Ảnh hƣởng thời gian 35 3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn maltose 37 3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn glucose 38 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn bột ngô 40 3.2.5 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng .41 3.2.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 42 3.2.7 Ảnh hƣởng tốc độ lắc .43 3.2.8 Môi trƣờng điều kiện nuôi cấy tối ƣu 44 3.2.9 Xác định hàm lƣợng acarbose HPLC .45 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 46 z luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 48 3.4.1 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính .50 3.4.2 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 51 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 .51 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 52 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase .55 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 56 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận .60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 68 luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 z luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 24 Bảng 2.3 Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Khối lƣợng chế phẩm qua bƣớc tinh acarbose 55 luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 z luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .11 Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng lên men 33 Hình 3.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase môi trƣờng lên men 34 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 35 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian .36 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .37 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 39 Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ bột ngô đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 40 Hình 3.8 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .41 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 43 Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .43 luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 z luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 Hình 3.11 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng trƣớc sau tối ƣu .44 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 916 môi trƣờng tối ƣu .45 Hình 3.13 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.14 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 Hình 3.16 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột silica gel 49 Hình 3.17 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột sephadex G100 .49 Hình 3.18 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột than hoạt tính .50 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose .52 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính 52 Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ chuẩn acarbose .53 Hình 3.23 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 Hình 3.24 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 z luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 Hình 3.25 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh .55 Hình 3.26 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .56 Hình 3.27 Phổ proton 1H-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 57 Hình 3.28 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .58 Hình 3.29 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 59 luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161luan.van.thac.si.nang.cao.kha.nang.sinh.tong.hop.va.tinh.sach.hoat.chat.acarbose.tu.chung.actinoplanes.sp.kctc.9161 z