Chương 7: Sửa chữa và bảo vệ DNA potx

Sinh học phân tử 134 Chương 7 Sửa chữa và bảo vệ DNA Trên phân tử DNA có thể xuất hiện nhiều biến đổi do sai hỏng trong quá trình trao đổi chất, do các tác nhân gây đột biến vật lý và hóa học của môi trường. Tuy nhiên, genome luôn có độ ổn định cao nhờ các cơ chế sửa chữa và bảo vệ DNA. DNA là phân tử duy nhất, mà khi biến đổi hay bị phá hỏng vẫn có khả năng được sửa chữa nhờ tế bào. Các cơ chế sửa sai rất đa dạng và có hiệu quả cao. Ba quá trình bao gồm sửa sai, tái bản và tái tổ hợp DNA liên quan chặt chẽ với nhau. Đây cũng là một minh chứng về sự phối hợp chặt chẽ giữa nhiều cơ chế di truyền. I. Khái quát về các cơ chế sửa sai Hầu hết các đột biến trên phân tử DNA thường được khắc phục bằng hai phương thức chính: - Sửa chữa phục hồi trực tiếp (direct reversal repair), hoặc: - Cắt bỏ sai hỏng và sửa chữa lại bằng cách dùng trình tự bổ sung (damage excision and repair using complementary sequence). Sửa chữa trực tiếp thường liên quan đến hai loại sai hỏng trên phân tử DNA do tia tử ngoại gây ra là: cyclobutane-pyrimidine dimer (CPDs) và pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PPs). Hai loại sai hỏng này đều làm biến dạng cấu trúc xoắn của DNA. CPDs và 6-4 PPs được nhận biết và sửa chữa nhờ enzyme photolyase. Enzyme này sử dụng năng lượng ánh sáng để thực hiện phản ứng làm thay đổi các liên kết hóa học để nucleotide trở lại dạng bình thường. Phản ứng sửa chữa DNA bằng photolyase xảy ra trong rất nhiều sinh vật prokaryote và eukaryote. Tuy nhiên, quá trình này không thấy ở động vật có vú. Ở người cũng chưa phát hiện được bất kỳ loại photolyase nào. Đa số sai hỏng của DNA được sửa chữa bằng phương thức thứ hai. Cơ chế này phải sử dụng thông tin di truyền chứa ở một trong hai sợi đơn DNA. Khi trình tự nucleotide trên một sợi bị thay đổi thì sợi thứ hai (liên kết bổ Sinh học phân tử 135 sung với sợi thứ nhất) được dùng làm khuôn mẫu để sửa chữa những sai hỏng đó. Một số cơ chế sửa chữa như sau: - Hệ thống sửa chữa nhận biết các trình tự DNA không thích hợp với các cặp base chuẩn và thay thế chúng. - Hệ thống sửa chữa-cắt bỏ (excision-repair system) loại đi một đoạn DNA ở vị trí sai hỏng và sau đó thay thế nó. - Hệ thống sửa chữa-tái tổ hợp (recombinant-repair system) sử dụng phương thức tái tổ hợp để thay thế vùng sợi đôi bị sai hỏng. Các hệ thống sửa chữa cũng phức tạp như bộ máy tái bản của nó, điều đó cho thấy tầm quan trọng của chúng đối với sự sống của tế bào. Khi hệ thống sửa chữa phục hồi một sai hỏng của DNA, thì không có một hậu quả xấu nào xảy ra. Nhưng một đột biến có thể tạo ra hậu quả xấu khi DNA bị hỏng. Hình 7.1 tóm tắt một số cơ chế sửa chữa DNA như sau: - Một vài enzyme phục hồi trực tiếp các loại sai hỏng đặc biệt của DNA. - Một số phương thức sửa chữa bằng cách cắt bỏ base, sửa chữa bằng cách cắt bỏ nucleotide, và sửa chữa ghép đôi lệch, tất cả chức năng của chúng thực hiện bằng cách loại bỏ và thay thế nguyên liệu. - Các hệ thống chức năng có thể tái tổ hợp để tạo ra một bản sao không bị sai hỏng thay thế cho một sợi đôi bị sai hỏng. - Phương thức nối đầu không tương đồng đã nối lại các đầu sợi đôi bị hỏng. - Một số DNA polymerase khác nhau cần thiết trong việc tổng hợp lại các đoạn DNA thay thế. 1. Các biến đổi xảy ra trên phân tử DNA Trên DNA có thể xảy ra các biến đổi ngẫu nhiên như sau: - Gãy hay đứt mạch. Phân tử DNA có chiều ngang rất mảnh, bản thân nó lại thường xuyên cuộn xoắn và giãn xoắn nên dễ xảy ra đứt gãy một sợi. Tuy nhiên, khả năng đứt cùng lúc hai sợi hiếm khi gặp hơn. Sinh học phân tử 136 Hình 7.1. Việc sửa chữa các gen có thể được phân loại theo các phương thức sử dụng các cơ chế khác nhau để phục hồi hoặc bỏ qua sự sai hỏng của DNA - Base bị cắt mất. Hiện tượng này làm base tương ứng không bắt cặp được. Dưới tác dụng của nhiệt có thể xảy ra quá trình khử purine (depurination) do thủy phân liên kết N-glycosyl. Phục hồi trực tiếp sai hỏng Sửa chữa bằng cách cắt bỏ base Sửa chữa bằng cách cắt bỏ nucleotide Sửa chữa bằng cách cắt bỏ ghép đôi lệch Sửa chữa bằng cách tái tổ hợp Nối đầu không tương đồng DNA polymerase xúc tác các tiểu đơn vị Sinh học phân tử 137 - Gắn các nhóm mới vào base bằng liên kết cộng hóa trị làm thay đổi tính chất như trường hợp methyl hóa (gắn nhóm CH 3 vào một base). - Biến một base này thành một base khác làm bắt cặp sai. Ví dụ: quá trình khử amine (desamination) của cytosine biến nó thành uracil. - Các base có thể tồn tại ở hai dạng keto và enol nên có thể dẫn đến bắt cặp sai. Ví dụ: dạng enol của cytosine có thể bắt cặp với adenine. - Tạo các thymine dimer. - Liên kết chéo giữa các mạch (interstand crosslink). Trên đây là các biến đổi ngẫu nhiên, nếu có tác động của các tác nhân gây đột biến các biến đổi sẽ xảy ra nhiều hơn. 2. Khái quát các cơ chế sửa chữa ở mức phân tử Sự nguyên vẹn của phân tử DNA mang thông tin di truyền có ý nghĩa sống còn đối với tế bào, nhất là tế bào prokaryote. Ở tế bào vi khuẩn, có đến 50% DNA không bị biến đổi thậm chí sau khi tái bản đến 100 triệu lần. Sự ổn định cao của DNA tế bào có được nhờ hàng loạt các cơ chế bảo vệ sự nguyên vẹn và sửa chữa ngay lập tức bất kỳ sai hỏng nào vừa xuất hiện. Các hệ thống sửa sai rất đa dạng và có hiệu quả rất cao ở E. coli. Có khoảng 100 locus tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào việc bảo vệ DNA và sửa sai. Chỉ với DNA, tế bào phải đầu tư rất lớn cho sự ổn định của thông tin di truyền. Nếu như sự tái bản chỉ xảy ra khi phân bào, thì các cơ chế sửa sai phải hoạt động liên tục. Tái bản được thực hiện với cơ chế về cơ bản giống nhau ở các loại tế bào và trong mỗi lần nhân đôi DNA. Trong khi đó, sai hỏng xảy ra rất đa dạng, nên các cơ chế sửa sai nhiều hơn và với số lượng gen tham gia lớn hơn. Hơn nữa, các cơ chế di truyền cơ bản như tái bản, tái tổ hợp DNA đều có sự tham gia của các cơ chế sửa sai và ngược lại sửa sai cần đến tái bản và tái tổ hợp. 3. Biến đổi làm tăng tần số đột biến Nhờ các cơ chế sửa sai nên bình thường DNA tế bào có độ ổn định rất lớn, thường sự thay thế base có tần số 10 -9 -10 -10 . Tuy nhiên, người ta đã phát hiện được các dòng đột biến ngẫu nhiên tăng cao hơn hẳn, chúng được gọi Sinh học phân tử 138 là mutator (nhân tố gây đột biến). Trong nhiều trường hợp, các kiểu hình mutator liên quan đến sai hỏng trong hệ thống sửa sai. Ở E. coli, các locus mutator mutH, mutL, mutU và mutS tác động đến các cấu phần của hệ thống sửa sai do ghép đôi lệch (mismatch-repair) sau tái bản nên đã làm cho tần số đột biến ngẫu nhiên tăng cao. Ngoài mutator, sự sai hỏng làm tăng tính nhạy cảm với tia tử ngoại (ultraviolet) và tăng sai hỏng khi tái tổ hợp. II. Các kiểu sửa chữa 1. Quang tái hoạt hóa Sửa chữa trực tiếp bằng quang tái hoạt hóa (photoreactivation) ít khi gặp, nó bao gồm sự phục hồi hoặc loại bỏ đơn giản các sai hỏng và quá trình này xảy ra ở ngoài sáng. Quang tái hoạt hóa của các pyrimidine dimers, trong đó tạo cơ hội cho các liên kết cộng hóa trị được phục hồi nhờ enzyme phụ thuộc ánh sáng (light-dependent enzyme), là một ví dụ điển hình (Hình 7.2). Hệ thống sửa chữa này phổ biến trong tự nhiên, và đặc biệt quan trọng ở thực vật. Trong E. coli, nó phụ thuộc vào sản phẩm của một gen đơn (phr) mã hóa cho một enzyme được gọi là photolyase. Sau khi xử lý tia tử ngoại gây đột biến, nếu đưa ra ánh sáng thì phần lớn sai hỏng được phục hồi. Hiện tượng này được gọi là quang tái hoạt hóa. Năng lượng của ánh sáng khả kiến (từ 300 đến 600 nm) hoạt hóa photolyase (gen phr ở E. coli) cắt các vòng cyclobutyl pyrimidine dimer (thường là thymine dimer). Enzyme này hoạt động trong các tế bào ở nhiều loài khác nhau. Vào ban ngày, các sinh vật thường chịu tác động của ánh sáng, nên cơ chế quang tái hoạt hóa (quang phục hồi) có vai trò quan trọng trong sửa sai DNA. Ví dụ: Mycoplasma, sinh vật đơn giản nhất hiện nay, chỉ có vài trăm gen nhưng một trong số đó đã được dùng cho quang tái hoạt hóa. Ngoại trừ sửa chữa bằng quang tái hoạt hóa xảy ra ngoài sáng, phần lớn các cơ chế sửa chữa khác được thực hiện trong tối, nhờ các enzyme nuclease cắt bỏ chỗ sai hỏng theo nhiều cách như sau: 2. Sửa chữa ghép đôi lệch Sửa chữa ghép đôi lệch (mismatch-repair) giữa các sợi DNA là một trong những mục tiêu chính của hệ thống sửa sai. Sửa chữa ghép đôi lệch Sinh học phân tử 139 được tiến hành khi phát hiện trên DNA các base nằm cạnh nhau mà không bắt cặp thích hợp. Các ghép đôi lệch tăng lên trong suốt quá trình tái bản được sửa chữa bằng cách phân biệt giữa các sợi cũ và mới và được ưu tiên sửa chữa trình tự của các sợi được tổng hợp mới (Hình 7.3). Ghép đôi lệch được tạo ra bởi các biến đổi base, là một kết quả của sự khử amine (deamination). Hình 7.2. Quang tái hoạt hóa Ghép đôi lệch thường được sửa sai bằng phương thức sửa chữa cắt bỏ, được khởi đầu bằng một enzyme nhận biết một base sai hỏng thực sự hoặc có sự thay đổi chiều hướng không gian (spatial path) của DNA. Pyrimidine dimer trong DNA bị chiếu tia UV Phức hợp DNA và enzyme quang tái hoạt hóa Hấp thụ ánh sáng Giải phóng enzyme để hoàn lại DNA tự nhiên Sinh học phân tử 140 Hình 7.3. Sửa chữa ghép đôi lệch trong tái bản Sự nhận biết và sửa chữa các sai lệch do bắt cặp base sai trên DNA được phát hiện ở E. coli, nấm men và tế bào động vật có vú. Ở vi khuẩn E. coli, có ba hệ thống enzyme khác nhau được sử dụng để sửa chữa các sai lệch bằng cách: GATC CTAG A Lỗi tái bản tạo ra sự ghép đôi lệch A-C Sợi DNA cần sửa chữa có adenine không được methyl hóa Sợi không được methyl hóa bị cắt gãy Methyl hóa GATC CTAG A T GATC CTAG A C GATC CTAG A T Tổng hợp DNA để sửa chữa lỗi GATC CTAG A T Sinh học phân tử 141 - Loại bỏ chỗ sai trong tái bản (errors in replication). - Loại bỏ ghép đôi lệch bên trong các đoạn trung gian của tái tổ hợp (mismatch within recombinant intermediates). - Loại bỏ thymine của cặp GT trong trường hợp 5-methylcytosine bị mất nhóm amine (NH 2 ) thành thymine. 3. Sửa chữa cắt bỏ Có hai loại hệ thống sửa chữa cắt bỏ, đó là: - Hệ thống sửa chữa cắt bỏ base (base excision repair) loại bỏ trực tiếp base sai hỏng và thay thế nó trong DNA. Ví dụ điển hình là enzyme DNA uracil glycolase, loại các uracil không được bắt cặp (mispaired) với các guanine. - Hệ thống sửa chữa cắt bỏ nucleotide (nucleotide excision repair) cắt bỏ một trình tự bao gồm các base sai hỏng; sau đó một đoạn DNA mới được tổng hợp để thay thế các nguyên liệu bị cắt bỏ. Các hệ thống này phổ biến ở hầu hết sinh vật. 3.1. Cắt bỏ base Việc loại bỏ chỗ sai được thực hiện nhờ một hoặc vài enzyme N- glycosylase. N-glycosylase nhận biết base biến đổi hay mất gốc amine hoặc biến dạng cấu trúc xoắn do sai lệch tạo ra và thủy phân liên kết N-glycosylic giữa base với đường với pentose. Lỗ hổng vừa được tạo ra do cắt bỏ được DNA polymerase làm đầy lại dựa vào khuôn mẫu bổ sung đối diện và ligase nối liền chúng (Hình 7.4). 3.2. Cắt bỏ nucleotide Việc cắt bỏ một vùng có nhiều thymine dimer (do UV) hoặc vùng liên kết chéo giữa các sợi, được thực hiện nhờ incision nuclease (nuclease tạo khấc trên DNA) như phức hợp Uvr ABC của E. coli, phức hợp này cắt các đoạn 12-13 nucleotide từ một sợi DNA. Sự thủy phân được thực hiện ở liên kết phosphodiester thứ tám ở đầu 5’ đến chỗ hỏng và ở phía 3’ là liên kết thứ tư hay năm. Sinh học phân tử 142 Hình 7.4. Phương thức cắt bỏ base DNA DNA glycosylase Vị trí AP AP endonuclease NTPs Deoxyribose phosphate + dNMPs DNA polymerase DNA ligase DNA mới Sinh học phân tử 143 Cấu trúc sợi kép bổ sung cho nhau của DNA cho phép, nếu thông tin bị mất do cắt bỏ sai hỏng trên một sợi có thể chép lại được nhờ dựa vào sợi đơn bổ sung kia. Tuy nhiên, một số sai hỏng liên quan cùng lúc cả hai sợi cũng có thể được sửa chữa nhờ vào một đoạn nucleotide tương đồng tồn tại đâu đó trong genome. Sự mất đoạn hay xen đoạn nucleotide, hay liên kết chéo giữa các sợi DNA có thể được phục hồi nhờ sự thay thế đoạn tương ứng bằng tái tổ hợp. Thậm chí sự đứt đôi cả hai sợi cùng chỗ, được coi là nặng nhất trong các sai hỏng, có thể được gắn liền lại nhờ ligase hay tái tổ hợp (Hình 7.5). 4. Đọc sửa đối với các base bắt cặp sai Cơ chế đọc sửa đối với các base bắt cặp sai (proofreading for base- pair matching) được thực hiện trong tái bản DNA. Sự bắt cặp cẩn thận của DNA polymerase đảm bảo cho sự chính xác của tái bản. Trước khi thực hiện phản ứng polymer hóa nối với nucleotide, nucleotide triphosphate mới phải bắt cặp với base bổ sung trên sợi khuôn mẫu. Nếu sự bắt cặp sai xảy ra, DNA polymerase sẽ loại bỏ nucleotide bắt cặp sai. Thậm chí, trước khi nucleotide mới gắn vào, enzyme dò lại cặp base cuối nếu chúng không bắt cặp thì sự polymer hóa tiếp theo bị dừng. Cặp nucleotide ở đầu cuối 3’ bắt cặp sai sẽ bị loại bỏ bởi hoạt tính exonuclease 3’ 5’ của DNA polymerase. Khi sự bắt cặp của cấu trúc sợi kép đã đúng, quá trình polymer hóa mới được tiếp tục. Hoạt tính đọc sửa đối với các base bắt cặp sai là đặc tính của nhiều DNA polymerase đảm bảo cho sự kéo dài chính xác của sợi đang được tổng hợp. Tuy nhiên, trong trường hợp cần thiết, DNA polymerase có thể bỏ qua chỗ sai và chép tiếp nhờ cơ chế tái bản “error prone” (xem mục 6). 5. Các hệ thống sửa chữa tái tổ hợp Các vị trí có sự sai hỏng, xảy ra trong một phân tử con (daughter molecule), sẽ được phục hồi nhờ sự tái tổ hợp để thu được một bản sao khác của trình tự từ một nguồn không bị sai hỏng. Bản sao này sau đó được dùng để sửa chữa lỗ hổng (gap) trên sợi bị hỏng. [...]... LexA bị phân giải III Bảo vệ DNA: Hệ thống cắt hạn chế (R)-Biến đổi (M) Ngoài các hệ thống sửa sai, tế bào còn có hệ thống bảo vệ DNA Các vi khuẩn có hệ thống miễn nhiễm hiệu quả DNA lạ, đó là: hệ thống cắt hạn chế-biến đổi (restriction-modification system) hiện diện trong nhiều loài vi khuẩn, trong đó DNA được biến đổi bởi các enzyme đặc hiệu Sự biến đổi xảy ra nhằm mục đích bảo vệ DNA chống lại sự phân... biến đổi và tạo sự đặc hiệu của điểm nhận biết DNA sợi kép nhạy cảm hơn với sự biến đổi và cắt hạn chế Các bacteriophage sợi đơn như M13 và X 174 ít bị tác động hơn Sự biến đổi của một sợi DNA đủ để miễn nhiễm DNA lạ Do vậy, DNA tái bản bán bảo tồn được bảo vệ bởi methyl hóa sợi khuôn 1 Các methylase của R-M Methylase là enzyme có hoạt tính xúc tác gắn một nhóm methyl vào một phân tử, ví dụ: DNA methyltransferase... hoạt tính, UmuD’) DNA polymerase IV và V là một phần của một họ lớn, bao gồm các DNA polymerase là những enzyme cần thiết trong sửa chữa DNA bị sai hỏng do chúng có hoạt tính polymerase Các protein tiểu đơn vị UmuD (thực tế là UmuD’) và UmuC có khả năng gắn các nucleotide vào sợi DNA bất chấp không tồn tại sợi khuôn mẫu Như vậy, chúng có thể ức chế hoạt tính tự sửa exonuclease 3’ 5’ của DNA polymerase... nhất để tăng khả năng sống sót đó là sửa chữa DNA một cách ngẫu nhiên với tỷ lệ sai sót (đột biến) cao nhưng dù sao vẫn duy trì được sự sống Đây chính là cơ chế sửa chữa DNA “error-prone” (còn được xem như là sự phát sinh đột biến SOS) Như vậy, sửa chữa DNA theo cơ chế này cũng là một trong những nguyên nhân tạo nên tính đa dạng của DNA Sinh học phân tử 146 Khi phân tử DNA bị đột biến, một số protein đặc... quá trình tổng hợp DNA để sửa chữa theo các cơ chế khác nhau Bởi vì nếu tế bào tiếp tục phân chia (tức là DNA tiếp tục được nhân lên) thì tỷ lệ đột biến cao sẽ xuất hiện khiến số tế bào sống sót giảm xuống Một số trường hợp sai hỏng được sửa chữa bằng cơ chế error-prone: - DNA kết hợp với các base không bổ sung trên sợi con (bắt cặp sai) - DNA bị sai hỏng không được sửa chữa do DNA polymerase III bị... Các base trên một sợi DNA bị sai hỏng Sự tái bản tạo ra một bản sao có lỗ thủng đối diện với sợi sai hỏng và một bản sao bình thường Lỗ thủng được sửa chữa bằng cách thu hồi một trình tự từ bản sao bình thường Lỗ thủng ở bản sao bình thường được sửa chữa Hình 7.6 Sửa sai nhờ tái tổ hợp và tái bản Sinh học phân tử 145 6 Hệ thống SOS Hệ thống SOS (chứa khoảng 30 gen không liên kết và thường bị ức chế bởi... chính chúng là một loại DNA polymerase đặc biệt (DNA polymerase V) Khi đột biến xảy ra trên gen mã hóa cho UmuD và UmuC, các tế bào vi khuẩn sẽ sống sót ít hơn tế bào bình thường dưới tác dụng của tia tử ngoại Một vài plasmid mang gen mucA và mucB, tương đồng với gen umuD và gen umuC, khi được đưa vào trong vi khuẩn sẽ làm tăng tính kháng với tia tử ngoại Ngoài ra, khi cả hai sợi đơn DNA đều chịu đột biến... giữ lại trong suốt quá trình tái bản DNA polymerase V (được mã hóa bởi gen umuD và umuC của E coli), hoặc DNA polymerase IV (được mã hóa bởi gen dinB của E coli) được cảm ứng trong hệ thống SOS, để tổng hợp một đoạn bổ sung cho sợi DNA bị hỏng DNA polymerase V là một phức hợp chứa hai protein tiểu đơn vị UmuD’ và một protein tiểu đơn vị UmuC (Trong quá trình sửa chữa “error-prone”, protein RecA, hoạt... tổng hợp DNA thay thế Ligase hàn điểm đứt Hình 7.5 Cắt bỏ nucleotide Sửa chữa và cắt bỏ một đoạn DNA có (các) base sai hỏng Sinh học phân tử 144 - Polymerase dừng lại và huy động khoảng 1.000 nucleotide phía dưới (downstream); chỗ trống gián đoạn được lấp đầy với sợi bổ sung từ sợi đôi chị em (sister duplex) do tái tổ hợp Trong cả hai trường hợp, chỗ sai lệch vẫn còn và được cắt bỏ sau đó bởi sửa sai... lẽ methyl hóa không góp phần bảo vệ chống sự xâm nhập của DNA ngoại lai Sự methyl hóa của DNA động vật có vú góp phần vào sự điều hòa biểu hiện của gen và biệt hóa tế bào Các nghiên cứu cho thấy có sự tương quan thuận giữa methyl hóa thấp (hyphomethylation) với hoạt tính của gen và ngược lại giữa sự methyl hóa mạnh với bất hoạt của gen Sự vắng mặt của các nhóm methyl trên DNA của ruồi giấm chứng tỏ rằng . cao nhờ các cơ chế sửa chữa và bảo vệ DNA. DNA là phân tử duy nhất, mà khi biến đổi hay bị phá hỏng vẫn có khả năng được sửa chữa nhờ tế bào. Các cơ chế sửa sai rất đa dạng và có hiệu quả cao để sửa chữa những sai hỏng đó. Một số cơ chế sửa chữa như sau: - Hệ thống sửa chữa nhận biết các trình tự DNA không thích hợp với các cặp base chuẩn và thay thế chúng. - Hệ thống sửa chữa- cắt. phân tử 134 Chương 7 Sửa chữa và bảo vệ DNA Trên phân tử DNA có thể xuất hiện nhiều biến đổi do sai hỏng trong quá trình trao đổi chất, do các tác nhân gây đột biến vật lý và hóa học của