55Hình 2.9: Quy trình xác định nồng độ kháng sinh №rfloxacin trong thu c kháng ốsinh Norfloxacin 400 mg theo phương pháp điện hóa và phương pháp UV-VIS.. 85Hình 3.18: Đường đặc trưng của
TỔ NG QUAN
Công ngh polyme in phân t ệ ử
1.2.1 T ng quan v công ngh lyme in phân t (ổ ề ệpo ử MIP)
Trong những năm vừa qua, r t nhi u th h nhà khoa hấ ề ế ệ ọc đã bị ấ h p d n b i các ẫ ở hiện tượng liên kết liên quan đến các tương tác xảy ra gi a các phân t t nhiên và ữ ử ự đã sử d ng r t nhiụ ấ ều phương pháp để ắt chước các tương tác này Sự b hình thành liên k t gi a m t phân t ế ữ ộ ửchủ và khách là kết qu c a m t l c liên kếả ủ ộ ự t Trong h th ng ệ ố sinh h c, các l c liên k t này có nhi u chọ ự ế ề ức năng và kết qu là các liên k t không ả ế c ng hóa tr ộ ị đã tạo ra m t h ộ ệ thống rất ổn định [17]
Công ngh polyme in phân t (MIP) là m t kệ ử ộ ỹ thuật tương đối m i và phát triển ớ nhanh cho phép ch tế ạo các đầu thu sinh h c nhân t o Công ngh MIP cho phép thiọ ạ ệ ết
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 19 k và ch tế ế ạo các đầu thu sinh h c nhân t o có tính ch n lọ ạ ọ ọc và độ đặ c hiệu được xác định trướ ức, ng dụng trong các lĩnh vực phân tách, phân tích, xúc tác, hay c m bi n ả ế sinh hóa [3][ 4] MIP thường s d ng ma tr n polyme kử ụ ậ ế ợt h p gi a ch t c n phân tích ữ ấ ầ và các gốc monome Sau khi lo i b các chạ ỏ ất phân tích (được gọi là khuôn m u) màng ẫ polyme s xu t hi n các khuôn nh n d ng phân t r t m nh T i mẽ ấ ệ ậ ạ ử ấ ạ ạ ộ ố ịt s v trí c a ủ khuôn có đính các liên kết có tính ch n lọ ọc tương tự như đầu thu sinh h c t nhiên ọ ự như kháng nguyên, kháng thể ho c ặ enzyme Độ ch n l c cọ ọ ủa phương pháp khá cao do d a vào các y u t hình dự ế ố ạng, kích thước và các nhóm ch c hóa h c c a ch t c n ứ ọ ủ ấ ầ phân tích [7] Chính vì vậy, phương pháp này không chỉ có th nh n di n các chể ậ ệ ất sinh học mà còn đặc bi t h u ích v i các ch t hóa hệ ữ ớ ấ ọc Ưu điểm c a công ngh này ủ ệ là các đầu thu sinh h c nhân tọ ạo độ ề b n và ổn định cao hơn so với các đầu thu sinh h c t nhiên trong các mọ ự ôi trường kh c nghiắ ệt như độ pH cao, áp su t cao hay nhiấ ệt độ quá cao ho c quá th p MIP có th s dặ ấ ể ử ụng được trong nhi u tháng mà không có ề t n th t vổ ấ ề hi u qu s dệ ả ử ụng cũng như yêu cầu b o quả ản đơn giản hơn so với ch t ấ sinh h c t nhiên ọ ự
Các lĩnh vực thích hợp để áp d ng MIP là c m bi n sinh h c và phân tích Công ngh ụ ả ế ọ ệ MIP vẫn đang phát triển, tuy nhiên v n còn t n t i mẫ ồ ạ ột khó khăn đặc bi t là kh ệ ả năng thương mại hóa chúng Đến nay vẫn chưa có sản phẩm MIP nào đã được bán trên th ị trường, nhưng đã có 123 ằ b ng sáng ch ế đến năm 2010 (theo cơ sở ữ ệ d li u c a ủ Scifinder)
1.2.2 L ch s nghiên c u và phát tri n c a công nghị ử ứ ể ủ ệMIP
Vào năm 1949, Dickey đã nghiên cứu về ự s trùng h p c a natri silicat v i bợ ủ ớ ốn loại hóa ch t khác nhau là methyl, ethyl, n-propyl và n-butyl Hóa ch t ấ ấ sau đó đã được loạ ỏi b , và trong các thí nghiệm tái liên kết đã cho thấ ằng silica đượy r c chu n b t ẩ ị ừ trước đều tái liên k t vớế i các phân t trong t ng lo i hóa ch t khác nhau Ngay sau ử ừ ạ ấ khi công trình này xu t hi n, mấ ệ ộ ố nhóm đã nghiên ứt s c u các ch t h p ph d a trên ấ ấ ụ ự phương pháp của Dickey Việc in các polyme hữu cơ xuất hi n lệ ần đầu tiên vào nh ng ữ năm 1970 khi việc in b ng liên k t c ng hóa tr ằ ế ộ ị trong các polyme vinyl được tìm ra Việc in b ng liên kếằ t không c ng hóa tr ộ ị được gi i thi u kho ng m t th p niên sau ớ ệ ả ộ ậ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 20 đó [18] Trong th p niên 1970, Wulff và c ng s ậ ộ ự đã phát triển k thu t in phân t dỹ ậ ử ựa trên liên kế ột c ng hóa tr c nh c a các mị ố đị ủ ẫu đường cis-diol thông qua este boronate vinyl n i vố ới các monome chức năng Các phân tử mẫu được tách ra kh i m ng ỏ ạ polyme bằng phương pháp th y phân Nh ng khuôn in MIP t o thành cho thủ ữ ạ ấy độ đặc hiệu cao đố ới v i các lo i mạ ẫu đường Mosbach và nhóm đã đi tiên phong theo con đường s d ng liên k t không c ng hóa tr ử ụ ế ộ ị để chế ạ t o MIP, mà ch c n s d ng ỉ ầ ử ụ m u t gẫ ự ắn k t (self-assembly) và monome chức năng Các "monome chức năng" có ế khả năng polyme hóa có thể k t h p vế ợ ới các mẫu (ch t c n phân tích) thông qua nhi u ấ ầ ề loại tương tác khác nhau, bao gồm c liên k t hydro, lả ế ực hút tĩnh điện và tương tác k ỵ nước Các nhóm ch c c a monome chứ ủ ức năng kế ợt h p m t l n n a trong m ng ộ ầ ữ ạ polyme liên k t chéo ế có mật độ cao và vì th m t l n nế ộ ầ ữa khuôn in đặc hiệu đượ ạc t o ra trong m ng polyme ạ Loại MIP không c ng hóa tr này ộ ị được sử d ng thành công ụ trong các lĩnh vực như kỹ thu t phân tích, xúc tác và công ngh c m bi n ậ ệ ả ế
Trên thế giới có hai xu hướng phát tri n công ngh MIP ch y u là MIP d ng hể ệ ủ ế ạ ạt nano d a trên liên kự ế ột c ng hóa tr và MIP d ng màng nano dựa trên các tương tác ị ạ không c ng hóa trộ ị Trước đây, MIP được ch t o b ng các công ngh ế ạ ằ ệ cũ với các hạt MIP có kích thướ ớc l n và ph i tr i qua quá trình sàng lả ả ọc để thu được các h t có kích ạ thước mong mu n tố ừ 5-50 àm cho cỏc ng dứ ụng khỏc nhau Phương phỏp này rấ ốt t n thời gian và hóa chất; các khuôn in có kích thước không đồng nh t và c n r t nhi u ấ ầ ấ ề phân t m u có th tử ẫ để ể ạo ra được các tương tác có ái lực m nh; kh ạ ả năng phân tán nhi t kém Chính vì v y các nhà nghiên cệ ậ ứu đã tập trung nghiên cứu để có th thu ể được các polyme in phân t ử có kích thước nano v i các tính ch t tớ ấ ốt hơn.
MIP d ng h t nano có t l giạ ạ ỉ ệ ữa diện tích b m t và th tích tề ặ ể ốt hơn dẫn t i các ớ phân t m u có th d dàng xâm nh p các khuôn ch n l c và c i thiử ẫ ể ễ ậ ọ ọ ả ện kh ả năng tái liên k t Thêm n a h t nano MIP d dàng phân tán trong dung d ch nên d s ế ữ ạ ễ ị ễ ử d ng trong các ng d ng phân tích, thay th enzyme, v n chuy n thu c, thay th ụ ứ ụ ế ậ ể ố ế kháng th trong c m biể ả ến cũng như điện di mao d n Tuy nhiên, h t nano MIP ẫ ạ không d ễ chế ạ t o Quy trình ch t o h t nano MIP có yêu c u cao v b c c a các ế ạ ạ ầ ề ậ ủ thành ph n liên kầ ết chéo và tương tác mạnh gi a monome và mữ ẫu Phương pháp
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 21 t ng h p ph ổ ợ ổ biến nh t là polyme hóa k t t a, polyme hóa th sấ ế ủ ể ữa kích thước micromet ho c minimet, d ng lõi v hay quá trình polyme hóa các g c t do Mặ ạ ỏ ố ự ặc dù yêu c u ch t o r t ph c tầ ế ạ ấ ứ ạp nhưng ái lực liên k t c a h t nano MIP r t l n, dế ủ ạ ấ ớ ẫn đến độ đặ c hi u cao v i các ch t cệ ớ ấ ần phân tích, đáp ứng được các yêu c u trong ầ các ứng d ng cụ ần độ phân tích chính xác cao
MIP dạng màng được mô t ả đầu tiên vào năm 1995 với ý tưởng mu n k t hố ế ợp giữa công ngh MIP và s c ký l ng hiệ ắ ỏ ệu năng cao (HPLC) Nhóm c a Piletsky ủ là m t trong nhộ ững nhóm đầu tiên ch t o c m bi n màng MIP s d ng các liên ế ạ ả ế ử ụ k t c ng hóa tr phát hi n atrazine bế ộ ị để ệ ằng phương pháp đo độ ẫ d n [19] Màng nano MIP đang được nghiên c u rứ ộng rãi để chế ạ t o các c m bi n sinh hóa v i quy ả ế ớ trình đơn giản và nhanh chóng Phương pháp tiếp c n t lậ ự ắp ráp là phương pháp phổ biến để chế tạo màng nano MIP Màng nano MIP dựa trên phương pháp này có quy trình ch t o ế ạ đơn giản, linh ho t vạ ới các monome đa dạng, có khả năng biến tính trên nhi u lo i nề ạ ền điện cực ứng d ng trong các c m bi n sinh hóa ụ ả ế
Ngày nay MIP dạng màng được phát tri n v i kích c nano trên các d ng thù hình ể ớ ỡ ạ c a carbon d ng h t nano, d ng dây nano và d ng ng nano Các c u trúc MIP này ủ ạ ạ ạ ạ ố ấ có di n tích b m t lệ ề ặ ớn, tăng cường kh ả năng tiếp c n chậ ất phân tích đến các v trí ị nh n d ng H n h p v t li u nano hoậ ạ ỗ ợ ậ ệ ặc nanocomposite cũng được ch t o b ng cách ế ạ ằ ghép t ng l p mừ ớ ỏng MIP trên các hạt nano vô cơ như là carbon nanotubes (CNTs), Graphene (GPH), hạt nano vàng ho c h t nano t ) Các phân t nano này gi lặ ạ ừ ử ữ ại đặc tính vật lý c th c a lõi và kh ụ ể ủ ả năng nhận bi t c a v t o ra các MIP v i tính chế ủ ỏ ạ ớ ất điện h c, quang h c ho c t ọ ọ ặ ừ tính Đây là ưu điểm n i tr i c a công ngh MIP cho s ổ ộ ủ ệ ự phát tri n các phép phân tích ể [20]
Nói chung, tùy thu c vào các ch t c n phân tích khác nhau và các yêu c u v ộ ấ ầ ầ ề độ chính xác mà chúng ta l a chự ọn phương pháp tiếp c n phù hậ ợp để chế t o MIP d ng hạ ạ ạt ho c màng vặ ới các phép đo tương ứng Hi n nay, các nghiên c u vệ ứ ề công ngh MIP ệ vẫn đang được tiến hành để có th tể ối ưu hóa được quy trình ch t o MIP tr ế ạ ở nên đơn giản, ti n lệ ợi và có tính đặc hi u cao ệ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
1.2.3 Nguyên lý đánh dấu phân t ử
Polyme in phân t là m t k thu t t ng h p các chu i polyme mô phử ộ ỹ ậ ổ ợ ỗ ỏng các đầu thu sinh h c, ví d ọ ụ như các kháng thể ho c các enzyme V ặ ề cơ bản, MIP đượ ạ ừc t o t năm thành phần khác nhau: mẫu (ch t) c n phân tích, monome chấ ầ ức năng, thành phần liên k t chéo, thành ph n làm x p và thành ph n kh i tế ầ ố ầ ở ạo Trong đó, hai yế ốu t cu i ố xác định hình thái h c c a polyme Tr hình 1.5 ọ ủ ên trình bày các bước quy trình công ngh ệ chế ạo MIP Đầ t u tiên, phân t mử ẫu (các kháng nguyên ho c ch t phân tích) ặ ấ được kế ợt h p với các monome chức năng là các phân tử ng th i ch a nhóm chđồ ờ ứ ức có kh ả năng tương tác (liên kế ột c ng hóa tr ho c liên k t không c ng hóa tr ) và mị ặ ế ộ ị ột nhóm ch c có ch c có kh ứ ứ ả năng polyme hóa (thường là m t liên kộ ết đôi) Trong bước thứ hai, quá trình polyme hóa được bắt đầu với một lượng l n các phân t liên kết ớ ử chéo ch a ít nh t hai nhóm ch c có kh ứ ấ ứ ả năng polyme hóa Các phân tử liên k t chéo ế này r t c n thiấ ầ ết để ạo ra đượ t c một mạng lưới polyme 3D cứng, giúp duy trì được khuôn in c a m u/ch t c n phân tích vủ ẫ ấ ầ ới đặc tính ch n lọ ọc cao Sau bước tách lo i ạ các phân t mử ẫu, MIP đượ ạc t o ra có kh ả năng nhận bi t mế ột cách đặc hi u d a trên ệ ự hình dạng, kích thước và các v ị trí tương tác chọ ọn l c với phân t m u trong các ử ẫ khuôn in trong m ng polyme ạ
Hình 1.5: Các bước quy trình ch t o c a công ngh polyme in phân t (MIP) ế ạ ủ ệ ử
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Các porogen đóng vai trò lớn trong vi c hình thành các l x p trong m ng ệ ỗ ố ạ polyme[21] Porogen được định nghĩa là bất kỳ ạ ậ h t v t ch t nào có khấ ối lượng, có hình dạng và kích thước đặc trưng để ạ t o ra các l x p trong cỗ ố ấu trúc khuôn đúc Trong công ngh ệ MIP, tương tác hóa học gi a mữ ẫu phân tích và monome đóng vai trò r t quan tr ng trong viấ ọ ệc xác định độ đặ c hi u và tính ch n lệ ọ ọc Trong tương tác này, m u phân tích và các nhóm ch c c a nó s quyẫ ứ ủ ẽ ết định monome chức năng được l a chự ọn Tính đặc hi u cệ ủa khuôn in đượ ạo thành được xác địc t nh ch y u bủ ế ởi độ m nh cạ ủa tương tác giữa monome và m u, nói chung, liên k t càng m nh ái l c càng ẫ ế ạ ự t t Ngoài ra, s ố ố lượng các điểm liên kết giữa mẫu và khuôn in càng nhi u càng t t ề ố
V m t lý thuy t c n ít nhề ặ ế ầ ất ba điểm tương tác để xác định m t c u trúc ba chi u cộ ấ ề ủa phân t m u trong khuôn in Tùy theo loử ẫ ại tương tác hóa h c gi a mọ ữ ẫu và monome chức năng mà MIP được chia làm hai lo i là liên k t c ng hóa tr và liên k t không ạ ế ộ ị ế c ng hóa trộ ị Ngày nay để chế ạo MIP người ta thườ t ng s d ng ba kỹử ụ thu t in phân ậ t khác nhau [17]: ử
C m bi n ph t ng tr ả ế ổ ổ ở điệ n hóa
1.3.1 Lý thuy t mế ạch điện xoay chi u và tr kháng ph c ề ở ứ
T nhừ ững năm 1970, các nhà nghiên cứu điện hóa h c và v t li u bọ ậ ệ ắt đầu khám phá phương pháp phổ t ng tr ổ ở điện hóa (EIS)[22] Đây là một phương pháp hiệu qu ả để nghiên cứu các quá trình động học và các đặc tính liên k t gi a các ch t phân tích ế ữ ấ và điện cực cũng như khảo sát đặc tính điện hóa trên b mề ặt m t cách hi u qu và ộ ệ ả nhạy bén Đây là phương pháp đo lường không phá h y mủ ẫu, không yêu c u các thiầ ết b t ti n và ph c t p, d dàng tri n khai ị đắ ề ứ ạ ễ ể
Theo định lu t Ohm tr ậ ở kháng được định nghĩa là tỉ ệ ữa điệ l gi n áp E và cường độ dòng điện I:
M i quan h này có h n ch là ch có m t thành ph n mố ệ ạ ế ỉ ộ ầ ạch điện là điện tr ở lý tưởng Điện tr ở lý tưởng có vài đặc tính đơn giản:
- Tuân theo định lu t Ohm vậ ới mọi cường độ điện áp và dòng điện
- Giá tr ị điện tr không ph ở ụthuộ ầc t n s ố
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
- Dòng xoay chi u AC và tín hiề ệu điện áp đi qua điện tr ở là đồng pha v i ớ nhau
Tuy nhiên trong th c t , mự ế ạch điện ph c tứ ạp hơn, có nhiều thành ph n ph c, bu c ầ ứ ộ chúng ta ph i b ả ỏ đi khái niệm về điện tr thuở ần Cũng giống như điện tr thu n, ở ầ trở kháng được s dử ụng để đo khả năng mạch điện c n tr ả ở dòng điện, nhưng khác với điện tr , tr kháng không b ở ở ịgiớ ại h n bới các đặc tính đơn giản như trên [22] Giả s r ng chúng ta áp m t xung kích thích hình sin vào mử ằ ộ ạch điện, tín hi u ph n ệ ả hồi thu được s là d ng tín hi u xoay chi u bao gẽ ạ ệ ề ồm t n s kích thích và các hài ầ ố b c cao c a nó Tín hi u xoay chi u này có th ậ ủ ệ ề ể được phân tích như là tổng c a ủ các hàm sóng sin (s d ng phép biử ụ ến đổi Fourier) Hình 1.6 trình bày s l ch pha giự ệ ữa điện áp và dòng đáp ứng khi một điện áp sóng hình sin đượ đặc t vào mộ ế bào điệt t n hóa Dòng đáp ứng cũng được th hiệể n là một sóng hình sin, nhưng nó bị ệ l ch pha so với điện áp được cung c p Chúng ta có th bi u th s lấ ể ể ị ự ệch pha này dướ ại d ng góc pha N u mế ột chu k (360°) c a sóng hình sin m t 1 giây và s dỳ ủ ấ ự ịch chuyển th i gian ờ giữa sóng hình sin hi n tệ ại và điện áp là 0,1 giây, thì góc pha là 36 °
Hình 1.6: S l ch pha giự ệ ữa điện áp và dòng đáp ứng
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 26 Điện áp kích thích được bi u diể ễn dướ ại d ng hàm ph thu c th i gian: ụ ộ ờ
Trong hệ tuyến tính, tín hi u phệ ản hồi có cường dòng I(t) và b dị ịch pha một góc pha :
Trở kháng điện Z( ) được xác định b ng cách l y t l cằ ấ ỷ ệ ủa sóng hình sin điện áp (tính b ng vôn) so v i sóng hình sin dòng (tính bằ ớ ằng ampe) Điều này cho chúng ta độ ớ l n c a tr kháng (tính b ng ohms) ủ ở ằ
Để mô t kháng ph i ch ra c ảtrở ả ỉ ả cường độ, pha, cũng như tần s ố khi mà nó được đo
Ba tham s ố này thường được v ẽtrên m t phặ ẳng Bode, bi u di n trên hể ễ ình 1.7a Trên m t ph ng này, tr kháng phặ ẳ ở ức được bi u di n theo hàm logarite c a t n s theo trể ễ ủ ầ ố ục x và hai giá tr ị trở kháng tuyệt đối và độ ị d ch pha theo tr c y ụ Trụ ầc t n s ố được v ẽ theo hàm logarit vì t n s có th n m trong kho ng t 100 kầ ố ể ằ ả ừ Hz đến 1 mHz tr xu ng, ở ố trở kháng tuyệt đối cũng có thể thay đổi theo h s mộệ ố t tri u ho c nhiệ ặ ều hơn nên nó cũng được v theo logarit M t ph ng Bode bi u diẽ ặ ẳ ể ễn đáp ứng t n s cho phép xác ầ ố định độ ị d ch chuy n pha ng dể ứ ụng trong các lĩnh vực điều khi n t ng và thông tin ể ự độ s Bên cố ạnh đó, kháng trở cũng có th bi u di n trên m t ph ng ể ể ễ ặ ẳ Nyquist (xem hình 1.7b) Trên m t ph ng ặ ẳ Nyquist trở, kháng phức được bi u diể ễn dướ ại d ng vector |Z|, và t n s góc giầ ố ữa vector này và tr x ục là f, trong đó tần s t l ngh ch vớố ỉ ệ ị i tr kháng ở ph c, khi t n s ứ ầ ố tăng trở kháng giảm và ngượ ạc l i Đồ thị Nyquist được s d ng nhi u ử ụ ề trong phân tích và đánh giá trở kháng ph c c a vứ ủ ật li u, t ệ ừ đó nghiên cứu các tính chất điện và điện môi c a vậ ệu đó Nhược điểủ t li m của đồ ị th Nyquist là không quan sát rõ t n s t i tầ ố ạ ừng điểm l y m u ấ ẫ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Hình 1.7: a) Đồ thịBode và b) Nyquist bi u di n tr kháng ph c.đồ thị ể ễ ở ứ [23] Để nghiên cứu các quá trình động h c trong dung dọ ịch, người ta đã gắn các tín hi u ệ điện ph n h i ng v i các các mô hình m ch ả ồ ứ ớ ạ điệ tương đương đển có th d dàng ể ễ phân tích các tính chất và đặc trưng điện và điện môi trên b mề ặt điện cực Mô hình Randles là mô hình đơn giản và ph bi n nh t cho h ổ ế ấ ệ điện c c trong dung d ch, g m ự ị ồ các thành phần: điện tr dung d ch Rở ị S, điện tr truyở ền điện tích RCT hoặc điện tr ở phân c c, t ự ụ điệ ớn l p kép Cdl Mô hình này thường là điểm khởi đầu cho các mô hình ph c tứ ạp hơn Tuy nhiên trong th c t ự ế người ta hay s dử ụng mô hình “half a fuel cell” có thêm thành ph n tr ầ ở kháng Warburg khi xét đến điện tr dung d ch n i ti p coi ở ị ố ế như chỉ là tr kháng c a h ở ủ ệ điện hóa khác, quá trình phân c c x y ra là s kự ả ự ế ợt h p c a c quá trình ki m soát khuủ ả ể ếch tán và động h c h n h p ọ ỗ ợ Trong đó, hai đại lượng
RS và ZW đặc trưng cho các tính chấ ủt c a dung dịch điện phân và s khu ch tán cự ế ủa c p ch t dò Trong khi Cặ ấ dl và RCT ph ụthuộc vào tính chất cách điện và dẫn điệ ại n t b m t ti p xúc giề ặ ế ữa điện c c và chự ất điện phân Giá tr c a hai thành ph n này ph ị ủ ầ ụ thuộc vào s ự thay đổi trên b m t cề ặ ủa điện c c Vì vự ậy, chúng thường đượ ực l a ch n ọ làm tín hi u phát hi n c a c m bi n Trên hình 1.8 trình bày m t s mô hình mệ ệ ủ ả ế ộ ố ạch điện tương đương sử ụ d ng kh p ph t ng tr phân tích tính chớ ổ ổ ở ất điện/điện môi c a ủ điện c c ự
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Hình 1.8: M t s mô hình mộ ố ạch điệ tương đươngn : a) Mô hình Randles dạng đơn gi n; b) Mô hình Randles d ng half a fuel-ả ạ cell.
1.3.2 Nguyên lý hoạt động c a c m bi n ph t ng tr n hóa ủ ả ế ổ ổ ở điệ
Trong c m bi n sinh h c ph t ng tr ả ế ọ ổ ổ ở điện hóa, khi phân t ửchấ ần phân tích tương t c tác v i v t ch t trên b mớ ậ ấ ề ặt điện c c c m bi n, chúng s bám dính hoự ả ế ẽ ặc làm thay đổi tính ch t c a vấ ủ ật chất đó và do đó làm thay đổi tín hi u tr kháng c a c m bi n ệ ở ủ ả ế Tín hi u tr kháng này có th ệ ở ể đo đạc được trong trường h p có s d ng ho c không s ợ ử ụ ặ ử d ng c p ch t ch t dò ferro/ferrit Do v y, c m biụ ặ ấ ấ ậ ả ến EIS được chia làm hai loại: nonfaradic (không s d ng c p ferro/ferrit) và faradic (s d ng cử ụ ặ ử ụ ặp ferro/ferrit) Đối v i lo i c m bi n nonfaradic, ớ ạ ả ế Trở kháng non-faradaic là m t d ng DC c a tr kháng ộ ạ ủ ở mà các tính chất điện được sinh ra bở ụ điệ ới t n l p kép s, ự thay đổ ủi c a tín hi u tr ệ ở kháng do s bám dính c a vự ủ ật ch t trên b mấ ề ặt điện cực ngay trong quá trình đo
Trong khi đó, trở kháng faradaic đượ ạc t o ra khi ph n ng oxi hóa kh ả ứ ử điện hóa xảy ra Ph n ng này s ả ứ ẽ sinh ra các electrons và các electrons được truyền đến b mề ặt điện c c, s ự ự thay đổi giá tr tr ị ở kháng được đo đạc sau quá trình tương tác của v t ậ chấ ầt c n phát hi n v i b mệ ớ ề ặt điện c c ự [24] Do vậy có th ể nói, phương pháp ảc m bi n ph t ng tr EIS là m t trong nhế ổ ổ ở ộ ững phương pháp hiệu qu nh t s d ng xác ả ấ ử ụ định s ự thay đổi trên b mề ặt điện c c ự
Trên hình 1.9 trình bày cơ chếtruyền điện tích c a c m bi n tr kháng ph c d a trên ủ ả ế ở ứ ự công ngh MIP (MIP/EIS) Nguyên lý hoệ ạt động cơ bản c a c m bi n d a trên s ủ ả ế ự ự thay đổi tính chất điện trên b mề ặt điện c c ự Do đó, bất kì s ự thay đổi nào c a ph ủ ổ t ng tr ổ ở đều liên quan đến s thay đổi c a các giá tr b mự ủ ị ề ặt Khi trên b mề ặt điện c c ự được bi n tính b i b t kế ở ấ ỳ một lo i v t li u ho c xạ ậ ệ ặ ảy ra quá trình đặc bi t, do tính chất ệ điện đặc trưng của m i lo i v t li u và ph n ng s ỗ ạ ậ ệ ả ứ ẽ ảnh hưởng đến độ ẫn điệ d n của
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 29 c h ả ệ điện hóa S ự thay đổi này có th ể đánh giá được thông qua phương pháp EIS
D a trên vi c quan sát s ự ệ ự thay đổ ủi c a ph t ng tr trên m t ph ng Nyquist, g m hai ổ ổ ở ặ ẳ ồ thành ph n: ph n bán cung tròn ( vùng t n s ầ ầ ở ầ ố cao liên quan đến quá trình truyền điện tích) và ph n tuy n tính ( vùng t n s ầ ế ở ầ ốthấp liên quan đến hiện tượng khu ch tán ế trong quá trình điện hóa) Chúng ta cũng có thể đánh giá được một cách sơ bộ tính chấ ề ặt điệt b m n cực sau các bước bi n tính Giá tr c a các thành ph n trong ph ế ị ủ ầ ổtrở kháng có th ể được xác định b ng cách ằ khớp theo mô hình mạch tương đương Randles
T ừ các đánh giá thu được, chúng ta có th ể đưa ra các phương án để ể ki m soát và hoàn thiện các bước trong quá trình ch t o c m bi n Thêm nế ạ ả ế ữa, EIS cũng là công cụ phân tích hi u qu ệ ả để xác định sự thay đổi độ ẫn điệ d n và tính chất điện môi của điện cực tương ứng s v i s ự ớ ự tăng lên của nồng độ ch t c n phân tích ấ ầ
Hình 1.9: Cơ chế truyền điện tích c a c m bi n ph t ng tr ủ ả ế ổ ổ ở điện hóa d a trên ự công ngh MIP ệ
Các k ỹ thuậ t phân tích s d ng trong nghiên c u ử ụ ứ
C m bi n c m bi n tr kháng ph c d a trên công ngh MIP ả ế ả ế ở ứ ự ệ thường s dử ụng mô hình mạch điệ tương đương Randles bao gồn m tr kháng dung dở ịch, điện dung l p kép và ớ t ng tr c a quá trình Faraday T ng tr Faraday có th ổ ở ủ ổ ở ể chia thành hai cách tương đương: một điện tr Rở S m c n i ti p v i gi ắ ố ế ớ ả điện dung CS hoặc điện tr ở chuyển điện tích RCT và t ng tr khu ch tán Zổ ở ế W D a vào mô hình ự tương đương, tổng tr ở thu được cho phép phân tích đóng góp của các quá trình điện hóa như khuếch tán, điện tích lớp kép, ph n ả ứng hóa học… vào quá trình điện cực Trong đó, giá trị RCT mô t tính dả ẫn điện gây ra bởi độ ẫ d n kh i c a h ố ủ ệ điện c c ho c quá trình truyự ặ ền điện tích do ph n ả ứng điện c c gây ra; Cự dl mô t vùng phân cả ực tích điện không gian cũng như sự ến bi tính trên b mề ặt điện c c do các quá trình h p ph ho c ph m t lự ấ ụ ặ ủ ộ ớp màng điện môi gây ra; ZW ph n ánh ả ảnh hưởng c a quá trình v n chuy n kh i c a các phân t ủ ậ ể ố ủ ửtích điện lên t ng tr h ổ ở ệ điện hoá Khi th c hi n các bi n tính trên b mự ệ ế ề ặt điện c c, tín ự hi u ph t ng tr s ệ ổ ổ ở ẽ thay đổi do có s ự thay đổ ềi v hình thái h c và các tính chọ ất điện của điện cực dẫn đến các giá tr Cị dl và RCTthay đổi khá l n, troớ ng đó rõ rệt nh t là s ấ ự thay đổ ủa điệi c n tr Rở CT Nồng độ các ch t c n phân tích s ấ ầ ẽ được xác định d a trên ự s ự thay đổ ủi c a delta RCT
1.4 Các k ỹ thu t phân tích s d ng trong nghiên c u ậ ử ụ ứ
1.4.1 Phương pháp quang phổ Raman
Năm 1928, chỉ với các thi t b ế ị đo đạc thô sơ, sử ụ d ng ánh sáng m t tr i làm ngu n ặ ờ ồ kích thích, kính hi n vi làm b h i t ánh sáng tán x , detector là mể ộ ộ ụ ạ ắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hi u ng tán x ánh sáng y u, ệ ứ ạ ế hi u ệ ứng này sau đó được đặt theo tên c a ông là hi u ủ ệ ứng Raman V i hiớ ệu ứng này, Raman đã nhận được giải thưởng №bel vật lý năm 1930[25] Theo thời gian, đã có những bước c i ti n trong các b ph n c a thi t b ả ế ộ ậ ủ ế ị đo đạc Raman Nh ng nghiên cữ ứu đầu tiên được t p trung phát tri n là ngu n sáng kích thích Tậ ể ồ ới năm 1962, với s phát ự minh ra Laser, người ta đã nghiên cứu s d ng mộ ố ạử ụ t s lo i Laser khác nhau để làm ngu n kích thích cho tán x Raman Các loồ ạ ại Laser được ứng d ng ph bi n th i ụ ổ ế ờ đó là: laser Ar+ (351,1-514,5 nm), Kr+ (337,4-676,4 nm) và gần đây nhất là laser r n ắNd-YAG (1.064 nm) V i ngu n kích thích b ng laser Nd-YAG, hiớ ồ ằ ện tượng huỳnh
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 31 quang do các d ch chuyị ển điện t (mà nó có thử ể che ph Raman) s ổ ẽ được lo i tr mạ ừ ột cách đáng kể [26] Tuy nhiên, v n có nhi u h n ch khi n cho quang ph Raman phát ẫ ề ạ ế ế ổ triể tương đốn i ch m Nhậ ững năm 1990, đã có một cu c cách m ng m i trong quang ộ ạ ớ ph Raman Nh s phát tri n c a mổ ờ ự ể ủ ột lo t các b phạ ộ ận như nguồn laser, s ti n b ự ế ộ v công ngh detector, s phát triề ệ ự ển vượ ật b c c a các b l c quang, s c i tiủ ộ ọ ự ả ến đáng k v công ngh ph n mể ề ệ ầ ềm và ng d ng rứ ụ ộng rãi hơn Đặc bi t, v i s phát tri n công ệ ớ ự ể ngh nano, ngoài máy quang ph ệ ổ Raman để bàn với hi u l c phân tích cao, máy ệ ự quang ph Raman c m tay ổ ầ đã ra đời và r t thu n ti n cho vi c phâấ ậ ệ ệ n tích nhanh, đánh giá sơ bộ, kh o sát t i th c a m u c n phân tích ả ạ ự đị ẫ ầ
Trong khi quang ph h ng ngo i d a trên s h p th , ph n x và phát x ánh sáng, ổ ồ ạ ự ự ấ ụ ả ạ ạ thì quang ph Raman d a trên hiổ ự ện tượng tán x Tán x này x y ra do va ch m giạ ạ ả ạ ữa các photon và các phân t Khi chi u mử ế ột chum laser v i t n s ớ ầ ố trên m t phân t ộ ử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E Qua s ự tương tác giữa ánh sáng c a laser và phân t mà l p v ủ ử ớ ỏelectron của các nguyên t trong phân t b bi n ử ử ị ế d ng tu n hoàn và s d n n làm sai l ch v trí c a h t nhân nguyên t trong phân ạ ầ ẽ ẫ đế ệ ị ủ ạ ử t , hay nói cách khác là các nguyên t trong phân t b ử ử ử ị dao động Sự dao động này cần năng lượng l y ra tấ ừ năng lượng c a b c x ủ ứ ạ kích thích ban đầu, nhưng khi dao động đồng thời nó cũng bức x ạ năng ợlư ng tr lở ại, năng lượng b c x có th b ng ứ ạ ể ằ ho c lặ ớn hơn hay nhỏ hơn năng lượng mà b c x kích thích cung c p cho nó H u hứ ạ ấ ầ ết các photon trong s này va chố ạm đàn hồ ới v i phân t ử và không thay đổi năng lượng khi va ch m, các bạ ức x ạ phát ra sau đó được gọi là tán x Rayleigh g m nh ng photon ạ ồ ữ có cùng t n s v i ánh sáng t Mầ ố ớ ới ột lượng r t nh c a photon va chấ ỏ ủ ạm không đàn h i v i các phân t ồ ớ ử và trao đổi năng lượng sau va ch m ạ được g i là tán x Ramanọ ạ
Có 2 lo i tán x Raman là tán x Raman Stokes và tán x Raman anti-Stokes Tán x ạ ạ ạ ạ ạ Raman Stokes sinh ra trong quá trình biến đổ ắt đầ ừ ức năng lượng dao động i b u t m rung cơ bản và k t thúc ế ở mức năng lượng cao hơn, do đó, phân tử tán x hay phát x ạ ạ b c x có t n s nh ứ ạ ầ ố ỏ hơn ( ) Ngượ ạc l i v i tán x ớ ạ Raman Stokes, tán xạRaman Anti-Stokes là hiện tượng phân t ử ởtrạng thái năng lượng kích thích sau đó tán x hay phát x b c x xu ng mạ ạ ứ ạ ố ức năng lượng cơ bản, phân t tán xử ạ có t n s lầ ố ớn
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 32 hơn tần s ốdao động rung cơ bản ( + ) Hình 1.10 mô t n x Rayleigh, tán x ảtá ạ ạ Stokes và anti-Stokes
Hình 1.10: Mô hình lý tưởng c a tán x Rayleigh, tán x Raman Stokes và tán x ủ ạ ạ ạ
Cũng như phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman ta kh o sát s ả ự thay đổi các mức năng lượng trong phân t Quá trìử nh trao đôi năng lượng có th x y ra gi a các ể ả ữ mức năng lượng của điệ ửn t , mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang ph Raman chúng ta ch ổ ỉ khảo sát năng lượng dao động phân t , c ử ụ thể hơn là dao độ ng theo tr c d c c a các liên kế Ởụ ọ ủ t nhiệt độ 300 o k khi có ánh sáng kích thích, kho ng 99% photon tán x Rayleigh Tán x Rayleigh xu t hi n là do ả ạ ạ ấ ệ tương tác của ánh sáng t i nguyên tớ ử Loại tín hi u này tuy là m nh nhệ ạ ất nhưng không s dử ụng được cho mục đích mô tả đặc điểm phân t Ch kho ng 1% ánh sáng t i tử ỉ ả ớ ạo ra tán xạ Raman (tán x ạ do tương tác của ánh sáng v i liên kớ ết trong phân t ) ng v i ử ứ ớ tín hi u c a tán x Stokes và anti-Stokes l có th ệ ủ ạ à ể được ch n làm tín hi u c a quang ọ ệ ủ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 33 ph raman ổ Ở nhiệt độ phòng, phần lớn các phân tử dao động ở trạng thái cơ bản, nên tán xạ anti Stokes ít xuất hiện hơn tán xạ Stokes, do đó tán xạ Stokes có cường độ - mạnh hơn ỷ ệt l cường độ ữ gi a hai v ch này tuân theo phân b Boltzmann m t cách ạ ố ộ gần đúng[28] Vì lý do như vậy nên thường sử dụng tán xạ Stokes để nghiên cứu phổ Raman Tuy nhiên như đã đề cập, ường độc tán x Stockes yếu hơn tán xạ Rayleigh ạ nhiều, đòi hỏi phải có phương pháp đặc biệt để phân bi t các lo i tán x v i nhau ệ ạ ạ ớ Các thi t bế ị như bộ ọ l c kh c b d i, b lấ ỏ ả ộ ọc điều chỉnh được, khe ch n laser, các h ặ ệ thống quang ph k hai ho c ba lổ ế ặ ần được s dử ụng để làm gi m tán x Rayleigh và ả ạ thu nh t các ph Raman chặ ổ ất lượng cao
V i nguyên lý thu tán x Raman là tán x Stokes, m t thi t b phân tích quang ph ớ ạ ạ ộ ế ị ổ Raman hoạt động trên nguyên tắc sau Đầu tiên mẫu phân tích được chi u ánh sáng ế kích thích (đa số là laser) M u phân tíẫ ch sau khi được kích thích b i b c x laser s ở ứ ạ ẽ phát ra ánh sáng tán x Tán x ạ ạ Raman được thu cùng v i các b c x khác qua h ớ ứ ạ ệ kính hiển vi và đưa tấ ảt c các b c x này cùng vào h quang H quang s phân tách ự ạ ệ ệ ẽ và lo i b các b c x t p, ch n lạ ỏ ứ ạ ạ ọ ọc và đưa tín hiệu Raman vào dectector Detector ghi l i các tín hiạ ệu Raman, sau đó thông qua bộphận x lý s u, các tín hi u quang ử ố liệ ệ được biến đổi thành tín hiệu điện t và cho ta ph Raman c a mử ổ ủ ẫu phân tích[29] V i ớ nguyên lý trên có r nhi u công ty, nhi u hãng khác nhau nghiên c u và phát triất ề ề ứ ển thiế ị đo quang phổt b Raman Tuy nhiên dù có c a hãng nào thì m t máy quang ph ủ ộ ổ Raman cũng gồm 5 b phân chính bao g m (xem hình 1.11): ộ ồ
Ngu n kích thích ph Raman ồ ổ (thường là ngu n Laser) ồ
Khố ẫn quang và đầi d u dò
Khố ạo và quét ánh sáng đơn sắi t c
Khối thu nh n tín hi u ậ ệ
Khối điệ ử ộn t : b khuếch đại và thi t b hi n th tín hi u ế ị ể ị ệ
Phương pháp quang phổ Raman có nhiều ưu điểm Phương pháp này không gây phá h y m u Thêm ủ ẫ vào đó, đầu đo cũng không cần ti p xúc tr c ti p v i m u mà s d ng ế ự ế ớ ẫ ử ụ chùm sáng t i và chùm sáng ph n x thu nh n thông tin Vì vớ ả ạ để ậ ậy phương pháp này được xem là phương pháp tối ưu trong trường h p không ti p cợ ế ận được với mẫu Đây
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 34 cũng là phương pháp phân tích nhanh, không yêu c u khâu chu n b m u ph c t p ầ ẩ ị ẫ ứ ạ như các phương pháp khác Điều này giúp ti t kiế ệm đáng kể th i gian th c hi n ờ ự ệ nghiên c u V i m t s ứ ớ ộ ốthiế ị ỗt b h , ph k Raman có th trợ ổ ế ể phân tích được các mẫu mà không c n tách chúng ra khầ ỏi môi trường b o quả ản nên đặc bi t h u ích v i các ệ ữ ớ m u sinh hẫ ọc – nh ng mữ ẫu d b ễ ị ảnh hưởng b i s ở ự thay đổi môi trường Những ưu điểm trên đã giúp cho phổ ế k Raman không nh ng ph bi n trong các phòng thí ữ ổ ế nghiệm mà ngày càng được ứng d ng r ng rãi trong công nghi p, y t , sinh hụ ộ ệ ế ọc…
Hình 1.11: Sơ đồ kh i c a h phân tích Raman ố ủ ệ
1.4.2 Phương pháp quang phổUV VIS-
M t trong nhộ ững phương pháp phân tích quang phổ đượ ức ng d ng r ng rãi b i ụ ộ ở khả năng phân tích định tính và định lượng một cách chính xác đó là phương pháp phân tích phổ h p thấ ụ UV-VIS Cơ sở lý thuy t cế ủa phương pháp dựa trên hiện tượng h p th bấ ụ ức x ạ điện t c a các nguyên tử ủ ử Hiện tượng này có th ể được mô t ả như hình 1.12 Cho một chùm ánh sáng đơn sắc song song có cường độ I0chiếu vuông góc với m t l p môi ộ ớ trường đồng nhất được gi i h n b i 2 m t song song có b dày là ớ ạ ở ặ ề l thì do có sự h p th ấ ụ trong môi trường này cường độ I c a chùm sáng ra khủ ỏi môi trường s b ẽ ịgiảm đi
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Hình 1.12: Cường độ sáng c a chùm sáng giủ ảm khi đi qua môi trường v t ch ậ ất.
Dựa trên cơ sở lý thuy t c a hiế ủ ện tượng h p th b c x ấ ụ ứ ạ điệ ừ ủn t c a vật ch t, có th ấ ể giải thích nguyên lý của phương pháp phân tích quang phổ UV-VIS như sau: Mỗi m t chậ ất đều có s h p thự ấ ụ, và độ ấ h p th khác nhau ph thuộụ ụ c vào b n ch t c a chả ấ ủ ất đó Khi chi u mộế t chùm b c x ứ ạ điệ ừ tác độn t ng lên kh i vố ật ch t thì x y ra s h p ấ ả ự ấ thụ Như vậy đo lượng tia b c x b h p th ta có th ứ ạ ị ấ ụ ể xác định được tính ch t c a vấ ủ ật liệu Ph h p th ng d ng t t nhổ ấ ụ ứ ụ ố ất đố ới v i nh ng nguyên t ho c phân t nh ữ ử ặ ử ỏ Để ả gi i thích và giúp cho việc phân tích định lượng tr nên d dàng, m t s ở ễ ộ ốcác nh đị luật đã được đưa ra giúp cho chúng ta có cái nhìn đơn giản hơn về phương pháp cũng như nguyên lý của phương pháp phân tích phổ ấ h p th ụUV VIS - Trong đó định lu t ậ cơ bản là định lu t Beer Lambert Trong đó địậ – nh lu t Beer nói rằng cường độ ủậ c a m t chùm b c x ộ ứ ạ đơn sắc song song gi m theo c p s nhân v i s ả ấ ố ớ ố lượng phân t hử ấp thụ Nói cách khác, độ ấ h p th t l ụ ỷ ệthuận vớ ồng đội n Với định lu t Lamber tuyên ậ b rố ằng cường độ c a mủ ột chùm b c x ứ ạ đơn s c song song gi m theo c p s nhân khi ắ ả ấ ố nó đi qua một môi trường có độ dày đồng nh t M t s kế ợấ ộ ự t h p c a hai lu t này t o ủ ậ ạ ra lu t Beer-Lambert Ta có th phát biậ ể ểu đinh luật Bia-Lambert như sau: khi chùm ánh sáng được truy n qua mề ột môi trường trong su có ch a dung d ch ch t h p phốt ứ ị ấ ấ ụ, việc giảm cường độ ánh sáng có th x y ra [30] V m t toán h c, nh lu t beer-ể ả ề ặ ọ đị ậ lambert được mô t ả như sau:
Trong đó, A là độ ấ h p th ho c mụ ặ ật độ quang l là chiều dài đường đi của b c x qua m u (cm) ứ ạ ẫ
C là nồng độchất tan trong dung d ch (mol/L) ị Ɛ là h ng s t lằ ố ỉ ệ ộ, đ h p th quang riêng tính theo L/mol*cm H ng s này không ấ ụ ằ ố thể được tính toán trên giấy, nó được đo bằng th c nghi m ự ệ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
T công ừ thức trên ta th y s ph ấ ự ụthuộc c a mủ ật độ quang (A) vào nồng độ dung d ch (C) ph ị là ụthuộc tuyến tính Nhưng thự ế điềc t u này ch ỉ đúng khi dung dịch có nồng độ ấ r t nh (pha loãng) Khi nỏ ồng độ ủ c a dung dịch tăng, khoảng cách giữa các phân t ửgiảm, tương tác gi a các phân t mữ ử ạnh và khi đó kết qu ả đo đượ ẽc s có nhiều sai l ch so vệ ới định lu ật. Để có th s dể ử ụng phương pháp quang phổ UV-VIS để xác định định lượng thì có nhi u cách M t trong nh ng cách chính xác nhề ộ ữ ất đó là xây dựng đường chu n Vẩ ới h ng s t l ằ ố ỷ ệ (Ɛ) và chiều dài đường đi bức x ạ là không đổi nên độ ấ h p th s ph ụ ẽ ụ thuộc vào nồng độ theo m t hàm b c nh t Hình 1.13 mô t ộ ậ ấ ả cách xác định nồng độ c a ch t phân tích dủ ấ ựa trên đương chuẩn B ng cách chu n b m t dãy dung d ch chằ ẩ ị ộ ị ất chuẩn có nồng độ tăng ầd n và biết chính xác trước C1, C2, C3… (thường là 5−7 nồng độ Sau đó nghiên cứ) u chọn điều ki n phù hệ ợp nhất đo phổ c a các m u chu n và ủ ẫ ẩ mẫu phân tích như các thông số ề v thời gian, môi trường, loại cuvet… Sau khi đo độ h p th quang c a t ng nấ ụ ủ ừ ồng độ ủ c a dung d ch chu n ta s dị ẩ ẽ ựng được đường đặc trưng chuẩn th hi n m i liên h gi a nể ệ ố ệ ữ ồng độ và độ ấ h p th ụ Sau đó cần chu n b ẩ ị chấ ần xác địt c nh nồng độ trong cùng điều kiện phân tích như dãy dung dịch chu n ẩ (độ pH, nhiệt độ, dung môi) S au đó đo độ ấ h p th quang c a dung d ch ch t c n xác ụ ủ ị ấ ầ định nồng độ (gi s là Aả ử x), rồi áp vào đường chu n ta s có nẩ ẽ ồng độ Cxtương ứng v i nớ ồng độchấ ần xác địt c nh
Hình 1.13: Cách xác định nồng độ ủ c a ch t phân tích dấ ựa trên đồ ị th chu n A- và ẩ C
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Thiết bị phân tích UV-VIS cơ bản gồm có 4 thành phần cơ bản bao gồm: nguồn sáng, hệ tán sắc và mẫu phân tích và detector Hình 1.14 thể hiện mô hình phân tích của hệ
THỰ C NGHI M 42 Ệ
Hóa ch t và thi t b ấ ế ị
Hóa ch t s d ng bao g m axit Axetic (ấ ử ụ ồ 100% ), №rfloxacin, axit Tetrachloroauric ( ) được cung c p b i hãng Sigma Các hóa ch t s dấ ở ấ ử ụng đều độ tinh khiết cao (trên 96%), đạt đến mức độ dùng phân tích mà không c n ph i tinh ầ ả chế thêm Hóa chất được pha trong nước deion có điện tr su t lở ấ ớn hơn 18 Mcm Dung dịch đệm phosphate-buffered saline (PBS) được pha t các mu i kali phosphate ừ ố và natri clorua trong nước deion sao cho nồng độ đạt 100 mM và chuẩn độ pH Dung d ch mu i Kị ố 4Fe(CN)6 và K3Fe(CN)6 được pha trong dung môi KCl 0,1 M sao cho đạt nồng độ 5 mM được s dử ụng cho phép đo phổ ổ t ng tr ở điện hóa Kháng sinh Norfloxacin được th nghi m pha loãng với các dung môi khác nhau như ethanol ử ệ (C2H5OH), axit Clohydric (HCl), PBS 100 mM (pH 2,2) Tuy nhiên k t qu cho thế ả ấy các ch t trên không hòa ấ tan hoàn toàn Norfloxacin Norfloxacin được pha trong axit axetic (100%), tuy nhiên nồng độ quá cao đã ảnh hưởng đến quá trình t o màng ạ polyme trên điện c c Cuự ối cùng, chúng tôi đã pha Norfloxacin đến các nồng độ ầ c n đo trong axit axetic 1% Sau mỗi bước thí nghiệm điện cực luôn được r a b ng ử ằ ethanol và nước c t 2 l n ấ ầ Điện c c dùng ch t o c m biự ế ạ ả ến là điện c c ch t o theo công ngh ự ế ạ ệ in lưới màng dày c a hãng BioDevice Technology, Nh t B n C u trúc củ ậ ả ấ ủa chíp điện c c này bao gồm ự
3 điện c c tích hự ợp trên đế nhựa: điện c c làm viự ệc và điện cực đối (s d ng m c in ử ụ ự các bon) và điện c c chu n (m c in Ag/AgCl) Di n tích b m t cự ẩ ự ệ ề ặ ủa điện c c làm ự việc là 2,64 mm 2 Trên hình 2.1 trình bày h nh nh cỉ ả ủa chíp điện c c m c in các bon ự ự (SPCE) dùng ch t o c m bi n MIP/EIS ế ạ ả ế
T t các thí nghiấ ệm điện hóa được ti n hành trên thi t b ế ế ị phân tích điện hóa c a hãng ủ Vertex Ivium Technologies, Hà Lan (xem hình 2.1) Thi t b ế ị này được k t n i vế ố ới máy tính cá nhân và các ch ế độ đo được điều khi n b ng ph n mể ằ ầ ềm Ivium software đi kèm của hãng
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Hình 2.1: C u trúc cấ ủa chíp điện c c SPCE và h ự ệthiế ị phân tích điệt b n hóa s ử d ng trong nghiên c u ụ ứ
Trong nghiên c u này, bên c nh vi c s d ng h ứ ạ ệ ử ụ ệ phân tích điện hóa để nghiên cứu khảo sát hoạt động c a c m biủ ả ến xác định kháng sinh №rfloxacin chúng tôi còn s ử d ng h quang ph Raman, h ụ ệ ổ ệ đo quang phổ UV VIS- và s c ký l ng hiắ ỏ ệu năng cao (HPLC) như mộ ỹt k thu t kiểm đối đánh giá độậ nhạy, độ ch n lọ ọc và độ ặ ạ ủ l p l i c a c m bi n do chúng tôi ch t o Trên hình 2.2 mô t hình ả ế ế ạ ả ảnh c a h quang ph Raman, ủ ệ ổ quang ph ổUV-VIS và h s c ký l ng hiệ ắ ỏ ệu năng cao HPLC
Chúng tôi s dử ụng phương pháp quang phổ Raman để nghiên c u quy trình ch t o ứ ế ạ c m bi n Chúng tôi tiả ế ến hành đo quang phổ Raman trên máy đo Renishaw inVia Raman (bước sóng 633 nm) trong d i ph t ả ổ ừ 200 đến 2200 cm -1 , thời gian đo 30 giây v i công suớ ất laser là 7,5 mW trên điện c c cảm bi n sau mự ế ỗi bước ch t o nh m xác ế ạ ằ định s có m t c a các ch t/h p ch t T đó có đánh giá sơ bộ vềự ặ ủ ấ ợ ấ ừ kh ả năng chế ạ t o đầu thu MIP
Phép đo quang ph ổ UV VIS - là phương pháp phân tích định lượng d a vào hi u ng ự ệ ứ h p th x y ra khi phân t v t chấ ụ ả ử ậ ất tương tác vớ ứi b c x ạ điệ ừn t Vùng b c x ứ ạ được s dử ụng trong phương pháp này là vùng tử ngo i gạ ần hay kh n ng vảkiế ứ ới bước sóng kho ng t 200÷800 nm Phéả ừ p đo được ứng dụng xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược ph m viên nén ẩ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Với phương pháp sắc ký l ng hiỏ ệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là ch t lấ ỏng và pha tĩnh chứa trong c t là ch t r n ho c m t chộ ấ ắ ặ ộ ất l ng ph lên mỏ ủ ột ch t mang r n, hay mấ ắ ột chất mang đã được biến đổi b ng liên kằ ết hóa h c v i các nhóm ch c họ ớ ứ ữu cơ Chúng tôi đã sử ụng phép đo này phân tích d kháng sinh Norfloxacin trong nước h nuôi cá B p l y t i tr i nuôi Tuy Hòa, Phú ồ ớ ấ ạ ạ ở Yên H HPLC bao g m haệ ồ i máy bơm mô đun, model 1525, mộ- t kim phun th công ủ (Breeze 7725i, Rheodyne) và detector UV-VIS (Waters 2487) ở 277nm Các phân tích được th c hi n trên c t Eclipse Plus Zorbax C18 Agilent (150 mm x 4,6 mm i.d., ự ệ ộ kớch thước h t nh i trong cạ ồ ột 3 àm) dướ ạ g pha tĩnh Pha đội d n ng là h n h p dung ỗ ợ d ch axit axetic 5% và methanol (theo t l ị ỷ ệthể tích 80:20)
Hình 2.2: a) H quang ph Raman, b) h quang ph ệ ổ ệ ổUV-VIS và c) h s c ký l ng ệ ắ ỏ hiệu năng cao (HPLC)
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
2.2 Quy trình công ngh ệ ch ế ạ t o c ả m bi n NOR-MIP/EIS phá ế t hi n ệ kháng sinh №rfloxacin
Trên hình 2.3 trình bày toàn b quy trình công ngh ộ ệ chế ạ t o c m bi n ả ế NOR- MIP/EIS trên điện c c SPCE nhự ằm xác định phân tích dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước h nuôi th y sản và hàm lượng kháng sinh trong dượồ ủ c ph m ẩ Quy trình bao g m 06 ồ bước như sau:
Bước 1: T ng h p hổ ợ ạt nano vàng trên điện c c SPCE ự
Trong công ngh ệchế ạ t o c m bi n sinh h c, h t nano vàng(AuNPs) ả ế ọ ạ đã được nghiên c u và s d ng nhiứ ử ụ ều để ả c i thiện độ nhạy c a c m biủ ả ến do chúng có đặc tính dẫn điện t t, là ố chất xúc tác xúc tác trong các phản ứng điện hóa và tăng cường v n chuyậ ển điện t t b mử ừ ề ặt điện c c tự ới đế V i nh ng tính chớ ữ ất và ưu điểm trên c a AuNPs, phòng thí nghi m Biosensor thu c b môn V t liủ ệ ộ ộ ậ ệu điện t , Vi n V t lý k ử ệ ậ ỹ thuật, ĐH Bách Khoa HN đã nghiên c u và bi n tính thành ứ ế công b mề ặt điện c c in cacbon b ng m t l p mự ằ ộ ớ ỏng AuNPs theo phương pháp điện hóa kh Au t h p ch t HAuClử ừ ợ ấ 4[32] Lớp AuNPs s ẽ làm tăng diện tích hiệu d ng b mụ ề ặt điện c c c m biự ả ến do đó làm tăng số lượng phân t ử in được vào mạng polyme Hơn nữ ốc độa t m c c a màng polyme MIP ph ọ ủ ụ thuộc m nh vào ạ đế Với đế AuNPs/SPCE cho k t qu s lưế ả ố ợng đầu thu MIP cao hơn so với đế kim lo i K t qu ạ ế ả này được phân tích k trong bài báo khoa h c c a nhóm nghiên ỹ ọ ủ c u Bên cứ ạnh đó nhóm nghiên cứu cũng đã đưa ra được nhận định v ề ảnh hưởng của kích thước và mật độ AuNPs trên điện cực SPCE đến độ nhạy c a c m biủ ả ến MIP/EIS Để ổ t ng h p h nano vàng (AuNPs) ợ ạt trên điện c c làm vi c c a chip SPCE, chúng ự ệ ủ tụi đó sử ụng phương phỏp điệ d n húa quột th tuế ần hoàn điện c c trong 35 àL dung ự d ch HAuClị 4 nồng độ 100 àM pha trong PBS 100 mM (pH 7,4) trong d i th t -0,6 ả ế ừ
V đến 0,5 V vs Ag/AgCl v i s vònớ ố g quét là 20 Đây chính là điều ki n t ng h p tệ ổ ợ ối ưu đã được nhóm chúng tôi đúc kế ừt t các nghiên cứu trước [32] Hình 2.4 thể ệ hi n đường đặc trưng dòng- th c a quá trình t ng hợế ủ ổ p hạt nano vàng trên điện c c in các ự bon V i vi c quét th ớ ệ ế tuần hoàn đi qua đỉnh kh c a vàng (-0,45 V vs Ag/AgCl), ử ủ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 46 ion vàng Au 3+ trong HAuCl4 đã được kh kh i h p ch t thành Auử ỏ ợ ấ 0 lắng động trên b ề mặt điện c c bằng phương pháp điện hóa h t vàng ự ạ được phân tán t t trên b mố ề ặt điện c c vự ới kho ng cách phù h p cho s hình thành cả ợ ự ủa đầu thu NOR-MIP ở bước ti p ế theo
Hình 2.4: Đặc trưng dòng-th trong quá trình t ng h p h t nano vàng: dế ổ ợ ạ ải điện áp t -0ừ ,6 V đến 0,5 V, tốc độ quét 50 mV/s, trong 20 vòng Để làm sạch điện cực cũng như khử ớt oxít vàng, điệ b n cực được ti p t c quét th ế ụ ế tuần hoàn trong dung d ch Hị 2SO4 1 M v i dớ ải điện áp t -ừ 0,2 V đến 1,4 V vs Ag/AgCl v i s vòng quét là 5 vòng Trên hình ớ ố 2.5 trình bày đặc trưng đáp ứng dòng-thế ủa c điện c c AuNPs-ự SPCE trong môi trường axít H2SO4 Trên đặc trưng dòng ế ạ-th t i vòng quét đầu tiên quan sát được đỉnh oxy hóa tại điện áp 1,2 V vs Ag/AgCl cho thấy s có m t c a oxít vàng Nhi u nghiên c u ự ặ ủ ề ứ [33],[34], [35],[36] đã chỉ ra r ng ằ quá trình t ng h p hổ ợ ạt vàng theo phương pháp điện hóa k trên bên c nh h t vàng ể ạ ạ còn xu t hi n mấ ệ ộ ố ạt oxít vàng được hình thành theo cơ chế ất s h h p thụ khá ph c t p ứ ạ c a các ion OHủ - trên các mặt tinh th khác nhau Trong quá trình kh xu t hiể ử ấ ện đỉnh khử ại điện áp 0,7 V vs Ag/AgCl tương ứ t ng v i s ớ ự khử các oxít Au các vòng Ở quét ti p theo cho thế ấy cường độ píc oxy hóa và píc kh u gi m dử đề ả ần Điều này
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 47 chứng t ỏ đã k ửh được m t s ộ ố lượng nhất định oxít Au Sau đó, điện cực đượ ửa c r bằng nước c t hai l n và làm khô b ng khí Nấ ầ ằ 2
Hình 2.5: Đáp ứng dòng th c a quá trình quét th tu– ế ủ ế ần hoàn điện c c AuNPs-ự
SPCE trong dung d ch Hị 2 SO 4 1M (5 vòng quét, tốc độ 50 mV/s)
Bước 2: Tạo màng đơn lớp t l p ghép (SAM) c a monomer p-ự ắ ủ ATP trên điện c cự AuNPs-SPCE
Monomer p-ATP được hòa tan trong dung môi ethanol để đạt được nồng độ 50 mM Ngâm điện c c AuNPs-SPCE trong dung dịch này và để qua đêm trong buồự ng t i ố ở nhiệt độ phòng (kho ng 15 ti ng) Trong th i gian này, mả ế ờ ột đơn lớp phân t p-ATP ử s ẽ được hình thành trên b mề ặt điện c c do s t l p ráp c a các phân t p-ATP lên ự ự ự ắ ủ ử trên b m t c a AuNPs thông qua liên k t c a nguyên t ề ặ ủ ế ủ ử lưu huỳnh trong nhóm thiol –SH c a phân t p-ATP v i h t vàng K t qu trên b mủ ử ớ ạ ế ả ề ặt điện c c xu t hi n mự ấ ệ ộ ớt l p màng SAM có nhóm –NH2 hướng ra ngoài Nhóm -NH2 v i kh ớ ả năng tương thích sinh học cao, t o d t o liên kạ ễ ạ ế ột c ng hóa tr v -COOH và ị ới đóng vai trò là đích oxy hóa để ạ t o mạch chính cũng như là liên kết chéo trong quá trình trùng h p polyme ợ Hơn nữa, màng SAM hình thành t các phân t p-ừ ử ATP có độ ổn định và tính dẫn điện tốt hơn so với các ng phân khác cđồ ủa aniline như o-ATP và m-ATP
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Bước 3: G n các phân t ắ ử Norfoxacin lên điện c c SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE ự
Norfloxacin được phân tán đều trong dung dịch acid acetic 1% (được pha trong dung dịch đệm PBS 100mM) Nhỏ 35 L dung d ch này ph kín b mμ ị ủ ề ặt điện c c và ự tiến hành áp th ế tĩnh với điện áp -0,6 V vs Ag/AgCl trong 600 s Trong bước này, các nhóm ch c amin trong phân t ứ ử Norfloxacin bị proton hóa và kéo l i gạ ần b mặt ề điện c c và liên k t vớ ớự ế i l p màng SAM (p-ATP) b ng lằ ực hút tĩnh điện bởi điện th ế âm không đổi
Bước 4: Trùng h p polyme in phân t №rfloxacin vào m ng t o polyme-ợ ử ạ ạ MIP
Dung dịch s d ng trùng h p polyme bao g m monome p-ATP 10 mM, ử ụ ợ ồ Norfloxacin 2,5 mM trong dung dịch đệm PBS 100 mM 35 L dung d ịch này được nh ỏlên điện c c ự thu được ở bước 3 và ti n hành quét th ế ếtuần hoàn trong dải điện áp t -0,2 ừ V đến +0,6 V Ag/AgCl vvs ớ ốc đội t quét là 50 mV/s v i s vòng quét khác ớ ố nhau Tùy theo s vòng quét mà b dày c a màng polyme-ố ề ủ MIP thay đổi Màng polyme được hình thành thông qua liên k t polyme liên h p c a c p electron cế ợ ủ ặ ủa nguyên t ử nitơ của phân t p-ATP, t o thành chu i poly(aminothiophenol) có cử ạ ỗ ấu trúc xen k ẽgiữa vòng phenyl và nhóm ch c ch a gứ ứ ốc nito Trong môi trường có độ pH là 6,6, các nguyên t N s b proton hóa m t mử ẽ ị ở ộ ức độ nhất định t o ra các h t ạ ạ mang điện hình thành trong ma tr n polyme giúp cho màng polyme-MIP có tính d n ậ ẫ điện Trong quá trình trùng h p, các phân t №rfloxacin s liên kợ ử ẽ ết với các phân t ử p-ATP trong chu i polyme thông qua liên k t hidro gi a nguyên t O/N v i nguyên ỗ ế ữ ử ớ t H thông qua các liên k t: (1) liên kử ế ết đầu tiên giữa nguyên t O cử ủa Norfloxacin v i H c a nhóm NH c a p-ATP, ớ ủ ủ (2) liên k t ế giữa nguyên t H c a nhóm OH vử ủ ới nguyên t N c a p-ATP, ử ủ (3) liên kết giữa N của Norfloxacin v i H c a p-ATP và ớ ủ (4) cuối cùng liên k t nhóm CHế 3 c a №rfloxacin v i NHủ ớ 2 c a p-ủ ATP Sau đó điện cực đượ ử ạc r a s ch bằng ethanol, nước c t hai lấ ần và được làm khô bằng dòng khí N2 Để ả c i thiện độ nh y c a c m bi n chúng tôi s dạ ủ ả ế ử ụng phương pháp pha tạp h t nano ạ vàng vào m ng polyme ạ Cho đến nay đã có mộ ốt s công trình khoa h c nghiên cọ ứu v s kề ự ế ợt h p gi a AuNPs và công ngh MIP trong vi c ch t o c m bi n sinh h cữ ệ ệ ế ạ ả ế ọ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
So v i m t s kim lo i quý khác thì AuNPs có nhiớ ộ ố ạ ều đặc tính h p d n n i trấ ẫ ổ ội hơn như [20]:
- Tính tương thích sinh học và trơ hóa học.
- Tương đố ễ ải d s n xu t và bi n tính thông qua các liên k t thiol ấ ế ế
- Năng lượng b m t l n cung c p n n t ng ề ặ ớ ấ ề ả ổn định
- Tính ch t quang hấ ọc đáng chú ý do sự dao động của các điệ ử ẫn điện t d n của v t li u ậ ệ
- Khả năng truyền điệ ửn t
Quy trình phân tích dư lượng và hàm lượng kháng sinh №rfloxacin
2.3.1 Phân tích dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước h nuôi th y s n ồ ủ ả
Chúng tôi ti n hành nghiên cế ứu xác định dư lượng kháng sinh trong nước nuôi trồng th y sủ ản Để có được mẫu nước h nuôi cá Bồ ớp, chúng tôi đã tiến hành liên lạc v i trang tr i s n xu t th y s n gi ng Phú Yên Sau khi liên hớ ạ ả ấ ủ ả ố ở ệ, chúng tôi được cung c p chi ti t v s các kháng sinh và th i gian s d ng t ng lo i kháng sinh cho ấ ế ề ố ờ ử ụ ừ ạ h nuôi Mồ ẫu nước được thu th p ng u nhiên t i 5 v trí c a h nuôi cá Bậ ẫ ạ ị ủ ồ ớp đang trong giai đoạn sinh trưởng Hình 2.6 th hi n hình nh c a trang tr i s n xu t thể ệ ả ủ ạ ả ấ ủy s n Lả ợi Anh và nh ng ữ loại kháng sinh s d ng cho cá B p bao gđã ử ụ ớ ồm Oxyteta và Cefotaxime, cũng như hóa chấ ử lý nước như Clorin và men vi sinh Chúng tôi sẽt x tiến hành phân tích để xác định hàm lượng kháng sinh №rfloxacin trong mẫu nước bằng 2 phương pháp: cảm bi n NOR-MIP/EIS do chúng tôi ch t o ế ế ạ và phương pháp s c ký l ng hiắ ỏ ệu năng cao (HPLC)
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
Hình 2.6: Trang tr i th y s n Phú Yên và mạ ủ ả ở ẫu nước nuôi cá B p c a trang tr ớ ủ ại.
Quy trình phân tích được th hiể ện trong hình 2.7 Đầu tiên chúng tôi x lý mẫu nước ử c a h nuôi cá Bủ ồ ớp Nước h nuôi c a trang trồ ủ ại được b o qu n l nh v i nhiả ả ạ ớ ệt độ 4 o C Nước được đổ vào bình định mức để ắ l ng h t phế ần đục, chúng tôi lấy 70% lượng nướ ởc ph n trên cầ ủa bình Sau đó chúng tôi tiến hành phân tích điện hóa Để phân tích chúng tôi pha nước trong h n h p c a axit axetic (10%) v i t l 9:1 và rung siêu ỗ ợ ủ ớ ỷ ệ âm trong 5 phút để có th hòa tan toàn b kháng sinh NOR trong h n hể ộ ỗ ợp nước Sau đó nước c a h ủ ồ nuôi được ti n hành phân tích c m biế ả ến đã chế ạo theo phương pháp t
2 (tr n hộ ạt keo vàng kớch thước 10 nm vào dung dịch polyme) Đầu tiờn 2 àL mẫu nước đã qua xử lý được nh lên c m biỏ ả ến và để trong 15 phút Sau khi r a s ch, cử ạ ảm biến được phân tích điện hóa Giá tr ị điện tr ởtruyền điện tích được l y làm giá tr ấ ị đầu ra c a c m bi n Giá tr ủ ả ế ị điện tr yở tru ền điện tích được so sánh với đường chuẩn đã được xác định, t ừ đó tìm ra được dư lượng kháng sinh trong mẫu Để ể ki m ch ng ứ khả năng phân tích kháng sinh trong điều ki n mệ ẫu nước có kháng sinh, chúng tôi tiến
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 53 hành thêm kháng sinh chuẩn vào nước h nuôi và ồ tiến hành phân tích như trên Kết qu cho th y c m biả ấ ả ến có độ thu hồi cao (> 95%) Để ể ki m chứng độ ặ ạ l p l i, chúng tôi ti n hành phân tích 3 mế ẫu nước cũng được chu n b ẩ ị như trên và tiến hành đo nồng độ tương tự như mẫu đã phân tích
Song song v i phân tícớ h điện hóa, mẫu nước cũng được phân tích bằng phương pháp s c ký l ng hiắ ỏ ệu năng cao Để xác định dư lượng kháng sinh trong nước h nuôi, ồ chúng tôi c n xây dầ ựng đường chuẩn xác định m u chu n kháng sinh №rfloxacin ẫ ẩ Kháng sinh Norfloxacin (NOR) được mua t Sigma vừ ới độ ạch 98% đượ ử ụ s c s d ng để xây dựng đường chuẩn Đầu tiên 12,5 mg kháng sinh NOR được cân chính xác và pha trong bình định m c 25 mL Dung môi s d ng là h n h p dung d ch axit acetic ứ ử ụ ỗ ợ ị (CH3COOH 5%) và methanol theo tỉ lệ 4:1 H n hỗ ợp được rung siêu âm trong 30 phút để làm tan hoàn toàn kháng sinh trong h n h p Dung d ch chuỗ ợ ị ẩn thu được có nồng độ 500 àg/mL Để ến hành đo, dung dị ti ch chuẩn được pha loóng (trong nước tinh khi t) xu ng các nế ố ồng độ ầ c n thiết trong bình định mức 10 mL Trước khi được tiờm vào h ệ thống HPLC, dung dịch đượ ọc l c qua màng l c 0,45 àm 10 mL mọ ẫu chuẩn đã được tiêm vào h ệthống HPLC Sau đó mẫu được bơm vào pha rắn v i th i ớ ờ gian bơm là 10 phút mỗi phút 1,0 mL T t c ấ ả các phân tích được th c hi n nhiự ệ ở ệt độ phòng K t qu ế ả được thu th p và x lý b i ph n m m n i bậ ử ở ầ ề ộ ộ (Empower, Waters, Milford, MA, USA) Kết qu ả thu được bao gồm đỉnh t i thạ ời gian lưu của kháng sinh Norfloxacin và diện tích đỉnh đó được ghi l i Biạ ểu đồ đường chu n (nẩ ồng độ so với diện tích đỉnh t i thạ ời gian lưu) được xây d ng sáu m c nự ở ứ ồng độ (10, 20, 30, 50,
100, 150, 200 ng/mL) Độ ốc và độ d tuy n tính c a ế ủ đường đặc trưng chuẩ đã đượn c ghi l Sau khi dại ựng đường chu n cẩ ủa phương pháp HPLC, chúng tôi xác định hàm lượng c a NOR trong mủ ẫu nước h nuôi cá B p Saồ ớ u khi để ắ l ng l y phấ ần trong như đã mô tả ở trên Mẫu nước h ồ nuôi được pha loãng trong h n h p axit acetic 5% và ỗ ợ methanol v i t l 4:1 Mớ ỷ ệ ẫu nước được đong trong bình định mức 10 mL Để tiêm được vào h th ng HPLC mẫu nước đó đượ ọệ ố c l c qua màng l c 0,45 àmọ Để phõn tích, mẫu được bơm vào pha rắn v i th i gian 10 phút m i phút 1 mL Sau khi thu ớ ờ ỗ được k t qu , chúng tôi ti n hành thêm m u chu n vào mẫu nướế ả ế ẫ ẩ c c a h trong bình ủ ồ
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 54 định m c 10 mL sao cho nồng độ thêm vào là 20, 40, 60 ppb K t qu ứ ế ả được so sánh với đường chuẩn đã xây dựng ở trên để tính độ thu h ồi.
Hình 2.7: Quy trình phân tích xác định hàm lượng kháng sinh №rfloxacin c a m u ủ ẫ nước h nuôi th y sồ ủ ản theo 2 phương pháp EIS và HPLC
2.3.2 Phân tích hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược ph m ẩ
Ngoài phân tích dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước nuôi thủy sản, chúng tôi phân tích hàm lượng kháng sinh trong Norfloxacin trong dược phẩm Thuốc kháng sinh №rfloxacin 400 mg được nhập khẩu từ công ty KHAPHARCO PHARM.CO có thành phần bao gồm 400 mg kháng sinh Norfloxacin và tá dược Thuốc kháng sinh này chỉ điều trị nhiễm khuẩn và sẽ không dùng cho điều trị nhiễm virus (ví dụ như
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 55 cảm lạnh thông thường hoặc cúm) Đây là một loại kháng sinh phổ biến và bán khá nhiều trên thị trường Chúng ta có thể dễ dàng mua được chúng từ hiệu thuốc mà không cần chỉ định của bác sĩ Chúng tôi sẽ xác định hàm lượng của kháng sinh Norfloxacin trong thuốc theo hai phương pháp: sử dụng phương pháp quang phổ UV- VIS và cảm biến NOR-MIP/EIS
Hình 2.8: Kháng sinh №rfloxacin 400 mg
Quy trình phân tích được thể hiện trong hình 2.9 Để phân tích thuốc cần được xử lý Sau khi mua được kháng sinh dưới dạng viên nén chúng tôi tiến hành nghiền nhỏ viên thuốc thành dạng bột bằng cách sử dụng cối nghiền Hỗn hợp thu được được trộn đồng nhất và được hòa tan trong 20 mL dung dịch axit acetic để thu được hồn hợp của thuốc và axit acetic 1% Hỗn hợp được rung siêu âm trong 20 phút để hòa tan toàn bộ kháng sinh Norfloxacin Sau đó hỗn hợp được lọc qua màng lọc kích thước 0,45 àm Cuối cựng hỗn hợp được đem quay ly tõm với tốc độ 6000 rpm trong
5 phỳt Sau đú chỳng thụi pha loóng hỗn hợp dung dịch 20.000 lần (20 àg/mL), 40.000 lần (10 àg/mL), 200.000 lần (2 àg/mL) để tiến hành phõn tớch UV-VIS và pha loãng xuống 400.000.000 lần (1 ng/mL) để phân tích điện hóa
Sau khi được pha loãng lần lượt từng nồng độ, thuốc được đem phân tích bằng cách nhỏ 2 àL dung dịch lờn cảm biến điện húa NOR MIP được chế tạo theo phương phỏp - như đã được mô tả ở trên Sau 15 phút cảm biến được rửa sạch bằng nước cất 2 lần và sấy khô và được phân tích điện hóa Giá trị điện trở truyền điện tích chênh lệch
Nghiên c u ch t o c m bi ứ ế ạ ả ến MIP/EIS xác định dư lượng kháng sinh №rfloxacin
NGUYỄN QU C H O Ố Ả 56 giữa trước và sau khi nhỏ dung dịch kháng sinh ΔRCT được ghi lại So sánh giá trị trên vào giá trị đường chuẩn đã thu được chúng tôi thu được giá trị nồng độ đã phát hiện được Để phân tích hàm lượng kháng sinh trong dược phẩm bằng phương pháp UV-VIS, chúng tôi cần xây dựng đường chuẩn để xác định nồng độ của mẫu chuẩn kháng sinh NOR Mẫu chuẩn NOR (98%) được cân và pha loãng trong acid acetic 1% để đạt được nồng độ 10 mg/mL Sau đó mẫu được pha loãng thành nhiều mẫu mỗi mẫu có nồng độ xỏc định từ 1àg/mL đến 40 àg/mL Đường đặc trưng chuẩn được xõy dựng theo sự phụ thuộc của nồng độ và diện tích của đỉnh lớn nhất Chúng tôi phân tích với dải bước sóng từ 200 đến 400 nm do kháng sinh Norfloxacin thuộc họ quinolone có đặc tính hấp thụ mạnh trong tia cực tím [37] Đầu tiên 3 mL của axit actetic 1 % được chọn đo và chọn giá trị đo được của 3 mL trên làm nền Sau đó, 3 mL của nồng độ mẫu chuẩn được cho vào cuvet và phân tích Sau khi phân tích dải nồng độ từ 1 àg/mL đến 40 àg/mL, giỏ trị diện tớch của đỉnh lớn nhất trờn từng nồng độ được ghi lại Chúng tôi tiến hành phân tích mỗi nồng độ 3 lần và lấy giá trị trung bình của đỉnh lớn nhất Đường chuẩn của phương pháp được xây dựng dựa trên sự thay đổi của giá trị trung bình diện tích của đỉnh đặc trưng lớn nhất theo từng nồng độ Để phân tích mẫu thuốc chỳng tụi pha loóng mẫu thuốc xuống 20.000 lần (20 àg/mL) 40.000 lần
(10 àg/mL) 200.000 lần (2 àg/mL) Chỳng tụi tiến hành phõn tớch kết quả ở 3 nồng độ trên 3 lần và thu được kết quả có độ sai số rất thấp (