(Luận án tiến sĩ) khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l ) vùng đồng bằng sông cửu long trên đối tượng cá tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ BẠCH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Cần Thơ – 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ BẠCH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Bùi Thị Bửu Huê PGS TS Lê Tiến Dũng Cần Thơ – 2020 luan an i LỜI CAM ĐOAN - - Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Bùi Thị Bửu Huê PGS.TS Lê Tiến Dũng Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác TP Cần Thơ, tháng 05 năm 2020 Tác giả luận án Lê Thị Bạch luan an ii LỜI CẢM ƠN - Trong suốt q trình thực luận án, tơi học hỏi thêm nhiều kiến thức, kinh nghiệm kỹ chun mơn bổ ích, thiết thực từ q thầy bạn bè Với lịng trân trọng biết ơn sâu sắc, xin gởi lời trân trọng cảm ơn đến: + PGS.TS Bùi Thị Bửu Huê, Bộ mơn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ + PGS.TS Lê Tiến Dũng, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hai Thầy Cô trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, công sức để truyền đạt cho kiến thức quý báu, hướng dẫn tận tình, giúp tơi định hướng đường nghiên cứu suốt trình thực luận án + GS Joëlle Quetin-Leclercq, Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ dành nhiều thời gian hướng dẫn khoa học cho thời gian nghiên cứu Bỉ kinh nghiệm, góp ý quý báu GS dành cho + Trân trọng cám ơn GS Kaeko Kamei GS Kenji Kanaori Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản hỗ trợ hóa chất, dụng cụ q trình thực thí nghiệm Viện Kyoto giúp đỡ việc đo phổ NMR, HRMS chất phân lập + Chân thành cám ơn dự án AQUABIOACTIVE, ARES – dự án hợp tác trường Đại học Bỉ Đại học Cần Thơ hỗ trợ kinh phí giúp tơi hồn thành luận án + Q Thầy - Cơ: GS.TS Nguyễn Cửu Khoa, PGS.TS Trần Ngọc Quyển, TS Nguyễn Hoàng Duy, TS Lại Thị Kim Dung, TS Nguyễn Thị Thanh Thủy, TS Nguyễn Đại Hải… Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thầy Cô truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện cho hoàn thành học phần, chuyên đề luan an iii + Quý Thầy, Cô Anh, Chị, Em Bộ mơn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ đặc biệt anh Nguyễn Trọng Tuân em Mai Văn Hiếu người bạn đồng môn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu + Xin cám ơn hai bạn đồng nghiệp Trương Quỳnh Như Nguyễn Lê Anh Đào đồng hành, hỗ trợ cho thí nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ + Xin cám ơn em sinh viên lớp Hóa học Hóa dược K39, K40 đồng hành trình nghiên cứu, thực luận án + Chân thành cám ơn gia đình ln quan tâm san sẻ khó khăn * Xin gởi lời chân thành cám ơn đến cấp lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành chương trình đào tạo bậc tiến sĩ Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn Cần Thơ, tháng 05 năm 2020 Lê Thị Bạch luan an iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC PHỤ LỤC xi MỞ ĐẦU TỔNG QUAN Giới thiệu chi Euphorbia Đặc điểm thực vật chi Euphorbia Hoạt tính sinh học chi Euphorbia Thành phần hóa học chi Euphorbia Tổng quan Cỏ sữa lớn 21 Đặc điểm thực vật 21 Công dụng dân gian 22 Hoạt tính sinh học Cỏ sữa lớn 23 Thành phần hóa học Cỏ sữa lớn 26 Tổng quan miễn dịch 36 Miễn dịch miễn dịch học 36 Các loại miễn dịch 37 Lysozyme 38 Bổ thể 38 Kháng thể 39 Miễn dịch học ứng dụng cá 39 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 Mẫu thực vật, hóa chất thiết bị 41 Mẫu thực vật 41 Hóa chất thiết bị 41 Phương pháp nghiên cứu 42 Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng 42 Xác định hàm lượng tổng polyphenol flavonoid 42 Phương pháp phân lập hợp chất 42 luan an v Phương pháp xác định cấu trúc định danh 43 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 43 THỰC NGHIỆM 51 Sàng lọc đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra 51 Chiết tách, phân lập hợp chất từ Cỏ sữa lớn 52 Xử lý nguyên liệu điều chế cao phân đoạn 52 Phân lập hợp chất 52 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lớn 60 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 Kết sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra 20 cao chiết 63 Hàm lượng polyphenol tổng flavonoid toàn phần Cỏ sữa lớn 66 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 67 Hợp chất Eup16 (chất mới) 67 Các hợp chất flavonoid 71 Các hợp chất phenol 92 Các hợp chất triterpenoid 95 Hợp chất steroid 104 Hợp chất diterpenoid 106 Hợp chất khác 108 Kết đánh giá hoạt tính tăng cường miễn dịch 112 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 115 Kết đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa 119 Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH ABTS•+ 119 Kết đánh giá khả kháng oxi hóa tế bào MIN6 120 Khả bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 129 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 luan an vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon (13) Resonance Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 1D-NMR one-Dimensional Resonance Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance 2D-NMR two-Dimensional Resonance ABTS 2,2-azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6sulphonic acid) BHT Butylated hydroxytoluene br s Broad singlet Tín hiệu đơn rộng CC Column chromatography Sắc ký cột Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều CD3COCD3 CH3COCH3 hydro (H) deuteri (D) CD3OD CH3OH hydro (H) deuteri (D) CHCl3 Chloroform CDCl3 CHCl3 hydro (H) deuteri (D) COSY Correlation Spectrocopy Phổ COSY d Doublet Mũi đôi DCM Dichloromethane dd Doublet of doublets DEPT Distortionless Enhancement Polarization Transfer DMSO Dimethylsulfoxyde ((CH3)2SO) DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Dulbecco’s Modified Medium DMEM Mũi đôi đôi by Phổ DEPT Eagle Môi trường nuôi cấy tế bào ĐBSCL Đồng sông Cửu Long ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethyl acetate ER Endoplasmic reticulum Fourier transform-infrared spectroscopy FT-IR luan an Mạng nội chất Phổ hồng ngoại vii HMBC HR-ESI-MS Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết High Resolution Electrospray Ionization Phổ khối lượng ion hóa phân giải cao Mass Spectrum Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C HSQC Heteronuclear Coherence Hz Hertz IC50 Inhibitory concentration at 50% Đơn vị đo tần số Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Hằng số ghép spin m Multiplet Mũi đa MeOH Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MIN6 Mouse Insulinoma Tế bào tụy tạng MS Mass Spectroscopy Khối phổ BuOH n-butanol NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy Phổ NOESY ppm parts per million Phần triệu J Peak Mũi tín hiệu q Quartet Rf Retention factor RNS Reactive nitrogen species Phần tử hoạt động chứa nitơ ROS Reactive oxygen species Phần tử hoạt động chứa oxi TOCSY Total Correlated Spectrocopy Phổ TOCSY s Singlet Mũi đơn t Triplet Mũi ba TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng TMS Tetramethylsilane H Proton chemical shift C Carbon chemical shift UV-Vis Ultraviolet - visible spectroscopy Mũi bốn luan an Độ dịch chuyển hóa học proton (ppm) Độ dịch chuyển hóa học carbon (ppm) Phổ tử ngoại - khả kiến viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loài thực vật thuộc chi Euphorbia Việt Nam Bảng 1.2 Các hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lớn loài khác thuộc chi Euphorbia 32 Bảng 3.1 Danh sách cao chiết ethanol tổng thu 51 Bảng 4.1 Kết sàng lọc tiêu miễn dịch cá tra 20 cao chiết 65 Bảng 4.2 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup16 số liệu tham khảo 70 Bảng 4.3 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup01 số liệu tham khảo 73 Bảng 4.4 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup02 số liệu tham khảo 74 Bảng 4.5 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup04 số liệu tham khảo 76 Bảng 4.6 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup05 số liệu tham khảo 78 Bảng 4.7 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup08 số liệu tham khảo 80 Bảng 4.8 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup09 số liệu tham khảo 81 Bảng 4.9 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup11 số liệu tham khảo 83 Bảng 4.10 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup14 số liệu tham khảo 85 Bảng 4.11 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup15 số liệu tham khảo 87 Bảng 4.12 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup19 số liệu tham khảo 89 Bảng 4.13 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup21 số liệu tham khảo 91 Bảng 4.14 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup10 số liệu tham khảo 92 Bảng 4.15 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup12 số liệu tham khảo 93 Bảng 4.16 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup13 số liệu tham khảo 94 Bảng 4.17 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup06 số liệu tham khảo 96 Bảng 4.18 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup07 số liệu tham khảo 98 Bảng 4.19 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup17 số liệu tham khảo 101 Bảng 4.20 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup03 số liệu tham khảo 103 Bảng 4.21 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup20 số liệu tham khảo 105 Bảng 4.22 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup23 số liệu tham khảo 107 Bảng 4.23 Các liệu phổ NMR hợp chất Eup18 số liệu tham khảo 109 Bảng 4.24 Tổng hợp hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lớn 110 Bảng 4.25 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 117 Bảng 4.26 Kết hoạt tính kháng khuẩn chất phân lập kháng sinh đối chứng 118 Bảng 4.27 Kết MIC mẫu thử 119 Bảng 4.28 Hiệu trung hịa gốc tự DPPH ABTS•+ mẫu thử 120 luan an 283 Phụ lục 21.2a Phổ 13C-NMR (125MHz, CD3OD) hợp chất Eup23 Phụ lục 21.2b Phổ 13C-NMR giãn hợp chất Eup23 luan an 284 Phụ lục 21.3a Phổ DEPT hợp chất Eup23 Phụ lục 21.3b Phổ DEPT giãn hợp chất Eup23 luan an 285 Phụ lục 21.4a Phổ HMBC hợp chất Eup23 luan an 286 Phụ lục 21.4b Phổ HMBC giãn hợp chất Eup23 Phụ lục 21.4c Phổ HMBC giãn hợp chất Eup23 Phụ lục 21.4d Phổ HMBC giãn hợp chất Eup23 luan an 287 Phụ lục 21.4e Phổ HMBC giãn hợp chất Eup23 Phụ lục 21.5a Phổ HSQC hợp chất Eup23 luan an 288 Phụ lục 21.5b Phổ HSQC giãn hợp chất Eup23 Phụ lục 21.5c Phổ HSQC giãn hợp chất Eup23 luan an 289 Phụ lục 21.5d Phổ HSQC giãn hợp chất Eup23 Phụ lục 22: Các phổ hợp chất Eup18 (1-O-benzyl-rutinoside) Phụ lục 22.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, CD3OD) hợp chất Eup18 luan an 290 Phụ lục 22.1b Phổ 1H-NMR giãn hợp chất Eup18 Phụ lục 22.1c Phổ 1H-NMR giãn hợp chất Eup18 luan an 291 Phụ lục 22.1d Phổ 1H-NMR giãn hợp chất Eup18 Phụ lục 22.2a Phổ 13C-NMR (125MHz, CD3OD) hợp chất Eup18 luan an 292 Phụ lục 22.2b Phổ 13C-NMR giãn hợp chất Eup18 Phụ lục 22.2c Phổ 13C-NMR giãn hợp chất Eup18 luan an 293 Phụ lục 22.3a Phổ DEPT hợp chất Eup18 Phụ lục 22.3b Phổ DEPT giãn hợp chất Eup18 luan an 294 Phụ lục 22.4a Phổ HMBC hợp chất Eup18 Phụ lục 22.4b Phổ HMBC giãn hợp chất Eup18 luan an 295 Phụ lục 22.4c Phổ HMBC giãn hợp chất Eup18 Phụ lục 22.4d Phổ HMBC giãn hợp chất Eup18 luan an 296 Phụ lục 22.5a Phổ HSQC hợp chất Eup18 Phụ lục 22.5b Phổ HSQC giãn hợp chất Eup18 luan an 297 Phụ lục 22.5c Phổ HSQC giãn hợp chất Eup18 luan an