luận văn thạc sĩ nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chuyển hóa sinh học và thu nhận γ decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY, CHUYỂN HĨA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 z lipolytica ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY, CHUYỂN HĨA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH Hà Nội - 2014 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Hồi Trâm PGS.TS Ngơ Tự Thành người trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi nghiên cứu, hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị cán Bộ môn Công nghệ Enzim Protein, Viện Công nghiệp Thực phẩm-Bộ Công thương nhiệt tình giúp đỡ, bảo chia sẻ với thời gian thực tập Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học động viên, dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt q trình tơi thực đề tài Hà Nội tháng 6-2014 Học viên: Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm men Yarrowia lipolytica .4 1.2 Chất thơm từ lipit .7 1.2.1 Vài nét chất thơm dùng công nghiệp thực phẩm 1.2.2 Chất thơm -decalactone 1.2.3 Các đƣờng tạo thành chất thơm γ-decalactone vi sinh vật .10 1.3 Chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone chủng nấm men chuyển hóa chất béo .12 1.3.1 Nguồn chất .12 1.3.2 Các chủng nấm men có khả chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone 14 1.4 Ứng dụng nấm men chuyển hóa chất béo .14 1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone nấm men 17 1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất - decalactone nƣớc 18 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ mơi trƣờng nghiên cứu 21 2.1.1 Vi sinh vật 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Môi trƣờng 23 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 2.2 Phƣơng pháp 23 2.2.1 Nhân giống lên men máy lắc .23 2.2.2 Lên men theo mẻ nồi 5L 24 2.2.3 Lên men theo mẻ - có tiếp dần chất, nồi 5L .24 2.2.4 Lên men theo mẻ nồi 50L 25 2.2.5 Lên men theo mẻ có - tiếp dần chất, nồi 50L 25 2.2.6 Đếm số lƣợng tế bào buồng đếm hồng cầu 25 2.2.7 Lactone hóa dịch sau lên men 26 2.2.8 Chƣng cất dịch lên men đƣợc lactone hóa 26 2.2.9 Tách chiết -decalactone dung môi .26 2.2.10 Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết 26 2.2.11 Làm dịch chiết cô đặc 27 2.2.11.1 Làm dịch chiết cô rửa kiềm 27 2.2.11.2 Làm dịch chiết cô đặc Na2SO4 khan .27 2.2.12 Đánh giá cảm quan 27 2.2.13 Phân tích định lƣợng -decalactone sắc ký khí 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 Lựa chọn điều kiện lên men máy lắc 30 3.1.1 Lựa chọn tốc độ lắc 30 3.1.2 Lựa chọn pH môi trƣờng lên men 30 3.1.3 Lựa chọn thời gian nhân giống 31 3.1.4 Lựa chọn tỷ lệ cấy giống 32 3.1.5 Lựa chọn thời gian lên men 33 3.1.6 Ứng dụng phƣơng pháp lên men tiếp dần chất (fed-culture) 33 3.2 Nghiên cứu phƣơng thức lên men quy mô 5L 50L 35 3.2.1 Lên men quy mô 5L 35 3.2.2 Lên men quy mô pilot nồi dung tích 50 lít 40 3.2.3 So sánh tóm tắt phƣơng thức lên men quy mô 5L 50L 43 3.3 Lựa chọn điều kiện chiết rút thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 44 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1 Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone 44 3.3.2 Lựa chọn điều kiện thu nhận làm γ-decalactone từ dịch lên men49 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xn Việt DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng môi trường chứa methy ricinoleate Hình 1.2: Sơ đồ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm -decalactone 11 Hình 1.3: Một số hình ảnh thầu dầu (Ricinus communis) 12 Hình 1.4 Công thức cấu tạo axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic acid) 13 Hình 3.1 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH DO nồi lên men dung tích 5L 36 Hình 3.2 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, khơng khống chế pH có khống chế DO (A), có khống chế pH DO (B) quy mơ 5L .38 Hình 3.3 Động học q trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có khống chế pH DO, quy mô 5L 39 Hình 3.4 Động học q trình lên men quy mơ 50L, theo phương thức Batch culture (A) Fed-batch culture (B) 42 Hình 3.5 Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men chủng Y lipolytica VTP (A), sau làm phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D) 53 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần axít hữu dầu thầu dầu .13 Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - decalactone 14 Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng 21 Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hiệu suất lên men 30 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất lên men 31 Bảng 3.3 Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống .32 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men máy lắc 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone chủng Y lipolytica VTP5 .33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone chủng Y lipolytica VTP5 .34 Bảng 3.7 Tổng hợp kết lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y lipolytica VTP5 quy mô máy lắc 34 Bảng 3.8 So sánh kết lên men theo phương thức, thiết bị dung tích 5L 39 Bảng 3.9 So sánh lượng γ-decalactone cực đại thời gian đạt được, quy mô 5L 50L 43 Bảng 3.10 Lựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men……… 45 Bảng 3.11 Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng tốc độ khuấy thời gian chiết rút đến hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 47 Bảng 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γdecalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.14 Ảnh hưởng số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.15 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm sạch” 50 Bảng 3.16 Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng cất - chiết rút- làm sạch” .50 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Aox Acyl-coA oxydase ATP Adenosin triphosphat CoA Coenzyme A Cs Cộng FDA Food and drug administration GC Gas chromatography (Sắc ký khí) Mb Megabase POX Peroxisomal acyl-CoA oxidase v/p Vòng/phút Y- VTP5 Yarrowia lipolytica-VTP5 YM Yeast Maltose Y- MTLY36-2P Yarrowia lipolytica- MTLY36-2P DO Dessolved Oxygen (Hàm lượng ôxy hòa tan) YMA Yeast Maltose Agar S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae DE Diethyl ether U Unit L Lít Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica z luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt MỞ ĐẦU Con người biết đến chất thơm sử dụng chúng từ hàng nghìn năm Nó làm tăng chất lượng nhiều sản phẩm, đặc biệt thực phẩm Khi đời sống ngày phát triển, xã hội văn minh chất thơm sản xuất sử dụng ngày đa dạng phong phú số lượng lẫn chất lượng Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu lớn chất phụ gia tạo hương Hương tạo nên giá trị cảm quan hương vi đặc trưng cho thực phẩm Trong trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương nguyên liệu ban đầu dần đi, điều bắt buộc nhà cơng nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia tạo hương Mặt khác, sản phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua ) ln cần có mặt chất tạo hương Ngồi cơng nghiệp thực phẩm ra, ngành khác có nhu cầu sử dụng chất phụ gia tạo hương, là: cơng nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt loại thuốc cho trẻ em để làm át hương vị khó chịu thuốc làm cho thuốc dễ uống hơn; việc sản xuất hàng tiêu dùng kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv cần bổ xung chất phụ gia tạo hương Trong số cấu tử tạo hương este, andehyde, lactone, alcohol lactone hợp chất phổ biến cấu tử hương thơm số loại hoa quả, thảo mộc đào, mận, dừa, dâu tây Trong lactone γ-decalactone (C10H18O2) có giá trị nhất, nghiên cứu nhiều Chất tồn tự nhiên mức độ vi lượng, song thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại γ- decalacton tổng hợp đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ q trình chuyển hố vi sinh vật Trong loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), loại nguyên liệu phù hợp cho trình tổng hợp γ-decalactone Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu tạo axit ricinoleic, “cơ chất” để số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ q trình β-oxi hóa Chun ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 luan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolyticaluan.van.thac.si.nghien.cuu.dieu.kien.nuoi.cay.chuyen.hoa.sinh.hoc.va.thu.nhan.Ỵ³.decalactone.tu.dau.thau.dau.bang.nam.men.yarrowia.lipolytica z