Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Chúng tôi đã tiến hành đánh giá chất lượng tinh dịch của 33 lợn đực giống
“bố mẹ”, trong đó có 10 Landrace, 10 Yorkshire, 5 PiDu, 5 Móng Cái và 3 đực Rừng
- Các lợn đực giống từ 2 – 4 năm tuổi, đã qua kiểm tra năng suất cá thể.
- Các lợn đực giống có cùng chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, chuồng trại. 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm giống lợn Đông Mỹ -Công ty Cổ phần giống chăn nuôi Thái Bình trong thời gian từ tháng7/2015 đến tháng 5/2016.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Đánh giá chất lượng tinh dịch lợn thông qua các chỉ tiêu
- Chỉ tiêu tổng hợp VAC
- Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
- Sức kháng của tinh trùng.
3.2.2 Ảnh hưởng của mùa vụ trong năm đến chất lượng tinh dịch lợn Đánh giá chất lượng tinh dịch lợn theo các mùa xuân, hè, thu, đông.
Phương pháp nghiên cứu
- Lợn đực giống được khai thác tinh vào sáng sớm, chế độ khai thác theo từng giống.
- Phương pháp khai thác bằng nhảy giá, kỹ thuật khai thác tinh bằng tay bởi các kỹ thuật viên lành nghề.
+ Đối với lợn đực giống Landrace, Yorkshire và Móng cái là 3 ngày /lần.
+ Đối với lợn đực PiDu và Rừng là 4 hoặc 5 ngày/lần tùy theo nhu cầu thực tế sản xuất tại Công ty.
- Dụng cụ lấy tinh được vô trùng trước khi sử dụng.
3.3.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh dịch lợn
- Chất lượng tinh dịch được kiểm tra theo tiêu chuẩn Quốc gia do Bộ khoa học và Công nghệ công bố.
Bảng 3.1 Một số tiêu chuẩn về chất lượng tinh dịch của lợn đực giống
Chỉ tiêu Đơn vị Đực ngoại Đực nội
(TCVN9111:2011) (TCVN 9713:2013) Thể tích tinh dịch, V ml/lần > 220 > 150
Nồng độ tinh trùng, C triệu/ml > 250 > 200
Chỉ tiêu VAC tỷ/lần > 44 > 21
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, K % 15 15 pH tinh dịch
Sức kháng của tinh trùng, R
Nguồn: Bộ Khoa học và Công nghệ
- Xác định thể tích tinh dịch hay lượng xuất tinh V (ml/lần)
Thể tích tinh dịch là lượng tinh dịch của lợn đực trong một lần xuất tinh sau khi đã lọc bỏ keo phèn Thể tích tinh dịch được xác định bằng cốc đong, có phân định mức ml, trên miệng đặt 3 - 4 lớp vải gạc đã khử trùng để lọc chất keo nhầy khi tinh dịch chảy vào cốc trên mặt phẳng nằm ngang Đọc kết quả ở mặt cong dưới Sau đó đưa cốc tinh dịch vào tủ ấm bảo quản ở 38,5 o C.
- Xác định hoạt lực tinh trùng A (%)
Kiểm tra ngay sau khi tinh dịch vừa lấy ra khỏi cơ thể lợn đực giống trong vòng 5-10 phút, ở nhiệt độ 38,5 0 C trên kính hiển vi kết nối với máy tính OPTIKA của Italy có độ phóng đại 1.000 lần.
Dùng đũa thuỷ tinh sạch, lấy một giọt tinh nguyên đặt trên phiến kính sạch và ấm (38,5 0 C) Dùng 1 la-men kính khô sạch, đậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được giàn đều ra 4 cạnh của lá kính, đặt tiêu bản lên kính hiển vi để đếm với độ phóng đại 1.000 lần Tiến hành ước lượng tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng có trong vi trường.
Hoạt lực tinh trùng được xác định theo thang điểm của Milovanov (1932)
Bảng 3.2 Thang điểm đánh giá hoạt lực của tinh trùng theo Milovanov (1932)
- Nồng độ tinh trùng, C (triệu/ml): là số tinh trùng có trong 1ml tinh nguyên Cách xác định: bằng máy so màu quang phổ CO7500 của Anh.
+ Đo độ hấp thu của tinh dịch lợn bằng bước sóng: 550 nm (490 – 590nm)
+ Trước hết đưa về 0 (lấy 10 ml môi trường vào ống cuvet đặt vào máy ấn nút R để trở về trạng thái ban đầu).
+ Pha loãng tinh dịch: Sử dụng 1 pipet tự động được chia vạch lấy 1 ml tinh nguyên: 9 ml môi trường (1:10), đưa tinh dịch đã được pha loãng vào ống cuvet sau đó đặt lên máy so màu và đọc kết quả độ hấp thu.
Nồng độ tinh trùng được xác định theo độ hấp thu ở bảng sau:
Bảng 3.3 Độ hấp thu của nồng độ tinh trùng Độ hấp thu Nồng độ (triệu /ml)
- Nồng độ tinh trùng của mỗi đực giống được đo 2 lần và lấy giá trị trung bình
- Xác định chỉ tiêu tổng hợp VAC hay tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỷ/lần khai thác):
VAC được tính bằng tích của 3 chỉ tiêu: thể tích (V), sức hoạt động của tinh trùng (A) và nồng độ tinh trùng (C).
- Xác định pH tinh dịch: bằng giấy đo pH của Đức Nhúng ngập giấy vào tinh dịch và đọc kết quả sau 5 giây Làm 3 lần rồi lấy giá trị trung bình.
- Xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K (%):
Nhỏ một giọt tinh nguyên lên phiến kính khô sạch đã tẩy mỡ Nếu tinh dịch đặc, có thể pha loãng bằng vài ba giọt dung dịch nước sinh lý 0,85%, dùng đầu đũa thuỷ tinh sạch trộn đều hỗn hợp này Dùng cạnh của phiến kính khác (hoặc lam kính) phiết nhẹ giọt tinh dịch để dàn mỏng ra trên phiến kính (đẩy nhẹ 1 lần đều tay, không chà xát đẩy tới kéo lui nhiều lượt) Để cho lớp tinh dịch tự khô trong không khí, sau khi tinh dịch đã khô, hơ qua ngọn lửa đèn cồn Sau đó dùng thuốc nhuộm bằng xanh metylen để nhỏ đều lên mặt lớp tinh dịch đã khô, đợi cho thuốc nhuộm ngấm (mùa hè 5-7 phút, mùa đông từ 10-15 phút) Dùng nước cất rửa sạch tiêu bản, để tiêu bản tự khô hoặc hơ lên ngọn lửa đèn cồn, rồi đưa lên kính hiển vi quan sát với độ phóng đại 1.000 lần Lần lượt quan sát đều khắp tiêu bản, đếm số tinh trùng kỳ hình và số tinh trùng không kỳ hình rồi xác định số tinh trùng kỳ hình và tính theo công thức: n
N Trong đó: K (%) là = tỷ lệ tinh trùng kỳ hình; n là = số tinh trùng kỳ hình đếm được và N là = tổng số tinh trùng (kỳ hình và không kỳ hình) đếm được.
- Sức kháng của tinh trùng (R):
Hiện nay chúng ta thường sử dụng phương pháp của Milovanov (1952). + Phương pháp kiểm tra sức kháng của tinh trùng lợn ngoại, lợn lai Dùng ba ống nghiệm (hoặc ba lọ) có dung tích 10 ml và đánh số thứ tự 1, 2,
3 Dùng pipet hút dung dịch NaCl 1% (đã được thanh trùng từ trước) cho vào ống 1: 5 ml, ống 2: 1 ml, ống 3: 0,5 ml Dùng micropipet hút 0,01 ml tinh nguyên cho vào ống 1, lắc nhẹ cho đều Như vậy ở ống 1 tinh dịch được pha loãng 500 lần (500x0,01) Hút 1 ml hỗn dịch ở ống 1 sang ống 2, lắc nhẹ để hỗn dịch đều Như vậy hỗn dịch ở ống 2 được pha loãng là
1000 lần (500 x 2) Dùng ống hút khác hút 0,5 ml hỗn dịch ở ống 2 sang ống 3 Như vậy ở ống 3 được pha loãng là 2.000 lần (1.000x2). Dùng đũa thủy tinh khô sạch lấy 1 giọt hỗn hợp ở ống 3 cho lên phiến kính đã rửa sạch sấy khô, dàn mỏng và nâng nhiệt độ 40 0 - 41 0 C và đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 160 lần trở lên để kiểm tra (A) Nếu thấy tinh trùng còn tiến thẳng thì thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào ống thứ 3, mức pha loãng sẽ là 2.200 lần (1,1 ml x 2.000) Sau đó lại kiểm tra A. Nếu thấy tinh trùng còn tiến thẳng lại thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1%. Công việc được tiến hành lặp đi lặp lại cho đến khi nào không còn tinh trùng tiến thẳng nữa thì dừng lại.
Sức kháng của tinh trùng được tính theo công thức:
R = V/v (1) Trong đó: R là sức kháng của tinh trùng; V là lượng dung dịch NaCl 1% đã sử dụng và v là lượng tinh dịch đã dùng để kiểm tra. Trong quá trình tiến hành, vì phải pha chuyển 3 ống, để khỏi nhầm lẫn, người ta đã biến đổi công thức trên trở thành công thức tổng quát sau:
Trong đó: R là = sức kháng của tinh trùng; r 0 là = mức pha loãng tinh dịch ở ống thứ 3 (ở đây là 2000 lần); r là = mức pha loãng của mỗi lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% (r = 200); n là = số lần thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1%
Công thức tổng quát trên có thể sử dụng để tính sức kháng của hầu hết các loại gia súc gia cầm.
+ Phương pháp kiểm tra sức kháng tinh trùng của lợn nội
Do sức kháng tinh trùng của lợn nội thấp nên chúng ta chỉ dùng phương pháp hai lọ Dùng hai ống nghiệm (hoặc hai lọ) có dung tích 10 ml rửa sạch, sấy khô ghi thứ tự lọ 1, 2 Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch NaCl 1% cho vào lọ 1 và 0,5 ml cho vào lọ 2 Nhỏ 0,01 ml tinh nguyên vào lọ 1 Lắc nhẹ cho đều, tinh dịch được pha loãng 500 lần (5: 0,01) Hút 0,5 ml hỗn hợp đó từ lọ 1 sang lọ 2, lắc nhẹ trộn đều Tinh dịch được pha loãng 1.000 lần (500x2) Dùng một phiến kính rửa sạch, sấy khô Lấy 1 giọt hỗn hợp ở lọ 2 nhỏ lên phiến kính Dùng đũa thủy tinh dàn mỏng (nhẹ nhàng, càng mỏng càng tốt) Nâng nhiệt độ lên 40 0 C –
Đặt tinh dịch pha loãng ở nhiệt độ 41 độ C vào kính hiển vi có độ phóng đại 160 lần để kiểm tra hoạt lực Nếu còn tinh trùng tiến thẳng, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% và tiếp tục kiểm tra Lặp lại quá trình này cho đến khi không còn tinh trùng tiến thẳng Sử dụng công thức tính sức kháng tổng quát (2), với r = 100 và r = 1.000 để tính sức kháng của tinh trùng Trong thụ tinh nhân tạo, sức kháng của tinh trùng lợn ngoại phải lớn hơn hoặc bằng 3000 lần, còn lợn nội phải lớn hơn hoặc bằng 1.500 lần.
3.3.3 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tinh dịch Số liệu khai thác tinh dịch lợn tại Trung tâm theo các mùa (xuân, hè, thu, đông) trong năm để phân được sử dụng để phân tích đánh giá chất lượng tinh dịch lợn.
3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu được thu thập tại Trung tâm giống lợn Đông Mỹ từ tháng 9 năm 2013 đến tháng 6 năm 2015.
- Số liệu trực tiếp thực nghiệm từ tháng 7 năm 2015 đến tháng 5 năm 2016
- Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và SAS 9.1 (2002).
