Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.42.01.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết 2: PGS.TS Phạm Thị Tâm HÀ NỘI- NĂM 2020 luan an LỜI CAM ĐOAN Tơi Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Xn Viết PGS.TS Phạm Thị Tâm Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền luan an LỜI CẢM ƠN Để thực hoàn thành luận án này, nhận hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ quan tâm, động viên từ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến hai thầy, giáo kính mến mình, PGS.TS Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội) Thầy cô người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu cho tơi suốt q trình thực đề tài Thầy cô luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu nhiệt tình hỗ trợ tơi thực đề tài bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Cơng nghệ sinh học), Th.S Cao Thị Thanh Hương, ThS Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS Đặng Thị Hồng Thắm sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN), Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN) Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cán - giảng viên - sinh viên môn Di truyền học - Hóa Sinh, cán - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội ủng hộ tạo điều kiện để tơi thực nội dung đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hồn thành chương trình học Nghiên cứu sinh Trường Tôi xin cảm ơn tập thể cán - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tơi triển khai thuận lợi nội dung đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền luan an DANH MỤC VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ nghĩa Việt A Ala Asn Asp Adenine Alanine Asparagine Aspartic acid 10 11 bp BHI CFU C DNA Gln Glu Base pair Brain Heart Infusion Colony Forming Units Cytosine Deoxyribonucleic acid (axit nucleic) Glutamine Glutamic acid 12 13 14 Gly G His Glycine Guanine Histidine 15 16 17 18 Ile KIA KP Leu Isoleucine Kligler Iron Agar Kanagawa phenomenon Leucine 19 20 LPS LD50 Lipopolysaccharides Lethal dose (Liều gây chết trung bình) 21 LB Luria Broth 22 23 Met NCBI 24 Phe Methionine National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) Phenylalanine 25 26 27 PCR Pro OMPs Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Proline Outer membrane proteins (Protein màng ngoài) 28 ORF Open reading frame (Khung đọc mở) luan an 29 PBS Phosphate buffered saline 30 RRDR 31 RNA Rifampicin-resistance determining region (Vùng xác định kháng rifampicin) Ribonucleic acid 32 33 34 35 Ser TRH TDH TLH Serine TDH-related haemolysin Thermostable direct haemolysin Thermolabile haemolysin 36 37 38 TCBS Thr RPS Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose Threonine Relative percent survival (Tỉ lệ bảo hộ) 39 40 41 T Tyr Val Tymine Tyrosine Valine 42 42 & cs VPGs Và cộng Vibrio parahaemolyticus ghosts luan an MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Tính mới, tính độc đáo đề tài Địa điểm thời gian nghiên cứu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận số loài cá 1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa sinh trưởng vi khuẩn Vibrio 1.1.2 Hệ gen vi khuẩn V parahaemolyticus 1.1.3 Độc tố gen quy định độc tố haemolysin 1.1.4 Gen rpoB tính kháng rifampicin 12 1.1.5 Kháng nguyên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 14 1.2 Bệnh hoại tử gan thận cá biển 15 1.2.1 Triệu chứng .15 1.2.2 Chẩn đoán điều trị .17 1.3 Vắc-xin chế miễn dịch chủ động 18 1.3.1 Vắc-xin phân loại vắc-xin cho cá 18 1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu cá xương 21 1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào thể cá 23 1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá 25 luan an 1.4.1 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân vật lý .25 1.4.2 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân hóa học 26 1.4.3 Tạo vi khuẩn giảm độc lực kĩ thuật gen 32 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá 35 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 35 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 38 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1 Cá bệnh 41 2.1.2 Cá thí nghiệm 41 2.1.3 Vi khuẩn 41 2.1.4 Hóa chất 41 2.1.5 Thiết bị 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu .43 2.2.1 Sơ đồ bước thực 43 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh 43 2.2.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn 44 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram 44 2.2.5 Phương pháp xác định khả sinh trưởng vi khuẩn .44 2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 44 2.2.7 Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn .47 2.2.8 Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin 48 2.2.9 Phương pháp đánh giá độc lực dòng vi khuẩn kháng rifampicin 49 2.2.10 Nhóm phương pháp sinh học phân tử .50 2.2.10.1 Phương pháp thiết kế mồi .50 2.2.10.2 Phương pháp tách DNA tổng số 50 luan an 2.2.10.3 Phương pháp PCR, giải trình tự gen 50 2.2.11 Phương pháp tin sinh .52 2.2.12 Phương pháp đánh giá tính ổn định độc lực độ an tồn dịng vi khuẩn giảm độc lực cá mú chấm cam 52 2.2.13 Phương pháp đánh giá khả đáp ứng miễn dịch dòng giảm độc lực cá mú 53 2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu 54 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận 55 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio 55 3.1.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa mẫu vi khuẩn phân lập .58 3.1.3 Xác định chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phương pháp phân tử 62 3.1.4 Đánh giá khả gây bệnh cho cá mú chủng vi khuẩn phân lập 65 3.1.5 Phân lập, giải trình tự gen độc tố toxR, tlh gen rpoB chủng vi khuẩn phân lập 68 3.2 Kết tạo dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực 78 3.2.1 Đánh giá độc lực dòng vi khuẩn kháng rifampicin 78 3.2.2 Đánh giá đặc điểm sinh hóa dòng vi khuẩn giảm độc lực 90 3.2.3 So sánh trình tự gen toxR, tlh rpoB dòng giảm độc lực so chủng vi khuẩn dại 90 3.2.3.1 So sánh trình tự gen toxR tlh dòng giảm độc lực chủng vi khuẩn dại 90 3.2.3.2 So sánh trình tự rpoB chủng dại với dòng giảm độc lực .99 3.3 Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch, khả sinh trưởng dòng vi khuẩn giảm độc lực 104 3.3.1 Đánh giá tính ổn định độc lực, khả sinh trưởng dòng giảm độc lực .104 3.3.2 Xác định tính an tồn dịng L4650 106 luan an 3.3.3 Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch dòng vi khuẩn giảm độc lực cá mú 107 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .112 4.1 Kết luận 112 4.2 Kiến nghị 113 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 Tài liệu tiếng Việt 115 PHỤ LỤC luan an DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ bước thực 43 Hình 2.2 Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú 48 Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập môi trường TCBS 57 Hình 3.2 Phản ứng lên men môi trường KIA (A) phản ứng sinh indol với thuốc thử Kovac (B) mẫu vi khuẩn 59 Hình 3.3 Vi khuẩn VCTT 12233 (A) HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi bọt thử nghiệm với H2O2 60 Hình 3.4 Vi khuẩn LBT6 gây tượng tan huyết môi trường thạch máu (A) có khả di động mơi trường LB bán lỏng (B) 60 Hình 3.5 Vi khuẩn N13.1.1 nuôi BHI agar với đĩa giấy kháng sinh 61 Hình 3.6 DNA tổng số vi khuẩn điện di gel agarose 62 Hình 3.7 Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR mẫu vi khuẩn với cặp mồi toxR-4, toxR-7 64 Hình 3.8 Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh mẫu vi khuẩn với cặp mồi tlhF-tlhR 65 Hình 3.9 Cá mú chết ngày thứ sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) ngày thứ sau gây nhiễm chủng LBT6 với tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B) 66 Hình 3.10 Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4 68 Hình 3.11 So sánh hai trình tự gen toxR chủng LBT6 khuếch đại cặp mồi toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) 70 Hình 3.12 Sơ đồ minh họa đoạn trình tự gen toxR chủng V parahaemolyticus NCBI với trình tự tương ứng gen toxR hoàn chỉnh chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 71 Hình 3.13 Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3 72 luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 165 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 166 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 167 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 168 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 169 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 170 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 171 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 172 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 173 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 174 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 175 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 176 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 177 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien 178 (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien luan an (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien (Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien(Luan.an.tien.si).nghien.cuu.tao.chung.vi.khuan.vibrio.parahaemolyticus.dot.bien.giam.doc.luc.nham.phat.trien.vac.xin.phong.benh.hoai.tu.gan.than.tren.mot.so.loai.ca.bien
Ngày đăng: 27/12/2023, 00:48
Xem thêm:
