Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 0201 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen và làm sáng tỏ vai trò của gen CR7
quan tài liệu
Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa
Cấu trúc rễ lúa bao gồm rễ phôi và nhiều loại rễ hậu phôi, với tổng cộng 5 loại rễ chính: rễ phôi, rễ phụ phôi, rễ phụ hậu phôi, rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ phôi xuất hiện đầu tiên sau 2-3 ngày từ khi hạt nảy mầm, tiếp theo là 5 rễ phụ phôi hình thành từ nốt bao lá mầm trong giai đoạn lá thứ nhất và thứ hai Rễ phụ hậu phôi phát triển từ các nốt thân và được sắp xếp theo một hoặc hai hàng.
Hình 2.1 Cấu trúc và hình thái rễ lúa (ra: rễ phôi, cr: rễ phụ, ecr: rễ phụ phôi, slr: rễ bên nhỏ, llr: rễ bên lớn)
Rễ bên có thể phát triển từ bất kỳ loại rễ sơ cấp nào, bao gồm rễ phụ phôi và rễ phụ Dựa vào hình thái giải phẫu, rễ bên được chia thành hai loại: rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ bên nhỏ có số lượng lớn và đóng vai trò quan trọng hơn trong sự sinh trưởng của cây so với rễ bên lớn Rễ bên nhỏ phát triển kéo dài về hai bên, trong khi rễ bên lớn kéo dài xuống phía dưới.
Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân
Cấu trúc giải phẫu đối xứng của bộ rễ lúa, theo nghiên cứu của Rebouillat et al (2008), cho thấy khả năng thích nghi của cây lúa với môi trường ngập nước Các loại mô chuyên hóa trong bộ rễ giúp lúa duy trì sự sinh trưởng bình thường ngay cả trong điều kiện ngập úng.
Rễ cây được cấu trúc từ nhiều lớp, bao gồm biểu bì, ngoại bì, cương mô, gỗ giữa (trung bì) và nội bì, cùng với phần bó mạch trung tâm Biểu bì, ngoại bì, cương mô và nội bì đều được hình thành từ một lớp tế bào đơn và đồng nhất ở tất cả các loại rễ Lớp ngoại bì, nằm ngay bên trong lớp biểu bì, có chức năng bảo vệ các rễ già khi lớp biểu bì bị mất, đồng thời đảm nhận vai trò hấp thụ nước và chất dinh dưỡng.
Lớp cương mô lignin hóa giúp bảo vệ lớp ngoại bì và hạn chế sự khuếch tán oxy, hỗ trợ cây chống lại tình trạng thiếu khí Trung bì gồm 4-5 lớp tế bào đối xứng, phân hóa để hình thành mô khí Mô khí có các tế bào tự phân giải hoặc di chuyển từ trong ra ngoài, tạo khoảng trống giữa các tế bào và phát triển thành gian bào, đóng vai trò quan trọng trong việc trao đổi khí Mô khí cung cấp oxy cho quá trình hô hấp của cây, đặc biệt phát triển ở các loài thực vật sống ngập nước Mô khí hiện diện ở tất cả các loại rễ lúa, trừ rễ bên nhỏ do không có lớp tế bào trung bì.
Nội bì là mô cuối cùng trong hệ thống mô cơ bản, chứa vành đai casparian được cấu tạo từ suberin bao quanh tế bào Đai casparian phát triển mạnh trong rễ lúa khi sinh trưởng trong đất, nhưng kém phát triển trong môi trường thủy canh Các tế bào nội bì đóng vai trò quan trọng như rào cản đối với nước và chất dinh dưỡng, cho phép vận chuyển apoplastic qua khoảng gian bào và vận chuyển có chọn lọc qua con đường liên tế bào giữa trung bì và bó mạch trung tâm.
Hình 2.3 Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa
Tổ chức bó mạch trung tâm ở lớp một lá mầm bao gồm xylem và phloem xen kẽ Mạch xylem tạo ra vùng áp suất cao, kết hợp với protoxylem phát triển qua vùng trung trụ Sự phân hóa xylem và phloem diễn ra từ ngoài vào trong Ở rễ phôi, có một hoặc hai mạch xylem trung tâm bao quanh bởi 6-8 mạch xylem nhỏ hơn, trong khi 6-7 ống phloem xen kẽ với các mạch xylem Mạch phloem được hình thành từ các tế bào tương tự từ mỗi ống protophloem, tạo nên cấu trúc đối xứng Khoảng trống giữa xylem và phloem được lấp đầy bởi các sợi cương mô (Rebouillat et al., 2008).
2.1.2 Chức năng bộ rễ lúa
Bộ rễ lúa có vai trò chính trong việc vận chuyển nước và muối khoáng hòa tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây Rễ lúa phát triển sâu, tạo sự vững chắc như mỏ neo cho cây Hệ thống rễ còn có chức năng thứ cấp là dự trữ và tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng, như auxin, ABA và ethylen, giúp truyền tín hiệu giữa chồi và rễ, từ đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây một cách hợp lý (Wu và Cheng, 2014; Gregory và Kirkegaard, 2017).
Xylem là cơ quan chuyên trách trong việc vận chuyển nước và chất dinh dưỡng cho cây, được cấu tạo từ bốn loại tế bào: tế bào ống, khung xương, sợi và nhu mô Tế bào xylem ống và khung xương đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển, trong khi xylem sợi và mô mềm hỗ trợ cấu trúc Trong đó, xylem ống, xương và sợi là các thành phần không sống, còn xylem mô mềm là thành phần sống Xylem thứ cấp (gỗ) không chỉ vận chuyển chất dinh dưỡng mà còn thực hiện chức năng vận chuyển ở khoảng cách xa, bao gồm cả việc đưa chất dinh dưỡng đến lá cây (Ulrich et al., 2016).
Nước và các chất dinh dưỡng được vận chuyển vào rễ qua hai con đường chính: con đường apoplastic và con đường symplastic Trong hệ thống apoplast, nước và chất dinh dưỡng di chuyển qua các thành tế bào nhờ vào hệ thống mao quản liên kết Tuy nhiên, khi đến vòng đai Casparin, chúng bị chặn lại và phải xuyên qua tế bào nội bì thông qua hệ thống chất nguyên sinh Sau đó, chúng tiếp tục vào thành tế bào của tế bào nhu mô để vào mạch dẫn Động lực vận chuyển trong hệ thống apoplast chủ yếu do lực hút của các mao quản và lực trương của keo trong thành tế bào, trong khi vận chuyển qua hệ thống symplast được điều khiển bởi lực hút trương của hệ thống keo nguyên sinh chất.
Hình 2.4 Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ
Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học
2.2.1 Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa
Stress hạn được định nghĩa là sự thiếu hụt nước và khả năng trữ ẩm của đất, xảy ra khi nước trong đất bốc hơi liên tục dưới điều kiện khô nóng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng Cây lúa chịu tác động của stress hạn qua việc đóng khí khổng và hạn chế trao đổi khí, được đánh giá qua sự giảm hàm lượng nước, thế năng nước của lá, áp suất trương, hoạt động của khí khổng, và sự giảm trưởng cũng như mở rộng tế bào Khi stress hạn trở nên nghiêm trọng, nó có thể ngưng quá trình quang hợp, gây rối loạn trao đổi chất và dẫn đến cái chết của cây Stress hạn ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây thông qua các quá trình sinh lý và sinh hóa như quang hợp, hô hấp, vận chuyển, hấp thu ion và carbonhydrate, đồng hóa dinh dưỡng, và các promoter sinh trưởng (Singh et al., 2012).
Hình 2.5 Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn
Mặn đất trồng trọt ảnh hưởng đến khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác toàn cầu (Singh et al., 2012) Đất mặn thường đi kèm với đất kiềm và ngập nước (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003), với NaCl là muối chính gây ra hiện tượng này Đất mặn được xác định khi có độ dẫn điện EC > 4.0 dS/m Lúa là cây trồng nhạy cảm với mặn, và khi đất có độ mặn cao, nó có thể gây ra những tác động không thể phục hồi như rối loạn quá trình đồng hóa ion và ức chế trao đổi chất, dẫn đến giảm sinh trưởng và năng suất (Ji-Ping et al., 2007) Mặn làm giảm năng suất cây trồng thông qua hai loại stress: stress áp suất thẩm thấu ở giai đoạn đầu và stress ion ở giai đoạn sau, dẫn đến ngộ độc cho cây Nồng độ ion Na+ cao làm giảm khả năng ra hoa và sự phát triển của bông lúa, đồng thời ức chế hoạt động quang hợp.
Ngập úng là một dạng stress phi sinh học phổ biến, gây ra sự giảm nhanh chóng tỷ lệ oxy hòa tan, dẫn đến nồng độ oxy trong tế bào giảm và khủng hoảng năng lượng Tình trạng này trở nên nghiêm trọng hơn khi quá trình quang hợp bị ức chế và ngừng hẳn.
Cây lúa, mặc dù có khả năng chịu ngập úng, chỉ một số giống thể hiện khả năng này thông qua việc vươn dài lóng Hầu hết các giống lúa sẽ chết sau 14 ngày ngập hoàn toàn Những khu vực trồng lúa phụ thuộc vào nước trời thường xuyên gặp tình trạng ngập úng, dẫn đến giảm năng suất đáng kể Ngập úng không chỉ ức chế quá trình trao đổi chất hiếu khí mà còn làm giảm khả năng quang hợp, từ đó làm giảm hàm lượng carbohydrate và gây chết cây.
Stress lạnh là một yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và năng suất cây trồng, đặc biệt ở các vùng ôn đới và vĩ độ cao, lý do chính khiến lúa gạo có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới (Cruz et al., 2013; Zhang et al., 2014) Nhiệt độ thấp tác động đến mọi giai đoạn phát triển của cây lúa, từ nảy mầm đến quá trình chín hạt Trong giai đoạn nảy mầm, nhiệt độ thấp ức chế tỷ lệ nảy mầm, dẫn đến giảm năng suất tới 25% và tạo điều kiện cho sự phát triển của cỏ dại (Fujino et al.).
Stress lạnh trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng có tác động nghiêm trọng đến sự phát triển của cây con, dẫn đến hiện tượng vàng lá, ngừng sinh trưởng và giảm khả năng đẻ nhánh Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, stress lạnh ảnh hưởng đến chất lượng hạt và quá trình vào chắc của hạt, gây ra sự giảm năng suất rõ rệt.
2.2.2 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn
Bộ rễ lúa đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất dưới điều kiện hạn hán Cấu trúc và sự phát triển của hệ thống rễ quyết định chức năng của cây trong môi trường khô hạn Trong khi các bộ phận trên mặt đất như lá và thân bị ức chế sinh trưởng, bộ rễ vẫn duy trì sự phát triển Sự khác biệt này xuất phát từ khả năng điều chỉnh của bộ rễ, bao gồm việc thiết lập lại thế năng nước thông qua thay đổi áp suất thẩm thấu và nới lỏng thành vách tế bào, cho phép bộ rễ phục hồi sinh trưởng trong điều kiện khô hạn (Pandey và Shukla, 2015).
Sự phát triển của hệ thống rễ được điều chỉnh bởi các yếu tố nội tại, xác định cấu trúc tổng thể của bộ rễ Tiềm năng di truyền của các tính trạng rễ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng phản ứng với các stress môi trường như khô hạn, ngập úng và thiếu dinh dưỡng, từ đó tạo ra tính linh hoạt trong sự phát triển của bộ rễ (Courtois et al., 2009).
Các tính trạng rễ quan trọng cho việc duy trì năng suất cây trồng trong điều kiện khô hạn bao gồm đường kính rễ nhỏ, chiều dài và mật độ rễ sâu trong lòng đất, nơi có nước Khả năng sinh trưởng của rễ ăn sâu và đường kính xylem cũng ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước Tại cấp độ toàn cơ thể, khả năng chống chịu hạn liên quan đến tổng sinh khối và kích thước bộ rễ so với các bộ phận khác như lá và chồi Ở cấp độ cơ quan, sự chống chịu hạn phụ thuộc vào đường kính rễ, chiều dài rễ chính, diện tích bề mặt rễ và mật độ mô rễ Tại cấp độ mô và tế bào, các yếu tố như đường kính xylem, hoạt động của aquaporin, sự hình thành mô khí và khôi phục bóng khí thông qua áp suất rễ cũng rất quan trọng Ở cấp độ hệ thống cơ quan, sự phân bố sâu của hệ thống rễ, khả năng phục hồi sinh trưởng của rễ sau khi đất có nước trở lại và số lượng chóp rễ trên chiều dài hệ rễ là những yếu tố then chốt Tóm lại, các tính trạng và gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn bao gồm chiều dài rễ, sinh khối rễ, số lượng rễ, tốc độ kéo dài rễ, sự phân nhánh rễ, góc rễ, đường kính xylem và hoạt động của aquaporin.
2.2.3 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn
Khả năng chống chịu mặn của cây không chỉ phụ thuộc vào một tính trạng đơn lẻ, mà cần hiểu rõ phản ứng của cây dưới stress mặn Các nghiên cứu thường tập trung vào phản ứng sinh lý của cây khi chịu tác động của mặn, với áp suất thẩm thấu và nồng độ ion cao là những yếu tố chính gây ra ngộ độc ion Lục lạp và ty thể là hai cơ quan dễ bị tổn thương nhất trong điều kiện mặn, do đó, việc nghiên cứu hàm lượng diệp lục, sự thay đổi bước sóng diệp lục và tính thấm của màng là cần thiết để nâng cao hiệu quả quang hợp của cây (Ghosh et al., 2016).
Mặn làm giảm diện tích lá và gây ra những thay đổi về giải phẫu lá ở cây lúa, cả in vitro lẫn trồng trong nhà lưới Tác động của mặn có thể gây chết tế bào thịt lá và làm giãn mô thịt lá, ảnh hưởng đến các bó mạch Sự tích lũy ion Na+ gây độc có thể được giảm bớt nhờ vào một số cơ chế của cây, bao gồm: (1) cơ chế đào thải muối, (2) hấp thụ chọn lọc các ion, và (3) điều hòa tỷ lệ K+/Na+ (Mickelbart et al., 2015).
Những nghiên cứu trên cây mô hình đã xác định HKT1 (Kênh vận chuyển
K + ái lực cao (HIGH-AFFINITY K + TRANSPORTER 1), SOS1 (SALT OVERLY SENSITIVE 1) và NHX (Na + /H + EXCHANGER) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng ion Na + Các gen HKT1 và SOS1 điều chỉnh dòng chảy ion qua màng sinh chất, trong khi gen NHX kiểm soát sự di chuyển ion vào không bào.
Hình 2.6 Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa
Gần đây, nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen HKT1 và các alen của nó đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống chịu mặn của cây ngũ cốc Cụ thể, HKT1;5 là kênh vận chuyển Na+ trên màng sinh chất, giúp phân phối Na+ từ mạch xylem rễ đến các tế bào nhu mô và có thể tới trung bì Việc giảm nồng độ Na+ trong mạch xylem hạn chế dòng vận chuyển đến chồi, dẫn đến sự khác biệt trong khả năng chống chịu mặn ở cây lúa non, nơi Na+ thường liên kết với biến thể alen OsHKT1;5.
4 amino acid ở vùng loop của OsHKT1;5 tạo ra giống kháng mặn tích lũy ít ion
Na + hơn giống mẫn cảm Koshihikari (Hình 2.6) (Zhong-Hai et al., 2005)
Một số alen OsHKT1;5 duy trì hiệu quả sự cân bằng K+/Na+ với các biến đổi amino acid đặc thù, giúp tăng cường vận chuyển K+ vào xylem rễ hơn Na+ Gen HKT1;5 nằm trong QTL Saltol được lập bản đồ từ giống lúa cạn Pokkali, là công cụ quan trọng để xác định khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con trên đồng ruộng và đã được áp dụng trong các chương trình chọn tạo giống Đánh giá hệ thống các dạng alen của gen OsHKT1;5 và nồng độ Na+, K+ cho thấy gen này vẫn chưa được xác định chức năng di truyền trong việc giảm thiểu tác hại của ion Na+ ở cây con của Oryza sativa và Oryza glaberrima (Mickelbart et al., 2015).
Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa
Auxin nội sinh là hormone thiết yếu cho sự phát triển của bộ rễ lúa và cây trồng Việc xử lý auxin ngoại sinh kích thích sự hình thành rễ phụ và rễ bên Nhiều gen tham gia vào đường truyền tín hiệu auxin ảnh hưởng đến quá trình phát triển bộ rễ Sự tích lũy và vận chuyển auxin trong cây được thực hiện bởi protein PIN, trong đó PIN1 được kích hoạt bởi gen CRL4 (OsGNOM1) Gen CRL4 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì gradient auxin ở gốc thân, cần thiết cho sự hình thành rễ phụ ở lúa OsGNOM1 tương đồng với gen GNOM1 ở Arabidopsis, điều chỉnh protein PIN1 trong việc vận chuyển auxin phân cực, hỗ trợ sự phân chia bất đối xứng của tế bào nhu mô trong mô phân sinh rễ phụ.
Hình 2.7 Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa
According to Wachsman et al (2015), auxin signaling in rice plants is regulated through the interaction of two protein families: AUX/IAA (Auxin/Indole-3-acetic Acid) and ARF (Auxin Response Factor) This interaction plays a crucial role in the activation of auxin-responsive genes, highlighting the importance of these proteins in plant growth and development.
Khi nồng độ auxin nội sinh thấp, các protein AUX/IAA kết hợp với gen ARF, dẫn đến ức chế biểu hiện của chúng Ngược lại, khi nồng độ auxin tăng cao, tín hiệu auxin kích thích phân hủy protein AUX/IAA, từ đó kích hoạt gen sinh tổng hợp protein ARF.
Các protein ARF đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt quá trình phiên mã trong tín hiệu auxin bằng cách liên kết với vùng cảm ứng auxin trên promoter của các gen cảm ứng auxin Điều này giúp tăng cường biểu hiện của các gen trong mạng lưới điều hòa liên quan đến sự hình thành rễ phụ và rễ bên ở cây lúa Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã phát hiện 31 gen tương đồng mã hóa họ protein AUX/IAA ở cây lúa.
Nghiên cứu của Inukai et al (2005) chỉ ra rằng ARF1 liên kết với vùng cảm ứng auxin AuxRE2 trên trình tự promoter của gen crl1 (Crown rootless 1), từ đó điều hòa biểu hiện của gen này Gen crl1 mã hóa yếu tố phiên mã LBD/LOB, và khi thực hiện đột biến điểm trên gen crl1 ở giống lúa Taichung65, các tác động đáng kể đến sự phát triển của cây lúa đã được quan sát.
Y et al (2005) đã tạo được thể đột biến crl1 không có sự hình thành rễ phụ Kết quả đánh giá chỉ cho thấy gene crl1 đáp ứng rất sớm với auxin và tại vị trí gốc thân cây lúa crl1 cũng biểu hiện ở vùng trả lời tín hiệu của auxin (Inukai et al., 2005)
Nhóm nghiên cứu của Liu H et al (2005) đã phát triển một thể đột biến soma arl1 với đoạn 20 bp bị mất trên gen ARL1 (Adventitious rootless 1), dẫn đến việc không hình thành rễ phụ Gen ARL1 mã hóa cho một protein thuộc họ LOB, được biểu hiện trong mô phân sinh rễ phụ, rễ bên, mô phân sinh chồi và mô mạch dẫn ARL1 phản ứng với auxin, và cơ chế biểu hiện của nó ở rễ tương đồng với sự phân bố auxin Mặc dù hai gen crl1 và ARL1 được công bố vào hai thời điểm khác nhau, nhưng về bản chất, chúng là một gene.
Nghiên cứu của Coudert J et al (2011) chỉ ra rằng gen crl1 có vai trò quan trọng trong việc điều hòa mạng lưới gen liên quan đến sự hình thành rễ phụ ở cây lúa Qua phân tích biểu hiện gen bằng phương pháp Affymetrix microarray, nhóm nghiên cứu đã phát hiện 250 gen, trong đó có 236 gen được điều hòa xuôi và ngược ở cây đột biến crl1 so với cây wildtype Taichung65 Đặc biệt, khi đánh giá mức độ biểu hiện gen sau khi xử lý với auxin ngoại sinh, kết quả cho thấy nhiều gen liên quan đến hormone, nước và dinh dưỡng không bị ảnh hưởng trực tiếp bởi gen crl1 trong điều kiện không có sự hình thành rễ phụ Tuy nhiên, ba gen phản ứng với auxin phụ thuộc vào crl1 được xác định là FSM/FAS1, GTE4 và MAP protein liên kết với vi ống, trong đó FSM/FAS1 và GTE4 đã được chứng minh liên quan đến sự duy trì mô phân sinh rễ ở lúa và Arabidopsis thông qua quá trình tái sắp xếp chất nhiễm sắc và điều hòa chu kỳ tế bào.
Hình 2.8 Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1
Nghiên cứu của Coudert et al (2015) đã sử dụng hệ thống cảm ứng để khôi phục sự biểu hiện của gen crl1 trong cây crl1 bằng cách chuyển gen này dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng với DEX Sau khi tách chiết mRNA trước và sau khi xử lý với DEX, kết quả cho thấy crl1 điều hòa tăng cường biểu hiện của 277 gen liên quan đến phân chia mô phân sinh, phản phân hóa tế bào và cân bằng hormone Trong số đó, nhóm nghiên cứu đã chọn 13 gen có mức độ biểu hiện mạnh để nghiên cứu chức năng hình thành rễ phụ, được ký hiệu từ CR1 đến CR13, trong đó gen CR7 mã hóa cho yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là các dòng lúa chuyển gen được cung cấp bởi phòng thí nghiệm liên kết Việt-Pháp (LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp, gồm:
Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào giống Taichung65 (TC65) và thể đột biến (crl1) đã được nghiên cứu qua các thế hệ T0, T1, T2 Cấu trúc gen chuyển bao gồm phần cds (coding sequence) của gen CR7, được điều khiển bởi promoter Ubiquitin, được ký hiệu là pUBi::cdsCR7.
- Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65.
Dạng đột biến crl1 được phát triển từ giống lúa TC65, có hình thái thân lá bình thường Tuy nhiên, đặc điểm nổi bật là tính hướng trọng lực giảm và bộ rễ chỉ có một rễ chính từ phôi hạt, từ tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm một số rễ phụ.
Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng
A Cây lúa Taichung65 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm có nhiều rễ phụ ở bộ rễ
B Cây lúa crl1 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm chỉ có 1 rễ chính
3.1.2 Mồi và các vật tư khác Để PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen, mồi xuôi được thiết kế nằm trên đoạn promoter và mồi ngược nằm
Để đánh giá sự biểu hiện của gen CR7 trong các dòng chuyển gen, phương pháp qPCR được áp dụng với cặp mồi thiết kế sao cho mồi xuôi bắc qua intron và nằm trên vùng ORF của gen CR7, trong khi mồi còn lại nằm sau mã kết thúc TAG trên trình tự 3’UTR Biểu hiện của gen actin được sử dụng làm tham chiếu cho quá trình này.
Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Gen nghiên cứu Tên mồi Kích thước khuếch đại Nhiệt độ gắn mồi
Gen chọn lọc thực vật HPT
Để thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử, cần chuẩn bị các vật tư và dụng cụ như máy PCR, máy RT-PCR, máy li tâm, máy điện di, máy soi UV, và máy cắt tiêu bản vibratome Bên cạnh đó, các hóa chất cần thiết cho quá trình tách chiết DNA, RNA, PCR, cDNA, qPCR và nhuộm GUS cũng rất quan trọng.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu hoạt động của promoter CR7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa
- Chọn lọc những dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen proCR7::GUS dựa trên mức độ phân ly di truyền
- Chọn lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc promoter CR7
- Đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị GUS
3.2.2 Nghiên cứu vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa
- Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR
- Sàng lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen pUBi::cdsCR7 thông qua sự phân ly di truyền
- Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen pUBi::cdsCR7.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 10 năm 2017 tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế LMI RICE-2, thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Bắc Từ Liêm, Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu lá khoảng 500 mg từ các dòng lúa chuyển gen pUBi::cdsCR7 và dòng đối chứng không chuyển gen được thu thập từ cây T0 đã được đánh dấu Các mẫu này được gói trong giấy bạc, ghi nhãn và nhanh chóng đưa vào nitơ lỏng Mẫu lá có thể được sử dụng ngay lập tức hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -80 độ C.
3.4.1.2 Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ lá non của cây lúa 2 tuần tuổi bằng phương pháp Trizol LS Các hóa chất sử dụng trong quy trình bao gồm Trizol LS Reagent, isopropanol, chloroform, ethanol và nước Mili-Q Quy trình tách chiết RNA được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của RNA thu được.
1 Nghiền mịn 500 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối sứ Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml đã được làm lạnh
2 Thêm 1,2 ml Trizol LS cho vào mỗi ống, sau đó vortex mạnh
3 Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút
4 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 10 phút, sau khi ly tâm xong, hút hết dịch nổi sang ống mới
5 Thờm 320 àl chloroform, sau đú lắc mạnh trong vũng 30 giõy
6 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút
7 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 15 phút
8 Nhẹ nhàng hút hết dịch nổi phía trên sang ống 1,5 ml mới Bổ sung 0,75 ml isopropanol lạnh, đảo nhẹ nhàng để dịch được trộn đều
9 Ủ 30 phút ở -20 0 C (hoặc ủ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng) Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0 C, loại bỏ dịch để thu phần kết tủa
10 Bổ sung 1.2 ml ethanol 75%, vortex nhẹ
11 Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút ở 4 0 C Sau đó loại bỏ ethanol để thu phần kết tủa
12 Hũa tan RNA bằng 50 àl nước Mili-Q, li tõm xuống đỏy rồi cho ngay vào đá Giữ RNA ở -20 0 C (nếu dùng luôn) hoặc -80 0 C (nếu muốn bảo quản trong thời gian dài)
RNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% với điện áp 80V trong 30 phút Sau đó, tiến hành quan sát dưới máy chụp gel để đánh giá số lượng và chất lượng của RNA đã được tách chiết Bước tiếp theo là tổng hợp cDNA.
RNA sau khi tách chiết được xử lý bằng DNase I ở nhiệt độ 37 độ C trong 10 phút nhằm loại bỏ DNA Sau khi xử lý bằng DNase I, các mẫu RNA sẽ được tiến hành phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp thành các sợi đôi cDNA Mỗi mẫu sẽ được sử dụng cho quy trình này.
Để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA, cần sử dụng tổng cộng 4 àg RNA cho mỗi phản ứng 20 àl Thành phần phản ứng bao gồm 4 àl 5X Reaction buffer, 2 àl Maxima enzym và nước H2O Quy trình nhiệt cho phản ứng được thực hiện như sau: ủ ở 25°C trong 10 phút, sau đó sao chép ngược ở 50°C trong 54 phút, và cuối cùng kết thúc phản ứng ở 85°C trong 10 phút Sau khi hoàn tất, hỗn hợp cần được pha loãng xuống nồng độ 0,05 àg/àl.
Sau quá trình phiên mã ngược, RNA được chuyển đổi thành cDNA, và sản phẩm này được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen actin, được sử dụng làm đối chứng dương để xác định sự hiện diện của cDNA Gen actin, mã hóa cho protein actin, là một thành phần quan trọng của bộ khung tế bào và có mức độ biểu hiện cao Cặp mồi được thiết kế chứa một đoạn intron trong gen, cho phép nhận diện cDNA của gen actin với kích thước 212 bp, đồng thời kiểm tra sự nhiễm tạp của genomic DNA, với sản phẩm khuếch đại có kích thước 369 bp.
Pha thành phần cho phản ứng qPCR 10 àl/phản ứng với nồng độ 0,02 àg RNA/àl phản ứng bao gồm: 5 àl GoTaq đ Green Master Mix, 0,4 àl Primers mix (2 àmol/àl), 0,6 àl H2O và 4 àl cDNA Phản ứng qPCR được thực hiện theo chu kỳ nhiệt đã định sẵn.
95 0 C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 95 0 C - 2 phút, 55 0 C - 1 phút, 72 0 C - 1 phút;
72 0 C trong 5 phút, hóa chất phát huỳnh quang là SYBR Kết quả phân tích được đọc trên máy vi tính và xử lý bằng phần mềm Excel 2013.
3.4.2 Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ T1, T2 3.4.2.1 Chọn lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen biến nạp
Để chọn các dòng lúa mang gen biến nạp, các dòng chuyển gen ở thế hệ T1 đã được phân tích Mỗi cấu trúc chuyển gen có 3-5 dòng T0 được kiểm tra sự phân ly di truyền qua phương pháp PCR Mỗi dòng được gieo 15-20 hạt in vitro trong môi trường 1/2MS, sau một tuần, mẫu lá được cắt để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phân tích PCR Kết quả PCR được sử dụng để đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền của gen biến nạp bằng phương pháp phân phối Khi bình phương (χ²) Các cây dương tính T1 có tỷ lệ phân ly 3:1 được trồng riêng trong từng chậu trong nhà lưới để thu hạt cho các nghiên cứu tiếp theo Hạt từ cây T1 nảy mầm trong ống nghiệm tạo ra cây T2, tiếp tục được đánh giá.
Hạt được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS với thành phần như trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ 1L môi trường cần pha
Vitamin MS (100X) 100X 5 ml Đường sucrose - 30 g
- Hạt thóc được bóc vỏ, sau đó khử trùng:
+ Lắc trong dung dịch ethanol 70% trong 1 phút
+ Ngâm 20 phút trong dung dịch nước Javen (NaClO) 3,8%
+ Rửa thật kỹ 6 lần bằng nước cất khử trùng
Sau khi khử trùng hạt, cấy hạt vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng trong phòng nuôi cây Thời gian chiếu sáng là 12 giờ sáng và 12 giờ tối, với nhiệt độ duy trì ở 28 độ C trong khoảng 7-10 ngày.
Tách chiết DNA từ lá lúa
DNA tổng số từ lá cây lúa chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Xin Xu et al (2005) có cải tiến
- 100 ml Dung dịch I gồm: 10g sodium lauryl sarcosine và 100 ml SDS 10%
- 100 ml Dung dịch II gồm: 2 g CTAB, 10 ml 1M Tris-HCl pH 8,0, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 và 28 ml 5M NaCl
- Dung dịch đệm tách chiết được pha trước khi tiến hành tách chiết theo tỷ lệ 13 Dung dịch I : 7 Dung dịch II
- Cắt 1 đoạn lá khoảng 5 cm cây lúa 7-10 ngày tuổi được nảy mầm trong ống nghiệm
Cắt nhỏ đoạn lá lúa và cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm một bi nghiền vào mỗi ống Ngâm các ống trong nitơ lỏng khoảng 5 phút trước khi nghiền mẫu bằng máy lắc.
- Bổ sung 150 àl dung dịch đệm tỏch chiết, đảo đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 65 0 C trong 30 phút
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1.660 g (~ 4.200 rpm) trong 10 phút
- Bổ sung 20 àl chloroform và lắc nhẹ trong 10 giõy, sau đú bổ sung 20 àl 5M kali axetat và lắc nhẹ trong 10 giây
- Ly tâm 1.660 g ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
- Cẩn thận hỳt 100 àl lớp dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới
- Bổ sung 100 àl isopropanol lạnh, đảo đầu ống vài lần Làm lạnh 30 phỳt ở -20 0 C
- Ly tâm 3.000 g (~ 5.700 rpm) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dịch lỏng, rửa tủa DNA bằng 200 ml ethanol 70% 2 lần Mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 3.000g trong 5 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
- Làm khụ tủa DNA và hũa tan bằng 50 àl nước Milli-Q hoặc TE cú bổ sung 20 àg/ml RNAase Ủ 30 phỳt ở nhiệt độ 37 0 C
- Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 30 phút Phương pháp PCR kiểm tra dòng chuyển gen
Phương pháp PCR được áp dụng để phát hiện gen chuyển mục tiêu pUbi::cdsCR7 hoặc proCR7::GUS trong các dòng lúa chuyển gen, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu CR7-R/FBUBI, R7-P-F/pcGUS-R và hpt-pc-F/hpt-pc-R.
Thành phần và chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR 20 àl thể hiện lần lượt ở bảng 3.3 và 3.4
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch 1 phản ứng (àl)
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
3.4.2.2 Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen biến nạp
Từ kết quả chọn lọc các dòng chuyển gen T1 với một bản sao cấu trúc gen biến nạp, ở thế hệ T2, chúng tôi tiếp tục sàng lọc để xác định ít nhất 2 dòng đồng hợp tử độc lập dựa trên mức độ phân ly di truyền Các dòng chuyển gen T2 đồng hợp tử là những dòng mà 100% cây kiểm tra mang cấu trúc gen biến nạp Để đơn giản hóa quy trình, chúng tôi áp dụng phương pháp chọn lọc cây mang gen bằng kháng sinh chọn lọc thực vật hoặc phương pháp nhuộm X-gluc đối với promoter CR7.
- Với mỗi dòng kiểm tra đem gieo 20-30 hạt trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS
- Sau 3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung 50 mg/l hygromycin
- Sau 10 ngày tiến hành đếm số cây kháng (cây sống) và không kháng kháng sinh (cây chết) Tính tỷ lệ cây kháng kháng sinh
3.4.2.3 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 35 phút
Hóa chất sử dụng: agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0.5X; ethidium bromide nồng độ 0,5 àg/ml (EtBr)
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 1 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-
Để thực hiện quy trình điện di, đầu tiên hãy làm nóng dung dịch đến 60°C và đổ vào khay điện di đã được cài sẵn răng lược, đảm bảo dung dịch ngập khoảng 2/3 chiều dài răng lược Sau đó, để gel đông cứng hoàn toàn Khi gel đã đông, rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, tiếp theo đổ dung dịch TAE cho đến khi ngập hoàn toàn bản gel.
- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với ladder 1 kb để kiểm tra kích thước
Nhuộm bản gel là quá trình lấy bản gel ra từ khuôn và ngâm trong dung dịch nước có chứa EtBr trong khoảng 20-30 phút Sau đó, bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, và hình ảnh được chụp bằng máy soi gel.
3.4.3 Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen CR7