(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu sự lưu hành của avian metapneumovirus (ampv) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền bắc việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM LÊ BÁ HIỆP NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA U SỰ LƯU HÀNH CỦA LƯU HÀNH CỦA U HÀNH CỦA A AVIAN METAPNEUMOVIRUS (aMPV) Ở GÀ NUÔI TẠI GÀ NUÔI TẠII MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAMT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAMNH MIỀN BẮC VIỆT NAMN BẮC VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM Ngành: Thú y Mã số:: 8.64.01.01 Người hướng dẫ n khoa học:i hướng dẫ n khoa học:ng dẫ n khoa học: n khoa học:c: PGS.TS Hu ỳnh Thị Mỹ Lệ Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẨN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam kết luận văn hoàn thành kết nghiên cứu thực tế khuôn khổ đề tài tiềm cấp Bộ: “Nghiên cứu lưu hành Avian Metapneumovirus (aMPV) bệnh hô hấp phức hợp gà nuôi miền Bắc", Ban hành kèm theo Quyết định số 4757/QĐ-BNN-KHCN ngày 12 tháng 12 năm 2019 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp PTNT, giai đoạn 2020-2021 Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố nghiên cứu liên quan lĩnh vực Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Lê Bá Hiệp i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, em sinh viên thực tập tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc, cán nhân viên phịng chẩn đốn, xét nghiệm thú y Greenlab, Công ty Cổ phần Medion Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Lê Bá Hiệp ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ix THESIS ABSTRACT xi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA NGHIÊN CỨU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 HIỂU BIẾT VỀ AVIAN METAPNEUMOVIRUS 2.1.1 Cấu trúc virus 2.1.2 Phân loại virus .4 2.1.3 Đặc tính sinh miễn dịch 2.1.4 Sức đề kháng virus .7 2.1.5 Các phương pháp xét nghiệm aMPV thường quy 2.2 BỆNH DO AVIAN METAPNEUMOVIRUS GÂY RA .10 2.2.1 Lịch sử Phân bố .10 2.2.2 Tổn thất kinh tế 11 2.2.3 Loài mắc bệnh .11 2.2.4 Truyền lây .12 2.2.5 Triệu chứng 13 2.2.6 Bệnh tích .15 2.2.7 Phòng trị bệnh 15 2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ AMPV 17 iii 2.3.1 Nghiên cứu nước .17 2.3.2 Nghiên cứu nước 18 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24 3.1.1 Địa bàn lấy mẫu nghiên cứu 24 3.1.2 Nơi thực kỹ thuật phịng thí nghiệm 24 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 24 3.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu .24 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 24 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 25 3.4.1 Sự lưu hành kháng thể kháng aMPV 25 3.4.2 Sự lưu hành aMPV gà nuôi số tỉnh miền Bắc 25 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.5.1 Phương pháp lấy mẫu .26 3.5.2 Phương pháp tách ARN 26 3.5.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 27 3.5.4 Phương pháp RT-PCR phát định aMPV 27 3.5.5 Phương pháp phân tích trình tự gen 28 3.5.6 Phương pháp ELISA gián tiếp .28 3.5.7 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 29 3.5.8 Xử lý số liệu 29 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 SỰ LƯU HÀNH KHÁNG THỂ KHÁNG aMPV 30 4.1.1 Tỷ lệ dương tính huyết học theo địa phương 30 4.1.2 Tỷ lệ dương tính huyết học theo giống gà 33 4.1.3 Tỷ lệ dương tính huyết học theo lứa tuổi gà 35 4.1.4 So sánh biến động hiệu giá kháng thể nhóm nhóm gà hướng thịt dương tính với kháng thể kháng aMPV 39 4.1.5 Tỷ lệ dương tính huyết học theo loại hình chuồng trại .41 iv 4.1.6 Tỷ lệ dương tính huyết học theo quy mơ chăn nuôi .43 4.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA aMPV Ở GÀ NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC 44 4.2.1 Kiểm tra khả phát aMPV phản ứng RT-PCR .44 4.2.2 Kết phát aMPV mẫu bệnh phẩm .45 4.2.3 Phân tích trình tự gen chủng aMPV phát miền Bắc 49 4.2.4 Phân tích mối liên hệ di truyền chủng aMPV miền Bắc .51 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1 KẾT LUẬN 55 5.2 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải Aa : Amino acid aMPV : Avian metapneumovirus aMPV/A : Avian metapneumovirus subtype A aMPV/B : Avian metapneumovirus subtype B aMPV/C : Avian metapneumovirus subtype C aMPV/D : Avian metapneumovirus subtype D ARN : Axit ribonucleic Bp : Base pair dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HI : Hemagglutination inhibition hMPV : Human metapneumovirus IBV : Infectious Bronchitis virus iELISA : Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ILT : Infectious laryngotracheitis IPT : Immunoperoxidase Technique kb : Kilobase kDa : Kilodalton mRNA : Messenger Ribonucleic acid Nt/Nu : Nucleotide OCT : Optimal cutting temperature ORT : Ornithobacterium rhinotracheale PBS : Phosphat Buffer Saline RSV : Respiratory syncytial virus RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction SNT : Serum neutralization test SHS : Swollen head syndrome TCID50 : Median Tissue Culture Infectious Dose TRT : Turkey rhinotracheitis VNT : Virus Neutralisation Test vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi giám định xác định subtype aMPV Bảng 2.2 Các vacxin lưu hành Việt Nam cấp phép cục thú y 17 Bảng 3.1 Trình tự mồi đặc hiệu giám định định aMPV 27 Bảng 4.1 Kết xác định dương tính huyết học theo số mẫu theo trại địa phương 31 Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính huyết học theo giống gà 34 Bảng 4.3 Tỷ lệ dương tính huyết học theo loại hình chuồng trại 42 Bảng 4.4 Tổng hợp triệu chứng, bệnh tích gà nghi mắc bệnh aMPV 47 Bảng 4.5 Tổng hợp kết phát aMPV mẫu bệnh phẩm 48 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc gen thành viên họ Pneumovirus Paramyxoviridae Hình 2.2 Mối liên hệ di truyền aMPV hMPV dựa vào trình tự gen .5 Hình 4.1 Phản ứng ELISA phát kháng thể kháng aMPV 30 Hình 4.2 Tỷ lệ dương tính kháng thể kháng aMPV theo địa điểm 32 Hình 4.3 Tỷ lệ dương tính huyết học theo lứa tuổi 38 Hình 4.4 Sự biến động kháng thể nhóm gà hướng thịt dương tính với kháng thể kháng aMPV theo nhóm tuổi 41 Hình 4.5 Tỷ lệ dương tính kháng thể kháng aMPV theo quy mơ chăn ni 44 Hình 4.6 Kết phân tích tính đặc hiệu phản ứng RT-PCR 45 Hình 4.7 Triệu chứng bệnh tích gà nghi mắc bệnh aMPV 46 Hình 4.8 Kết phản ứng RT-PCR phát aMPV mẫu 47 Hình 4.9 Trình tự nucleotide 1- 220 gen mã hóa protein G .49 Hình 4.10 Trình tự nucleotide 221- 429 gen mã hóa protein G 50 Hình 4.11 Trình amino acid gen mã hóa protein G 51 Hình 4.12 Cây phát sinh chủng loại aMPV dựa vào gen mã hóa protein G 52 Hình 4.13 Nhánh phát sinh chủng loại dẫn tới chủng aMPV Việt Nam 54 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Bá Hiệp Tên Luận văn: Nghiên cứu lưu hành Avian metapneumovirus (aMPV) gà nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Ngành: Thú y Mã số: 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Trả lời câu hỏi có/khơng có Avian metapneumovirus lưu hành gà nuôi số tỉnh miền Bắc – Việt Nam; - Xác định subtype Avian metapneumovirus lưu hành số tỉnh miền Bắc – Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Để nghiên cứu nội dung: Nghiên cứu lưu hành huyết học aMPV gà nhà theo đặc điểm dịch tễ (địa phương, giống lồi, tuổi, quy mơ chăn ni, phương thức chăn nuôi) Các mẫu huyết thu thập ngẫu nghiên (7-21 mẫu/trang trại) theo đặc điểm dịch tễ ứng dụng kỹ thuật ELISA gián tiếp (indirect ELISA) để phát kháng thể kháng aMPV Các mẫu bệnh phẩm (xương ống cuộn, khí quản) thu từ gà có biểu hội chứng sưng phù đầu aMPV dạng mẫu gộp 3- mẫu/mẫu gộp, trường hợp trại mẫu gộp: Phương RT-PCR sử dụng mồi giải trình tự gen mã hóa gen G (Ga/Gy) aMPV ứng dụng cho xác nhận aMPV mẫu Sản phẩm RT-PCR giải trình tự phương pháp Sanger Các phần mềm tin sinh học chuyên dụng BioEdit, DnaSP, MEGA BEAST sử dụng để phân tích trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Kết kết luận Nghiên cứu thực thu thập 359 mẫu huyết gà, từ 29 trang trại thuộc 10 tỉnh thành miền Bắc nhằm xác định lưu hành kháng thể kháng aMPV Kết quả, xác định dương tính kháng thể kháng aMPV đàn gà nuôi 8/10 tỉnh, thành phố miền Bắc, với tỷ lệ dương tính trung bình theo mẫu 36,2% (130/359) Các đàn gà thuộc nhiều giống khác nhau, song dương tính với kháng thể kháng aMPV, gà trắng siêu thịt có tỷ lệ thấp (8,2%), tiếp đến nhóm gà lai (35,0%) cao nhóm gà địa (48,8%) Tỷ lệ dương tính trung bình nhóm tuổi 23,1% (22- 42 ngày tuổi); 33,2% (43- 90 ngày tuổi); 61,5% (91- 120 ix