TỔNG QUAN
Tổng quan về tinh bột hạt tam giác mạch (Fagopyrum esculentum)
2.1.1 Phân loại về khoa học
Hạt tam giác mạch, thường được xếp cùng nhóm với ngũ cốc, là một loại cây trồng thuộc họ Polygonaceae Hai loại tam giác mạch chính được sản xuất và tiêu thụ trên khắp thế giới là: tam giác mạch thông thường (Fagopyrum esculentum) và tam giác mạch chua (Fagopyrum tataricum) (Peiyou Qin và cộng sự, 2010) Hạt tam giác mạch thông thường (Hình 2.1) được phân loại khoa học theo Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Phân loại hạt kiều mạch thông thường theo khoa học
Phân loại Tên khoa học
Hình 2.1 Cây tam giác mạch thông thường (Fagopyrum esculentum)
2.1.2 Phân bố và đặc điểm sinh thái
Cây tam giác mạch thông thường được thuần hóa và trồng lần đầu ở nội địa Đông Nam Á (khoảng 6000 năm trước Công Nguyên) Từ đó lan sang Trung Á và Tây Tạng, sau đó đến Trung Đông và châu Âu (Ohnishi, 1998) Nó là một trong những loại cây trồng sớm nhất được người châu Âu giới thiệu đến Bắc Mỹ Việc phân tán loài cây này trên toàn cầu được hoàn thành vào năm 2006 Từ đó việc trồng trọt và sản xuất hạt tam giác mạch không ngừng phát triển, theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAOSTAT, 2019), các nước sản xuất hạt kiều mạch với số lượng lớn bao gồm: Nga, Trung Quốc, Ukraine, Hoa Kỳ… trong đó có Việt Nam.
Tam giác mạch là cây trồng ngắn ngày, phát triển tốt trên đất bạc màu hoặc đất chua Ở vùng khí hậu nóng, cây chỉ có thể được trồng bằng cách gieo hạt vào cuối mùa để chúng nở hoa khi thời tiết mát mẻ hơn Chúng có hệ thống rễ phân nhánh với rễ chính ăn sõu vào đất ẩm (Stone và cộng sự, 1906) Thõn cõy cao từ 75 – 125 cm (Bjửrkman và cộng sự, 2008) Cây có thời gian sinh trưởng từ 10 – 12 tuần và nó có thể được trồng ở các khu vực có vĩ độ cao hoặc phía bắc (Quisenberry và cộng sự, 1939) Hạt tam giác mạch có hình tứ diện, hoa thường có màu trắng, màu hồng hoặc vàng (Li và cộng sự, 2001)
2.1.3 Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch
Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch thông thường được trình bày ở Bảng 2.2 theo nghiên cứu của Peiyou Qin và cộng sự năm 2010. Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của hạt tam giác mạch thông thường
STT Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng (%)
Từ bảng số liệu trên, thành phần chính của nội nhũ hạt tam giác mạch đó là tinh bột, tiếp đến là protein, chất béo, xơ và tro (Zheng và cộng sự, 1998; Stead- man và cộng sự, 2001; Bonafaccia và cộng sự, 2003) Tinh bột tam giác mạch có dạng hình cầu và đa giác Kích thước hạt phân bố trong khoảng từ 2-14 μm (Qianm (Qian và cộng sự, 1998; Zheng và cộng sự, 1998; Qian and Kuhn, 1999), nhỏ hơn kích thước hạt tinh bột bắp và lúa mì từ 1.6-2.4 lần do đó dẫn đến hiệu suất thu hồi tinh bột hạt tam giác mạch thấp hơn đối với quy trình chiết tách ướt (Zheng và cộng sự, 1998) Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột tam giác mạch nằm trong khoảng từ 77.3-
85.8 o C (Zheng và cộng sự, 1998; Yoshi- moto và cộng sự, 2004) Sự chênh lệch nhiệt độ này có thể là do sự khác biệt về giống loài và địa điểm gieo trồng.
Tổng quan về nano tinh bột (Starch nanoparticles)
Hạt nano tinh bột được định nghĩa là các hạt có kích thước nhỏ hơn 1000 nm nhưng phải lớn hơn một phân tử đơn lẻ (Campelo và cộng sự, 2020) Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu có yêu cầu nghiêm ngặt hơn rằng hạt nano tinh bột phải có kích thước không được vượt quá 300nm (Sun Q và cộng sự, 2014).
2.2.2 Tính chất của nano tinh bột a Hình thái và sự phân bố kích thước hạt
Hình thái, cấu trúc và sự phân bố kích thước của nano tinh bột có thể được xác định thông qua một số kỹ thuật thử nghiệm như kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi điện tử truyền qua (Sun, 2018) Hình thái và kích thước của nano tinh bột có thể khác nhau tùy thuộc vào điều kiện, phương pháp xác định và nguồn thực vật (Alcázar-Alay và cộng sự, 2015) Theo nhiều nghiên cứu, hính thái của nano tinh bột có thể tròn, phẳng, hình elip hoặc không đều với bề mặt nứt và xốp (Herlina Marta và cộng sự, 2023) và có phạm vi phân bố kích thước không đồng đều, trung bình từ 30 nm đến lớn hơn 250 nm Kích thước hạt tinh bột càng nhỏ thì hạt nano tinh bột tạo ra sẽ càng nhỏ và được sử dụng nhiều hơn trong các ngành công nghiệp khác nhau (Kim và cộng sự, 2015) b Độ kết tinh
Mức độ kết tinh là tỷ lệ giữa khối lượng của các miền tinh thể và tổng khối lượng của toàn bộ nano tinh bột Mức độ kết tinh bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ amylopectin, độ dài chuỗi, kích thước tinh thể, hướng của chuỗi xoắn kép trong vùng tinh thể và mức độ tương tác giữa các chuỗi xoắn kép (Suriya và cộng sự, 2018; Kumari và cộng sự, 2020; Dufresne
6 và cộng sự, 2014) Cấu trúc tinh thể của SNPs được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction – XRD) Cấu trúc tinh thể được phân thành nhiều loại, bao gồm loại A, B, C và V.
Hình 2.2 Giản đồ tán xạ tia X các dạng tinh thể của tinh bột (Katsumi và cộng sự, 2015) Cấu trúc tinh thể loại A là cấu trúc điển hình của tinh bột ngũ cốc, ví dụ: ngô, lúa mì, gạo… (Katsumi và cộng sự, 2015).
Cấu trúc tinh thể loại B là cấu trúc điển hình của tinh bột có hàm lượng amylose cao có trong củ, quả và thân cây, ví dụ: tinh bột từ khoai tây, chuối, dong riềng, cao lương… (Katsumi và cộng sự, 2015).
Cấu trúc tinh thể loại C là hỗn hợp của loại A và B được tìm thấy trong tinh bột chiết xuất từ cây họ đậu hoặc rễ cây, ví dụ hạt đậu hoặc củ sắn… (Katsumi và cộng sự, 2015)
Cấu trúc tinh thể loại V xuất hiện khi có sự hình thành phức hợp giữa amylose và lipid (Da Silva và cộng sự, 2017; Dufresne, 2014) Mẫu nano tinh bột tạo ra từ quá trình kết tủa nano cho thấy độ kết tinh loại V (cấu trúc xoắn ốc đơn giữa amylose và ethanol) Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự (2021), Sun và cộng sự (2014), nano tinh bột tạo ra từ sự kết hợp của phương pháp xử lý enzyme sau đó kết tinh lại cho thấy độ kết tinh của nano tinh bột tăng lên và có cấu trúc tinh thể loại B và V. c Đặc tính nhiệt
Tính chất biến đổi nhiệt của nano tinh bột được xác định bằng phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai và phân tích nhiệt lượng Những phân tích nhiệt này rất quan trọng, vì qua đó chúng giúp xác định được các điều kiện để áp dụng nano tinh bột trong công nghiệp Hạt nano tinh bột sắn tạo ra bằng phương pháp siêu âm dẫn đến độ ổn định nhiệt thấp hơn so với tinh bột tự nhiên, ngoài ra còn làm giảm nhiệt độ hồ hóa do sự suy yếu của các liên kết hydro trong vùng vô định hình (Da Silva và cộng sự, 2017) Phương pháp kết hợp xử lý enzyme sau đó kết tinh lại làm giảm độ ổn định nhiệt của nano tinh bột (Sun và cộng sự, 2014) Với phương pháp kết tủa, nano tinh bột tạo ra cho thấy sự giảm nhiệt độ hồ hóa do cấu trúc xoắn ốc đơn của nano tinh bột dễ bị phân hủy hơn so với tinh bột tự nhiên (Qin và cộng sự, 2016). d Độ trương nở và độ hòa tan
Theo báo cáo của Winarti và cộng sự, nano tinh bột từ củ dong riềng được tạo ra từ phương pháp kết tủa với butanol cho thấy sự gia tăng về thể tích trương nở (5.28 – 7.92 g/g) và độ hòa tan (9.43 – 16.89%) so với tinh bột tự nhiên Với nghiên cứu khác vào năm
2009, nano tinh bột từ khoai tây và sắn tạo ra từ phương pháp xử lý cơ học cũng cho thấy sự gia tăng đáng kể về thể tích trương nở (Szymońska và cộng sự, 2009) e Độ tiêu hóa
Quá trình tiêu hóa tinh bột là một quá trình phức tạp bao gồm sự khuếch tán của enzyme vào chất nền, sự hấp thụ của enzyme lên vật liệu và các điều kiện thủy phân Khả năng tiêu hóa của nano tinh bột trong ống nghiệm cao hơn so với tinh bột tự nhiên, thường là do diện tích tiếp xúc của tinh bột có kích thước nano sẽ cao hơn (Li và cộng sự, 2014) Theo báo cáo của Suriya và cộng sự, khả năng tiêu hóa của nano tinh bột tăng lên 41.29 – 43.24% bằng cách thủy phân với pullulanase, sau đó kết tinh lại trong 12-24 giờ Tuy nhiên, khả năng tiêu hóa của nano tinh bột có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn tinh bột, kích thước hạt, độ kết tinh, tỷ lệ amylose – amylopectin… (Ding và cộng sự, 2016)
2.2.3 Ứng dụng của nano tinh bột
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của nano tinh bột trong ngành công nghiệp thực phẩm như: tạo màng có thể ăn được, ổn định hệ nhũ tương và vật liệu đóng gói các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Nano tinh bột có thể được bổ sung vào màng polymer thực vật nhằm cải thiện tính chất cơ học, tính chịu nhiệt Việc bổ sung nano tinh bột còn được chứng minh là làm giảm
8 tính thấm nước, giúp hạn chế sự hút ẩm, ngoài ra còn giúp màng bền hơn, chịu được các tác động cơ học cao hơn (Santana JS và cộng sự, 2019; Condés MC và cộng sự, 2018)
Các phương pháp tạo ra nano tinh bột
Các tinh thể nano hoặc hạt nano tinh bột thường được sản xuất với mục đích ổn định hệ nhũ tương trong các chất nền polyme để cải thiện các đặc tính cơ học và là chất mang các hợp chất có hoạt tính sinh học Các phương pháp khác nhau đã được mô tả để tạo thành các hạt nano tinh bột: (1) bằng cách kết tủa (Ma et al 2008; Tan et al 2009), (2) bằng cách kết hợp sự hình thành phức hợp và thủy phân bằng enzyme (Kim và Lim 2009), và (3) bằng phương pháp vi lỏng hóa (Liu et al 2009) Do sự khác biệt về phương pháp, các hạt nano tinh bột thu được có các đặc tính và độ kết tinh khác nhau
2.3.1 Phương pháp thủy phân a Thủy phân bằng acid
Phương pháp thủy phân bằng acid là phương pháp thực hiện ở nhiệt độ thấp (36 –
40 0 C), sử dụng acid (HCl và H 2 SO 4 ) để thủy phân tinh bột Hạt nano tinh bột sau khi được thu được từ quá trình thủy phân có kích thước, hiệu suất thu hồi và hình dạng khác nhau Các đặc tính hình thái của hạt nano tinh bột phụ thuộc vào nguồn gốc thực vật của tinh bột,
9 độ cứng của nó và tỷ lệ phần trăm amylose và amylopectin (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover 2002).
- Quá trình thủy phân bằng HCl với nồng độ 2.2N: thời gian thủy phân hơn
15 ngày, hiệu suất thu hồi nano 0.5% (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover 2002).
- Quá trình thủy phân bằng H 2 SO 4 với nồng độ 3.16M: thời gian thủy phân 5 –
7 ngày, hiệu suất thu hồi nano 15.7% (Gerard, 2002; Jayakody và Hoover 2002). Ưu điểm: Phương pháp đơn giản Trong quá trình thủy phân tinh bột bằng acid có thể ngăn chặn quá trình hồ hóa tinh bột và phá vỡ cấu trúc tinh bột Khi thu các tinh thể nano tinh bột có xu hướng tự kết tụ ở mức độ thấp và riêng biệt (Sandhu và cộng sự, 2017)
Nhược điểm: Hiệu suất thu hồi nano tinh bột thấp, thời gian thủy phân dài vì vậy làm giảm khả năng sử dụng nano thu được làm chất ổn định trong vật liệu (Sandhu và cộng sự, 2017). b Thủy phân bằng enzyme
Phương pháp được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme để thủy phân tinh bột Các loại enzyme thường được sử dụng như α-amylase, glucoamylase và pullulanase (Hassan và cộng sự, 2022) Theo Qiu và cộng sự (2019), phương pháp thủy phân bằng enzyme là phương pháp hiệu quả nhất để phân hủy tinh bột Điều quan trọng nhất trong quá trình thủy phân bằng enzyme là enzyme pullunase cắt các liên kết α-1,6-glycosidic từ phân tử amylopectin và enzyme α -amylase phân cắt ngẫu nhiên các liên kết α-1,4 -glycosidic trong chuỗi amylose và amylopectin Quá trình thủy phân bằng enzyme này dẫn đến các vết nứt của các hạt tinh bột, dẫn đến việc kích thước của các hạt tinh bột có thể điều chỉnh mức độ thủy phân enzyme phù hợp. (Sun và cộng sự, 2014; Kim và cộng sự, 2008; Foresti và công sự, 2014) Nano tinh bột thu được bằng phương pháp này khoảng 55% Tuy nhiên, quá trình tạo nano tinh bột thường được thực hiện bằng các phương pháp kết hợp với enzyme như kết hợp siêu âm thủy phân enzyme (Lin và cộng sự, 2020) và thủy phân enzyme kết tinh lại (Wang và cộng sự, 2021, Suriya và cộng sự, 2018, CN và cộng sự, 2014). Ưu điểm: Phương pháp này thân thiện với môi trường, hiệu suất thủy phân tinh bột và thu hồi nano cao, thời gian thủy phân thấp, có thể kiểm soát kích thước của các hạt nano tinh bột.
Nhược điểm: tinh thể nano tinh bột kém bền so với các tinh thể nano tinh bột được tạo ra từ quá trình thủy phân bằng acid Enzyme giá thành cao, không phổ biến ở Việt Nam. c Thủy phân kết hợp acid và enzyme
Phương pháp sử dụng kết hợp quá trình thủy phân bằng acid và enzyme, amylase được sử dụng để giảm thiểu thời gian thủy phân bằng acid α - amylase và β – amylase thì β - amylase hiệu quả hơn trong việc sản xuất tinh bột vi xốp có độ kết tinh nguyên vẹn Quá trình tiền xử lý bằng enzyme này đã tạo ra các tuyến đường để axit tiếp cận với các hạt, dẫn đến quá trình thủy phân dễ dàng ở các vùng vô định hình Quá trình thủy phân kết hợp này cũng tuân theo cấu hình động học hai giai đoạn Xử lý trước 2 giờ trước khi thủy phân bằng axit giúp giảm thời gian thủy phân từ 24 giờ xuống còn 6 giờ đối với cùng một mức độ thủy phân LeCorre và cộng sự (2012) cho thấy giảm thời gian thủy phân từ 120 giờ xuống 45 giờ sau 2 giờ tiền xử lý bằng enzym. Ưu điểm: Giảm thời gian thủy phân so với phương pháp thủy phân bằng acid. Nhược điểm: chi phí cao.
2.3.2 Phương pháp tạo kết tủa
Phương pháp kết tủa thường được sử dụng để tổng hợp hạt nano tinh bột vô định hình Trong phương pháp này, tinh bột được hồ hóa sau đó kết tủa bằng dung môi etanol, propanol, isopropanol hoặc butanol ( Kim và Lim (2009) đã sử dụng phương pháp kết tủa để tạo tinh thể nano tinh bột quá trình này hình thành phức hợp để hình thành tinh thể nano, sau đó là thủy phân bằng enzyme để duy trì độ kết tinh Quá trình thủy phân bằng enzyme với α-amylase trong 60 phút đã loại bỏ chất nền xung quanh các tiểu cầu và quan sát thấy các hạt nano hình cầu hoặc hình bầu dục dưới dạng các chùm có kích thước tương đối đồng đều (đường kính 10–20 nm) Chin và cộng sự (2011) đã tổng hợp các hạt nano tinh bột sử dụng công nghệ kết tủa nano bằng cách kết tủa dung dịch tinh bột trong etanol tuyệt đối Hỗn hợp NaOH/ urê (NU) được dùng làm dung môi hòa tan tinh bột Một phần huyền phù được trộn nhẹ và khuấy trong một lượng etanol tuyệt đối Hỗn hợp này sau đó được ly tâm, rửa bằng ethanol và thu được hạt nano tinh bột kết tủa Ma và cộng sự (2008) đã mô tả quá trình tổng hợp hạt nano tinh bột bằng cách kết tủa tinh bột tiền hồ hóa theo liên kết ngang Ethanol được sử dụng làm chất kết tủa và hạt nano tinh bột có kích thước 50–100 nm được hình thành Ưu điểm: tạo ra hạt nano có hình dạng và kích thước có thể kiểm soát được
Nhược điểm: hiệu suất thu hồi nano tinh bột thấp phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm.
2.3.3 Phương pháp vật lý a Phương pháp ép đùn
Phương pháp ép đùn được sử dung rộng rãi và phổ biến trong ngành công nghệ thực phẩm Quá trình này được thực hiện khi cho tinh bột tiếp xúc với áp suất, nhiệt độ và lực cắt cao Tùy vào từng điều kiện trên có những thay đổi về đặc tính hóa lý và cấu trúc hạt nano tinh bột Lai và Kokini (1990) đã báo cáo quá trình hồ hóa không hoàn toàn của các hạt tinh bột do lượng nước hạn chế trong quá trình ép đùn Năm 2000, Giezen et al đã sử dụng máy đùn trục vít đôi và hiệu suất thu hồi nano cao với kích thước nhỏ hơn 400 nm Tương tự, Song (2011) đã sử dụng phương pháp ép đùn để tạo hạt nano tinh bột bằng tác nhân liên kết ngang và kích thước đạt được là khoảng 160 nm Ưu điểm: Phương pháp thân thiện với môi trường, không sử dụng hóa chất, tạo ra hạt nano tinh bột có kích thước nhỏ.
Nhược điểm: Yêu cầu áp suất, nhiệt độ và lực cắt cao b Phương pháp siêu âm
Phương pháp này sử dụng sóng âm thanh có tần số trong khoảng 15–20 kHz Dải tần số này nằm trên phạm vi nghe của con người Đầu dò áp điện hoặc từ tính thường được sử dụng để tạo ra các rung động năng lượng cao Năng lượng này khi phóng đại có thể được sử dụng bằng cách chuyển nó sang đầu dò tiếp xúc trực tiếp với chất lỏng Trong nghiên cứu của Haaj et al (2013) sử dụng huyền phù tinh bột ngô sáp để điều chế nano tinh bột Siêu âm trong bể nước trong 75 phút ở 8 0 C Các quan sát SEM cho thấy rằng hạt nano tinh bột có kích thước khoảng 30–100nm thu được thông qua quá trình này Hiệu quả của siêu âm đối với tinh bột phụ thuộc vào các thông số như công suất siêu âm, điều kiện nhiệt độ, thời gian xử lý, nồng độ tinh bột và nguồn gốc thực vật của tinh bột (Zuo, 2009) Tạo nano tinh bột bằng siêu âm sử dụng nhiều năng lượng, nhiệt độ và thời gian, nhiều nghiên cứu đã sử dụng công suất 24 kHz trong 75 phút, với thời gian xử lý siêu âm tăng dẫn đến kích thước hạt giảm (Bel Haaj và cộng sự, 2013, Bel Haaj và cộng sự, 2019) Trong số các phương pháp vật lý khác nhau để thu được SNPs, siêu âm có lợi hơn vì năng suất được tạo ra tối ưu hơn so với thu được khi sử dụng các phương pháp vật lý khác Năng suất được tạo ra bằng phương pháp siêu âm gần 100%, cao hơn quá trình thủy
12 phân axit vì quá trình thủy phân axit hòa tan một phần vật liệu Chính vì vậy, trong tương lai phương pháp này sẽ rất phổ biến. Ưu điểm: Thời gian xử lý nhanh, năng suất cao, không sử dụng thuốc thử hóa học và tương đối đơn giản, không cần các bước tinh chế (Bel Haaj và cộng sự, 2013, Remanan và cộng sự, 2021).
Nhược điểm: Phương pháp này tốn nhiều năng lượng, làm biến dạng cấu trúc tinh thể, phụ thuộc vào góc nhiễu xạ tia X, cấu trúc vô định hình hoặc kết tinh kém của nano (Bel Haaj và cộng sự, 2013, Remanan và cộng sự, 2021).
Tổng quan về pullulanase (EC 3.2.1.41)
Enzyme pullulanase là một exoenzyme thủy phân tinh bột Nó được sản xuất dưới dạng lipoprotein ngoại bào bởi thực vật, vi khuẩn và nấm mốc (ít phổ biến) Enzyme hoạt động tốt nhất ở pH 4-6 và ở nhiệt độ 55-65 o C (D Byrom và cộng sự, 1987-1988) Pullulanase có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae và Aspergillus usamii không thể tách ra khỏi amylases (Kobayashi và cộng sự, 1953) Pullulanase cũng được chiết xuất từ men bia (Maruo và cộng sự, 1951). 2.4.1 Phân loại
- Loại I cắt liên kết α-1,6-glycosidic trong amylopectin, dextrins, pullulan
- Loại II ít đặc hiệu hơn, có thể cắt liên kết α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic trong tinh bột và dextrins.
-Loại III là enzyme phân nhánh, thiếu khả năng hình thành liên kết Nó chỉ cắt liên kết α-1,6-glycosidic nhưng không có tác dụng với liên kết α-1,4-glycosidic vì vậy phù hợp để phân tách amylopection (Tomasik và cộng sự, 2012).
Khoai tây và đậu tằm là một trong những nguồn thực vật phổ biến của pullulanase (Hobson và cộng sự, 1951) Enzyme từ những nguồn này tạo ra maltose, maltotetraose và dạng vết của maltohexaose từ β-dextrins ngô sáp với tổng lượng là 12.8% (Peat và cộng sự, 1956) Tuy nhiên, pullulanase từ ngô lại tạo ra hàm lượng maltohexaose cao (Endo và cộng sự, 1995) Pullulanase phân lập từ mạch nha chỉ có hoạt tính cao sau khi được tinh sạch hoàn toàn (Maeda và cộng sự, 1978) Bên cạnh đó, gạo cũng là một nguồn pullulanase Pullulanase thực vật có thể hoạt động mạnh hơn pullulanase vi khuẩn, có nghiên cứu đã so sánh hoạt tính của pullulanase lúa và Arthrobacter aerogenes (Line và cộng sự, 1988). b Vi khuẩn và nấm mốc
Các pullulanase của vi khuẩn thường bền nhiệt, ví dụ như các loại từ các chi Clostridium, Thermoanaerobacter và Thermobacteroides (R Koch và cộng sự, 1990) Ngoài các liên kết α-1,6-glycosidic, chúng còn phân cắt liên kết α-1,4-glycosidic như pullulanase từ Bacillus sp 3183 (Saha và cộng sự, 1989) Pullulanase từ B subtilis (Norman, 1982; Takasaki, 1986) là bền nhiệt, nhưng từ B acidopullulyticus lại bị phân hủy ở 60 o C trong vòng 1 giờ sau khi hoạt động ở pH 5, mức tối ưu cho enzyme này Pullulanase được tạo ra bởi chủng Thermus Aquacus YT-1 hoạt động ở độ pH tối ưu 6.4 và
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất
Hạt tam giác mạch (Fagopyrum esculentum) được mua từ Công ty cổ phần phát triển Dũng Hà (quận 12, Tp HCM) dạng hạt khô.
Pullulanase (EC 3.2.1.42): enzyme dạng lỏng được sản xuất bởi
Novozymes Corp và phân phối bởi Sigma-Aldrich.
Glucoamylase (EC 3.2.1.3): enzyme dạng lỏng được sản xuất bởi công ty Angel yeast và phân phối bởi International Food.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Glucoamylase là một enzyme được sử dụng phổ biến trong quá trình tạo nano tinh bột Glucoamylase tác động chủ yếu vào các liên kết α-1,4-glycosidic và tác động chậm hơn vào liên kết α-1,6-glycosidic Điều này cho phép glucoamylase có khả năng phân cắt nhánh Mục tiêu của thí nghiệm này là nghiên cứu tác động của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột Qua đó xác định điều kiện tối ưu để sử dụng glucoamylase sản xuất nano tinh bột từ tinh bột tam giác mạch Kết quả đo kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu tinh bột thủy phân bởi glucoamylase được trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi glucoamylase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau
Nồng độ Thời gian Kích thước Hiệu suất STT Mẫu glucoamylase thủy phân
Bảng 4.1 cho thấy sự thay đổi kích thước và hiệu suất thu hồi nano của các mẫu tinh bột khi tăng dần nồng độ enzyme và thời gian thủy phân Ta thấy kích thước của 9 mẫu đều có sự khác biệt đáng kể, khi tăng nồng độ enzyme (từ 1100 đến 1800 U/g) và thời gian thủy phân từ 2 đến 3 giờ, kích thước nano tinh bột giảm dần Mẫu 3G500 có nồng độ
1800 U/g được thủy phân trong 3 giờ là có kích thước nhỏ nhất (150.9 nm), mẫu 2G300 có
27 nồng độ 1100 U/g được thủy phân trong 2 giờ có kích thước lớn nhất (393.9 nm). Tuy nhiên, tăng thời gian thủy phân từ 3 đến 4 giờ thì kích thước nano tinh bột lại tăng, mẫu 4G500 (204 nm) thủy phân trong 4 giờ có kích thước lớn hơn mẫu 3G500 (150.9 nm) thủy phân trong 3 giờ Nguyên nhân là do thời gian thủy phân quá lâu enzyme glucoamylase đã thủy phân thêm nhiều liên kết α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic làm giảm kích thước phân tử, tạo ra các phân tử đường Vì vậy khi thực hiện đo phân bố kích thước hạt trong nền nước, các phân tử nhỏ đó bị tan trong nước nên chỉ đo được các hạt có kích thước lớn hơn.
Hiệu suất thu hồi nano tinh bột ở 9 điều kiện khảo sát cũng có sự khác biệt đáng kể, khi tăng nồng độ enzyme (từ 1100 đến 1800 U/g) và thời gian thủy phân từ 2 đến 3 giờ, hiệu suất thu hồi nano tinh bột tăng dần Mẫu 3G500 có nồng độ 1800 U/g được thủy phân trong 3 giờ là có hiệu suất thu hồi lớn nhất (11.82%), mẫu 2G300 có nồng độ 1090 U/g được thủy phân trong 2 giờ có hiệu suất thu hồi nhỏ nhất (4.35%) Tuy nhiên khi tăng thời gian thủy phân từ 3 đến 4 giờ thì hiệu suất thu hồi nano tinh bột lại giảm, mẫu 4G500 (8.91%) thủy phân trong 4 giờ lại có hiệu suất thu hồi thấp hơn mẫu 3G500 (11.82%) thủy phân trong 3 giờ Nguyên nhân cũng là do thời gian thủy phân quá lâu, enzyme glucoamylase đã làm giảm kích thước phân tử nano tinh bột nhiều hơn và tạo ra các phân tử đường Do đó lượng cồn sử dụng không đủ để kết tủa các phân tử có khối lượng phân tử thấp, dẫn đến lượng nano tinh bột thu được bị giảm đi Nhìn chung, hiệu suất thu hồi nano tinh bột khi sử dụng glucoamylase thủy phân ở các thời gian khác nhau là thấp (cao nhất là 11.82%) Nguyên nhân là do glucoamylase chủ yếu phân cắt liên kết α-1,4- glycosidic nên phần lớn tinh bột sẽ chuyển thành đường, lượng nano tinh bột thu được giảm Xu hướng này cũng tương đồng với nhiều nghiên cứu trước đây (LeCorre và cộng sự, 2012; Svensson và cộng sự, 1982)
4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột
Pullulanase là enzyme phân nhánh, xúc tác thủy phân tinh bột tại các liên kết α-1,6- glucosidic và một phần nhỏ liên kết α-1,4-glucosidic (Buchholz và cộng sự, 2008) Mục tiêu của thí nghiệm này là nghiên cứu tác động của nồng độ pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất của hạt nano tinh bột Qua đó xác định điều kiện tối ưu để sử dụng pullulanase sản xuất nano tinh bột từ tinh bột tam giác mạch Kết quả đo kích thước và
28 hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi pullulanase được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu nano tinh bột thủy phân bởi pullulanase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau
Nồng độ Thời gian Kích thước Hiệu suất STT Mẫu pullulanase thủy phân
Bảng 4.2 cho thấy sự thay đổi kích thước và hiệu suất của các mẫu nano tinh bột khi tăng dần nồng độ enzyme và thời gian thủy phân Từ Bảng 4.2, kích thước của 9 mẫu thủy phân đều có sự khác biệt đáng kể, khi tăng nồng độ enzyme (100 U/g đến 140 U/g) và thời gian thủy phân từ 2 – 3 giờ, kích thước hạt nano tinh bột giảm dần Mẫu 2P100 thủy phân
2 giờ với nồng độ enzyme 100 (U/g tinh bột) kích thước lớn nhất (286.5 nm), mẫu 3P140 thủy phân 4 giờ, nồng độ enzyme 140 (U/g tinh bột) có kích thước nhỏ 123.7 nm Tuy nhiên, khi tăng thời gian thủy phân từ 3 đến 4 giờ thì kích thước hạt có xu hướng tăng, mẫu 4P140 thủy phân trong 4 giờ với nồng độ enzyme 140 U/g đạt kích thước 200.7 nm lớn hơn so với mẫu 3P140 thủy phân cùng nồng độ trong 3 giờ Nguyên nhân, thời gian thủy phân dài pullulanase tiếp tục phản ứng cắt các liên kết α-1,6-glucosidic và α-1,4-glucosidic trong tinh bột dẫn đến sự hình thành maltotriose và maltose (Hii và cộng sự, 2012) Vì vậy khi thực hiện đo phân bố kích thước trong nền nước, chỉ đo được các phân tử nhỏ không tan trong nước và không đo được các phân tử tan trong nước.
Hiệu suất thu hồi nano tinh bột của 9 mẫu thủy phân có sự khác biệt đáng kể, tương tự như kích thước, khi tăng nồng độ enzyme (100 U/g đến 140 U/g) và thời gian thủy phân
29 từ 2 – 3 giờ, hiệu suất thu hồi nano tinh bột tăng dần Mẫu 2P100 thủy phân 2 giờ với nồng độ enzyme 100 (U/g tinh bột) có hiệu suất thu hồi thấp nhất (48.83%), mẫu 4P140 thủy phân
3 giờ với nồng độ enzyme 140 (U/g) hiệu suất thu hồi (70.29%) Tuy nhiên khi tăng thời gian thủy phân từ 3 đến 4 giờ thì hiệu suất thu hồi nano tinh bột lại giảm, mẫu 3P140 thủy phân
3 giờ cùng nồng độ có hiệu suất cao hơn (70.29%) so với mẫu 4P140 thủy phân 4 giờ (60.42%) Nguyên nhân do thời gian thủy phân càng dài, pullulanase đã làm giảm kích thước phân tử nano tinh bột nhiều hơn và tạo ra các phân tử đường Do đó lượng cồn sử dụng không đủ để kết tủa các phân tử có khối lượng phân tử thấp, dẫn đến lượng nano tinh bột thu được bị giảm đi lượng đường tạo ra càng nhiều và hiệu suất thu hồi nano ở 4 giờ thấp hơn 3 giờ Theo báo cáo của Sun và cộng sự (2014), hiệu suất thu hồi nano tinh bột từ tinh bột ngô sáp xử lý bằng pullulanase đạt đến 85% điều đó minh chứng hiệu suất thu hồi nano tinh bột vượt trội khi sử dụng pullulanase.
Khảo sát sự ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase, thời gian thủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
và pullulanase, thời gian thủy phân 3 giờ đến tính chất hạt nano tinh bột
Từ kết quả của thí nghiệm 1 và 2, mẫu thủy phân bởi glucoamylase với nồng độ 1800 U/g trong 3 giờ và mẫu thủy phân bởi pullulanase với nồng độ 140 U/g trong 3 giờ là có kích thước hạt nhỏ nhất và hiệu suất thu hồi cao nhất Qua đó, chọn giảm 50% nồng độ và kết hợp cả 2 enzyme để khảo sát cho thí nghiệm 3. Kết quả kích thước và hiệu suất thu hồi của các mẫu tinh bột thủy phân kết hợp glucoamylase và pullulanase trong 3 giờ được trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Kích thước và hiệu suất trung bình của các mẫu nano tinh bột thủy phân kết hợp glucoamylase và pullulanase trong thời gian 3 giờ
Nồng độ Nồng độ Kích thước Hiệu suất STT Mẫu glucoamylase pullulanase
Thí nghiệm đã cho thấy sự thay đổi kích thước hạt nano tinh bột khi thay đổi tỷ lệ enzyme glucoamylase và pullulanase Các mẫu có kích thước khác nhau đáng kể, mẫu GP3-70 kết hợp nồng độ glucoamylase 550 U/g và pullulanase 70 U/g có kích thước nhỏ nhất (180.3 nm) và hiệu suất thu hồi lớn nhất (66.03%), mẫu GP5-50 kết hợp nồng độ glucoamylase 900 U/g và pullulanase 50 U/g có kích thước lớn nhất (416.4 nm) và có hiệu suất thu hồi nhỏ nhất (43.83%)
Ta thấy mẫu kết hợp có nồng độ pullulanse cao hơn glucoamylase sẽ thu được hiệu suất thu hồi cao hơn và có kích thước hạt nhỏ hơn Nguyên nhân cũng vì glucoamylase càng nhiều thì khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycosidic càng cao, dẫn đến khả năng tạo ra các phân tử đường, giảm lượng nano tinh bột thu được Ngược lại, pullulanase càng nhiều thì khả năng phân cắt liên kết α-1,6-glycosidic nhiều, phân cắt α-1,4-glycosidic chậm và ít hơn (Hii và cộng sự 2012) nên việc thủy phân quá mức để tạo phân tử đường sẽ hạn chế xảy ra hơn, lượng nano tinh bột thu được tăng
Kết quả của các thí nghiệm 1, 2, 3 cho thấy sử dụng riêng lẻ enzyme glucoamylase để thủy tinh bột không đạt hiệu suất thu hồi cao và không phù hợp để tạo nano tinh bột Trong khi đó, enzyme pullulanase lại cho thấy khả năng thủy phân vừa tạo ra hạt nano tinh bột có kích thước nhỏ, vừa có hiệu suất thu hồi cao Dù vậy, thí nghiệm sử dụng kết hợp
31 hai loại enzyme glucoamylase và pullulanase không tạo ra mẫu nano tinh bột có kích thước nhỏ vượt trội hay hiệu suất thu hồi cao hơn so với mẫu chỉ sử dụng enzyme pullulanase.
