Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và điều trị một số bệnh tăng sinh tủy ác tính giai đoạn 20152018 tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN VŨ BẢO ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, XÉT NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH TĂNG SINH TỦY ÁC TÍNH GIAI ĐOẠN 2015 - 2018 TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN VŨ BẢO ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, XÉT NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH TĂNG SINH TỦY ÁC TÍNH GIAI ĐOẠN 2015 - 2018 TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành : Huyết học Truyền máu Ngành : Nội khoa Mã số : 9720107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hà Thanh TS Dương Quốc Chính HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án sau q trình học tập, tơi vơ biết ơn: Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học, Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, khoa Bệnh máu tổng hợp, Di truyền - Sinh học phân tử, Tế bào - Tổ chức học, phòng ban giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, thu thập số liệu tiến hành nghiên cứu PGS TS Nguyễn Hà Thanh TS Dương Quốc Chính, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn chia sẻ cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án GS TS Phạm Quang Vinh, Ban chủ nhiệm thầy cô Bộ môn Huyết học, Trường Đại học Y Hà Nội truyền thụ kiến thức, kinh nghiệm giúp đỡ từ ngày đường học tập, làm việc nghiên cứu TS Bạch Quốc Khánh, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, người dạy bảo tận tình, lan tỏa tình u nghề giúp tơi có điều kiện tốt để phát triển chuyên môn, nghiên cứu hoàn thành luận án BSCKII Võ Thị Thanh Bình, trưởng khoa Ghép tế bào gốc tập thể bác sĩ điều dưỡng khoa tạo điều kiện tốt giúp đỡ q trình học tập, thực nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người bệnh gia đình người bệnh hợp tác tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu Cuối cùng, vô biết ơn cha mẹ, vợ con, người thân đồng nghiệp quan tâm, động viên, chỗ dựa vững giúp tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nguyễn Vũ Bảo Anh LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Vũ Bảo Anh, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học - Truyền máu, xin cam đoan: Đây là luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Hà Thanh và TS Dương Quốc Chính Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu nào khác công bố Việt Nam Những số liệu, kết nêu luận án hồn tồn xác, trung thực, khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Nguyễn Vũ Bảo Anh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASO-PCR Allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi oligonucleotide đặc hiệu alen) BAT Best available therapy (Liệu pháp điều trị tối ưu có) BCTT Bạch cầu trung tính CALR Calreticulin CML Chronic Myelogenous Leukemia (Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt) DIPSS Dynamic International Prognostic Scoring System (Điểm tiên lượng quốc tế linh hoạt) ELN European LeukemiaNet (Mạng lưới lơ xê mi châu Âu) EPO Erythropoietin ET Essential thrombocythemia (Tăng tiểu cầu tiên phát) G-CSF Granulocyte colony stimulating factor (Yếu tố kích thích tạo cụm dịng bạch cầu hạt) Hb Huyết sắc tố Hct Hematocrit JAK2 Janus kinase LBHT Lui bệnh hoàn toàn LBMP Lui bệnh phần LDH Lactat dehydrogenase LXM Lơ xê mi IPSET International Prognostic Score of thrombosis for ET (Điểm tiên lượng quốc tế huyết khối tăng tiểu cầu tiên phát) MDS Myelodysplastic syndrom (Hội chứng rối loạn sinh tủy) MPL Myeloproliferative leukemia virus oncogene (gen mã hóa thụ thể thrombopoietin) MPNs Myeloproliferative Neoplasms (Các bệnh tăng sinh tủy ác tính) MTC Mẫu tiểu cầu NGS Next generation sequencing (Giải trình tự gen hệ mới) NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) PMF Primary myelofibrosis (Xơ tủy nguyên phát) PV Polycythemia vera (Đa hồng cầu nguyên phát) PVSG Polycythemia vera study group (Nhóm nghiên cứu bệnh Đa hồng cầu nguyên phát) RARS-T Refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis (Thiếu máu dai dẳng tăng ngun hồng cầu sắt vịng có số lượng tiểu cầu cao) RT - PCR Reverse transcriptase Polymerase chain reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược) RCM Red cell mass (thể tích khối hồng cầu toàn thể) SLBC Số lượng bạch cầu SLHC Số lượng hồng cầu SLTC Số lượng tiểu cầu STAT Signal transducer and activator of transcription (Phân tử truyền tín hiệu hoạt hóa phiên mã) VAF Variant allele frequency (Tần suất biến thiên alen) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế Giới) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử xếp loại bệnh tăng sinh tủy ác tính 1.2 Cơ sở di truyền sinh học phân tử bệnh tăng sinh tủy ác tính 1.2.1 Con đường tín hiệu JAK-STAT 1.2.2 Đột biến gen JAK2 1.2.3 Đột biến gen MPL 1.2.4 Đột biến gen CALR 10 1.2.5 Hoạt hóa đường JAK-STAT đột biến bệnh tăng sinh tủy ác tính 12 1.3 Bệnh đa hồng cầu nguyên phát 16 1.3.1 Dịch tễ học 16 1.3.2 Triệu chứng lâm sàng 16 1.3.3 Xét nghiệm 19 1.3.4 Chẩn đoán 21 1.3.5 Điều trị 22 1.4 Bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 24 1.4.1 Dịch tễ học 24 1.4.2 Triệu chứng lâm sàng 24 1.4.3 Xét nghiệm 25 1.4.4 Chẩn đoán 26 1.4.5 Điều trị 27 1.5 Bệnh xơ tủy nguyên phát 29 1.5.1 Dịch tễ học 29 1.5.2 Triệu chứng lâm sàng 29 1.5.3 Xét nghiệm 31 1.5.4 Chẩn đoán 33 1.5.5 Điều trị 34 1.6 Tình hình nghiên cứu bệnh tăng sinh tủy ác tính và ngoài nước 38 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Đối tượng nghiên cứu 41 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 41 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 42 2.2.2 Mẫu cách chọn mẫu 42 2.2.3 Nội dung thông số nghiên cứu 43 2.2.4 Vật liệu kỹ thuật nghiên cứu 49 2.2.5 Các tiêu chuẩn xếp loại và đánh giá đáp ứng 51 2.3 Xử lý phân tích số liệu 58 2.4 Đạo đức nghiên cứu 58 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 60 Chương KẾT QUẢ 61 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu 61 3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo thể bệnh 61 3.1.2 Đặc điểm tuổi giới 61 3.2 Một số đặc điểm lâm sàng xét nghiệm bệnh nhân tăng sinh tủy ác tính 63 3.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng 63 3.2.2 Một số đặc điểm xét nghiệm 66 3.2.3 Liên quan đột biến gen số biểu lâm sàng xét nghiệm 77 3.3 Kết điều trị sống thêm toàn bệnh nhân tăng sinh tủy ác tính 82 3.3.1 Kết điều trị bệnh nhân ET 82 3.3.2 Kết điều trị bệnh nhân PV 84 3.3.3 Kết điều trị bệnh nhân PMF 86 3.3.4 Sống thêm toàn bệnh nhân số yếu tố liên quan 88 Chương BÀN LUẬN 99 4.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu 99 4.1.1 Đặc điểm tuổi 99 4.1.2 Đặc điểm giới 101 4.2 Một số đặc điểm lâm sàng xét nghiệm bệnh nhân tăng sinh tủy ác tính 101 4.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng 101 4.2.2 Một số đặc điểm xét nghiệm 113 4.2.3 Đặc điểm đột biến gen 122 4.2.4 Liên quan đột biến gen với số đặc điểm sinh học bệnh nhân 127 4.3 Kết điều trị sống thêm toàn bệnh nhân tăng sinh tủy ác tính 131 4.3.1 Đáp ứng điều trị huyết học nhóm bệnh nhân nghiên cứu 131 4.3.2 Sống thêm tồn nhóm bệnh nhân nghiên cứu 135 4.3.3 Liên quan đột biến gen với sống thêm toàn 136 KẾT LUẬN 139 KIẾN NGHỊ 141 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Xếp loại bệnh tăng sinh tủy ác tính theo WHO – 2008 Bảng 1.2: Các đột biến gây bệnh tăng sinh tủy ác tính Bảng 1.3: Phân nhóm nguy bệnh nhân PV 22 Bảng 1.4: Phân nhóm nguy ET theo điểm IPSET - thrombosis sửa đổi 27 Bảng 1.5: Điểm tiên lượng DIPSS bệnh nhân PMF 34 Bảng 2.1: Phân độ xơ hóa tủy xương 54 Bảng 2.2: Phân nhóm nguy PV 55 Bảng 2.3: Phân nhóm nguy ET theo điểm IPSET – thrombosis sửa đổi 55 Bảng 2.4: Phân nhóm nguy PMF theo điểm DIPSS 55 Bảng 2.5: Tiêu chuẩn đáp ứng điều trị PV theo ELN 2011 56 Bảng 2.6: Tiêu chuẩn đáp ứng điều trị ET theo ELN 2011 56 Bảng 2.7: Một số tiêu chuẩn đáp ứng điều trị PMF theo ELN 2013129 57 Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo thể bệnh 61 Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo tuổi giới 61 Bảng 3.3: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi thể bệnh 62 Bảng 3.4: Phân bố bệnh nhân theo giới thể bệnh 62 Bảng 3.5: Một số triệu chứng lâm sàng thể bệnh 63 Bảng 3.6: Một số đặc điểm huyết khối thể bệnh 64 Bảng 3.7: Đặc điểm lách to thể bệnh 65 Bảng 3.8: Phân nhóm nguy thể bệnh 66 Bảng 3.9: Một số đặc điểm tế bào máu ngoại vi thể bệnh 67 Bảng 3.10: Thay đổi lượng Hb thể bệnh 68 Bảng 3.11: Thay đổi SLBC thể bệnh 68 Bảng 3.12: Thay đổi SLTC thể bệnh 69 Bảng 3.13: Đặc điểm số chỉ số đông máu thể bệnh 70 Bảng 3.14: Một số đặc điểm hóa sinh máu thể bệnh 70 158 Dan K, Yamada T, Kimura Y, et al Clinical features of polycythemia vera and essential thrombocythemia in Japan: retrospective analysis of a nationwide survey by the Japanese Elderly Leukemia and Lymphoma Study Group Int J Hematol 2006;83(5):443-9 159 Pich A, Riera L, Francia di Celle P, Beggiato E, Benevolo G, Godio L JAK2V617F, CALR, and MPL Mutations and Bone Marrow Histology in Patients with Essential Thrombocythaemia Acta Haematol 2018;140(4):234-239 160 Silver RT, Chow W, Orazi A, Arles SP, Goldsmith SJ Evaluation of WHO criteria for diagnosis of polycythemia vera: a prospective analysis Blood 2013;122(11):1881-6 161 Lussana F, Carobbio A, Randi ML, et al A lower intensity of treatment may underlie the increased risk of thrombosis in young patients with masked polycythaemia vera Br J Haematol 2014;167(4):541-6 162 Barbui T, Thiele J, Carobbio A, et al Masked polycythemia vera diagnosed according to WHO and BCSH classification Am J Hematol 2014;89(2):199-202 163 Barosi G Essential thrombocythemia vs early/prefibrotic myelofibrosis: why does it matter Best Pract Res Clin Haematol 2014;27(2):129-40 164 Gong X, Lu X, Xiao X, et al Clinicopathologic characteristics of prefibrotic–early primary myelofibrosis in Chinese patients Human Pathology 2014;45(3):498-503 165 Kvasnicka HM, Thiele J Classification of Ph-negative chronic myeloproliferative disorders morphology as the yardstick of classification Pathobiology 2007;74(2):63-71 166 Brousseau M, Parot-Schinkel E, Moles MP, Boyer F, Hunault M, Rousselet MC Practical application and clinical impact of the WHO histopathological criteria on bone marrow biopsy for the diagnosis of essential thrombocythemia versus prefibrotic primary myelofibrosis Histopathology 2010;56(6):758-67 167 Misawa K, Yasuda H, Araki M, et al Mutational subtypes of JAK2 and CALR correlate with different clinical features in Japanese patients with myeloproliferative neoplasms International Journal of Hematology 2018;107(6):673-680 168 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders N Engl J Med 2005;352(17):1779-90 169 Lundberg P, Karow A, Nienhold R, et al Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms Blood 2014;123(14):2220-8 170 Pardanani A, Guglielmelli P, Lasho TL, et al Primary myelofibrosis with or without mutant MPL: comparison of survival and clinical features involving 603 patients Leukemia 2011;25(12):1834-1839 171 Alvarez-Larran A, Martínez D, Arenillas L, et al Essential thrombocythaemia with mutation in MPL: clinicopathological correlation and comparison with JAK2V617F-mutated and CALR-mutated genotypes J Clin Pathol 2018;71(11):975-980 172 Tefferi A, Wassie EA, Guglielmelli P, et al Type versus Type calreticulin mutations in essential thrombocythemia: a collaborative study of 1027 patients Am J Hematol 2014;89(8):E121-4 173 Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or 2014;124(7):1062-9 MPL in primary myelofibrosis Blood 174 Chua CC, Omerod A, Wight J, Juneja S, Zantomio D Correlation of mutation status and morphological changes in essential thrombocythaemia and myelofibrosis Pathology 2018;50(6):671-674 175 Vytrva N, Stacher E, Regitnig P, et al Megakaryocytic morphology and clinical parameters in essential thrombocythemia, polycythemia vera, and primary myelofibrosis with and without JAK2 V617F Arch Pathol Lab Med 2014;138(9):1203-9 176 Carobbio A, Finazzi G, Antonioli E, et al Hydroxyurea in essential thrombocythemia: rate and clinical relevance of responses by European LeukemiaNet criteria Blood 2010;116(7):1051-5 177 Crodel CC, Jentsch-Ullrich K, Reiser M, et al Cytoreductive treatment in real life: a chart review analysis on 1440 patients with polycythemia vera J Cancer Res Clin Oncol 2021:1-13 178 Ferrari A, Carobbio A, Masciulli A, et al Clinical outcomes under hydroxyurea treatment in polycythemia vera: a systematic review and meta-analysis Haematologica 2019;104(12):2391-2399 179 Bai J, Ai L, Zhang L, Yang FC, Zhou Y, Xue Y Incidence and risk factors for myelofibrotic transformation among 272 Chinese patients with JAK2-mutated polycythemia vera Am J Hematol 2015;90(12):1116-21 180 Barbui T, Thiele J, Passamonti F, et al Survival and disease progression in essential thrombocythemia are significantly influenced by accurate morphologic diagnosis: 2011;29(23):3179-84 an international study J Clin Oncol PHỤ LỤC TÓM TẮT MỘT SỐ QUY TRÌNH KỸ THUẬT TRONG NGHIÊN CỨU Hóa chất sinh phẩm tóm tắt quy trình xét nghiệm nhuộm sợi xơ reticulin collagen phương pháp Gomori: – Hóa chất, sinh phẩm: • Dung dịch Potassium permanganate 2%; • Dung dịch Potassium metabisulfite 2%; • Dung dịch Ferric ammonium sulfate 2%; • Dung dịch bạc Ammoni; • Dung dịch formalin 20%; • Dung dịch CuSO4 5H2O 2%; • Dung dịch Sodium thiosulfate 2%; • Toluen, cồn tuyệt đối, cồn 90o , cồn 80o; • Nước cất/ nước khử ion – Tóm tắt quy trình nhuộm sợi xơ reticulin collagen phương pháp Gomori: • Bước 1: Ngâm tiêu Toluen I => II: Mỗi bể phút; • Bước 2: Ngâm tiêu cồn tuyệt đối => cồn 90o: Mỗi bể phút Rửa nước chảy phút; • Bước 3: Nhúng tiêu vào dung dịch Potassium permanganate 2%: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 4: Nhúng tiêu vào dung dịch Potassium metabisulfite 2% lên tiêu bản: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 5: Nhúng tiêu vào dung dịch Ferric ammonium sulfate 2%: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 6: Nhúng tiêu vào dung dịch Ammoni: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 7: Nhúng tiêu vào dung dịch Formalin 20%: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 8: Nhúng tiêu vào dung dịch CuSO4.5H2O 2% lên tiêu bản: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 9: Nhúng tiêu vào dung dịch Potassium metabisulfite 2% lên tiêu bản: phút; • Bước 10: Nhúng tiêu vào dung dịch Sodium thiosulfate 2% lên tiêu bản: phút Rửa nước chảy phút; • Bước 11: Ngâm tiêu bể: cồn 90o, cồn tuyệt đối: bể 30 giây; • Bước 12: Để khô tiêu gắn lamen → để khơ Hố chất, sinh phẩm tóm tắt quy trình xét nghiệm nhiễm sắc thể tế bào tuỷ xương: - Hóa chất, sinh phẩm + Ni cấy tế bào tuỷ xương: • Mơi trường RPMI 1640 (+ L- Glutamin, + 25mM Hepes, Gibco) + Thu hoạch: • Dung dch Colcemide 10 àg/ml; ã Huyt bo thai bê (Biowest); • Dung dịch nhược trương: KCL 0,075M (pH=7,4) (Merk); • Acid acetic 5%; • Methanol tuyệt đối; • Kháng sinh streptomycin + Penicillin + Nhuộm Giemsa: Hoá chất nhuộm Giemsa 10% (Merk) + Nhuộm băng G: • Trypsin • Đệm pH 6,8 (KH2PO4: 9,1g/l; Na2HPO4.2H2O: 11,5g/l) • Nước muối 0,9% - Tóm tắt quy trình ni cấy, thu hoạch lập công thức nhiễm sắc thể: + Lấy ml dịch tủy vào bơm tiêm tráng heparin 5.000 UI/ml + Cho tủy vào ống nghiệm vô trùng có chứa 3ml mơi trường ni cấy, trộn và đếm tế bào tủy hỗn dịch + Ly tâm 1.000 vòng/5 phút lấy cặn phía để tách bỏ độc chất phần mỡ lơ lửng phía + Mỗi chai nuôi cấy ghi tên người bệnh, số thứ tự khoa, ngày cấy, ngày thu hoạch + Trong lọ cấy cho: o 10 ml môi trường nuôi cấy o Lượng hỗn dịch tủy chứa từ – 4106 tế bào/ml Lắc nhẹ lọ cấy để tủ ấm 37oC 24h + Sau 24h cho vào lọ 50 µl dung dịch colcemide (10 µg/ml) lại để tủ ấm tiếp 20 phút + Sau ủ 20 phút chuyển toàn hỗn dịch lọ cấy vào ống Falcon 15 ml, ly tâm máy ly tâm roto văng 1000 vòng/phút x phút + Sau ly tâm hút bỏ phần dịch trên,để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt cặn tế bào khoảng mm) + Cho thêm vào ống ly tâm ml dung dịch nhược trương để ấm 37oC trước,trộn nhẹ vài lần ủ bể ấm 37oC 18 phút + Sau ủ 18 phút cho thêm vào ống ml dung dịch Carnoy, trộn nhẹ để phút + Lấy ống ly tâm lấy cặn Sau hút bỏ dung dịch phía cho thêm vào ống 10 ml dung dịch Carnoy, trộn để nhiệt độ phòng 10 phút + Ly tâm hút bỏ phần thêm 10ml dung dịch Carnoy, trộn để nhiệt độ phòng 10 phút + Lặp lại bước rửa + Các lam kính rửa ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn 1000, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô + Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau lấy để nghiêng 20 – 300 giấy thấm + Ly tâm hút bỏ dung dịch phía trên, tái huyền dịch lấy hỗn dịch cặn nhỏ lên lam kính.Chú ý nhỏ tiêu để đầu pipet cao mặt phiến kính từ 10-20 cm + Để tiêu khô tự nhiên, tiến hành nhuộm Giemsa, nhuộm băng G + Phân tích NST hệ thống karyotyping phần mềm phân tích tự động Ikaros để lập karyotype Hố chất, sinh phẩm tóm tắt quy trình xét nghiệm AS – PCR phát đột biến JAK2 V617F: - Hóa chất, sinh phẩm: Bảng 1: hóa chất sinh phẩm sử dụng kỹ thuật xét nghiệm đột biến gen JAK2 V617F Hóa chất, sinh phẩm Thành phần Điều kiện bảo quản AL Buffer 15-250C VHB Buffer 15-250C SPM Buffer 15-250C Kít tách AND hạt từ Elution Buffer 15-250C (Mag-Bind Blood DNA HDQ Binding Buffer 15-250C HDQ) HDQ Magnetic Particles 2-80C Protease K 2-80C BL Buffer 22-250C Kit tách AND thủ công HBC Buffer 22-250C (E.Z.N.A Blood DNA) OB Protease Solution 2-80C Hóa chất chạy PCR Hóa chất điện di DNA Wash Buffer 22-250C Elution Buffer 22-250C Các cặp mồi đặc hiệu -200C 10X PCR buffer -150C đến -250C MgCl2 25mM -150C đến -250C dNTPs 2,5mM -150C đến -250C Jumstart Taq pol -150C đến -250C Agarose 22-250C Loading dye 22-250C DNA ladder 22-250C Redsafe 22-250C TBE 5X 22-250C – Tóm tắt quy trình xét nghiệm AS – PCR phát đột biến gen JAK2 V617F: Bước 1: Tách ADN theo quy trình tách ADN cột Bước 2: Thực phản ứng PCR − Chuẩn bị hóa chất thực xét nghiệm: + Lấy hóa chất cho phản ứng PCR bao gồm10X PCR buffer, MgCl2 25mM, dNTPs 2,5mM, Jumstart Taq pol hãng Sigma, nước khử ion vô trùng, mồi JK-FC 10pM, JK-FS 10pM, JK-FR 10pM đặt khay trữ lạnh khoảng 10 phút để rã đông hoàn toàn; + Trộn ống hóa chất ly tâm nhanh 6000 vịng/phút từ – giây để dung dịch lắng xuống đáy ống hoàn toàn Đặt lại ống vào khay trữ lạnh − Chuẩn bị mẫu ADN: pha loãng mẫu ADN nồng độ 100 ng/µl, ghi rõ thơng tin pha mẫu bao gồm mã số xét nghiệm, nồng độ ADN gốc, thể tích mẫu ADN sử dụng để pha lỗng thể tích Elution buffer sử dụng để pha lỗng − Thao tác tủ an tồn sinh học: + Sử dụng pipet hút hóa chất 10X PCR buffer, MgCl2 25mM, dNTPs 2,5mM, Jumstart Taq pol, nước khử ion vô trùng, mồi JK-FC 10pM, JK-FS 10pM, JK-FR 10pM theo thể tích tính toán hồ sơ xét nghiệm vào ống eppendorf 0.2 ml 1.5 ml vô trùng đánh dấu + Trộn hóa chất chia vào ống phản ứng 23 µl − Bổ sung µl dung dịch ADN (20-100 ng/µl) bệnh nhân vào ống phản ứng tương ứng − Trộn ống ly tâm nhanh 6000 vòng/phút từ - giây − Phản ứng PCR máy Mastercycler nexus GX2 với chương trình: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95oC phút 01 94oC 15 phút 63oC 15 phút 72oC 30 phút 72oC 01 phút 15oC 30 01 Bảo quản Bước 3: Điện di sản phẩm PCR theo quy trình điện di ADN gel agarose Bước 4: Phân tích kết Các mẫu đối chứng đạt yêu cầu khi: - Đối chứng dương: có băng nội kiểm kích thước 364 bp và băng đột biến kích thước 203 bp - Đối chứng âm: có băng nội kiểm kích thước 364 bp khơng có băng trùng với băng đột biến - Chứng H2O: khơng có băng sản phẩm Mẫu xác định dương tính khi: có băng nội kiểm kích thước 364 bp băng đột biến kích thước 203 bp Mẫu xác định âm tính khi: có băng nội kiểm kích thước 364 bp khơng có băng trùng với băng đột biến M Pos Neg H20 364 bp 203 bp Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR phát đột biến JAK2 V617F Hóa chất, sinh phẩm tóm tắt quy trình xét nghiệm giải trình tự gen hệ phát đột biến JAK2 exon 12, CALR exon 9, MPL exon 10 – Hóa chất sinh phẩm: Quy trình giải trình tự gen hệ hệ thống máy giải trình tự gen Illumina MiSeq cần sử dụng nhóm hóa chất sinh phẩm sau: + Hóa chất tách chiết ADN với sinh phẩm Mag-Bind®Blood DNA HDQ 96 Kit (Omega Bio-tek) + Hóa chất đo nồng độ ADN với sinh phẩm Qubit dsDNA HS assay kit (Life technologies) + Hóa chất tinh ADN hạt từ với sinh phẩm Agencourt Ampure XP (Beckman coulter) + Hóa chất chuẩn bị thư viện ADN với sinh phẩm Nextera XT library prep kit 24 samples (box 1, box 2) (Illumina) + Hóa chất gắn mã phân biệt với sinh phẩm Nextera XT index kit 24 indices – 96 samples (Illumina) + Hóa chất giải trình tự hệ với sinh phẩm Miseq reagent kit v2 – 300 cycles PE (box1, box 2) (Illumina) – Tóm tắt quy trình giải trình tự gen hệ phát đột biến gen JAK2 exon 12, CALR exon 9, MPL exon 10: Quy trình giải trình tự gen sử dụng nghiên cứu gồm giai đoạn chính: (1) Chuẩn bị mẫu khuếch đại vùng gen đích, (2) Chuẩn bị thư viện ADN, (3) Giải trình tự gen hệ thống giải trình tự gen hệ (4) Xử lý liệu giải trình tự Quy trình cụ thể tóm tắt sau: + Giai đoạn – Chuẩn bị mẫu khuếch đại vùng gen đích: • Tách ADN tổng số từ máu ngoại vi tủy xương sinh phẩm Mag-Bind®Blood DNA HDQ 96 Kit (Omega Bio-tek), hệ thống bán tự động ThermoFisher (Mỹ); • Thực phản ứng PCR để khuếch đại vùng gen đích với thành phần cho ống 50 µl gồm có: µl ADN khn, µl LongRange PCR Buffer 10X, µl MgCl2 25 mM, 2,5 µl dNTPs 10 mM, 0,4 µl LongRange PCR Enzyme, 0,4 nM loại mồi, H2O cho đủ thể tích 50 µl; • Phản ứng PCR máy Applied Biosystems ProFlex với chương trình: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 93oC phút 01 93oC 15 phút 62oC 30 phút 68oC 10 phút 68oC 10 phút 35 01 • Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu gồm: o JAK2ex12_F/JAK2ex12_R o CALRex9_F/CALRex9_R o MPLex10_F/MPLex10_R • Sau phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm khuếch đại gen tinh hạt từ với sinh phẩm Nextera AMPureXP (Illumina) + Giai đoạn – Chuẩn bị thư viện ADN: • Chuẩn hóa nồng độ ADN: Sản phẩm khuếch đại gen tinh đo nồng với sinh phẩm QuBit dsDNA HS Assay Trên sở tiến hành pha loãng mẫu nồng độ 0,2 ng/àl; ã Ct ADN cỏc on ngn: S dng sinh phẩm Nextera XT sample Prep Sản phẩm gen đích sau chuẩn hóa ủ với enzyme cắt ngẫu nhiên nhằm phân mảnh thành đoạn ADN ngắn ngẫu nhiên, hỗn hợp ủ 55oC phút, sau bổ sung chất bất hoạt enzyme ủ nhiệt độ phòng phút để đảm bảo ADN khơng bị cắt vụn thành mẩu q nhỏ; • Gắn mã phân biệt: Sử dụng sinh phẩm Nextera XT index với hai mã phân biệt index index 2, gồm nhiều mã phân biệt tùy theo cỡ mẫu để lựa chọn số lượng mã phân biệt phù hợp Thư viện ADN mẫu gắn mã phân biệt thuộc nhóm index mã phân biệt nhóm index Sắp xếp mã phân biệt theo hai nhóm đĩa TruSeq Index Plate Fixture Bổ sung mã phân biệt vào thư viện ADN mẫu, đảm bảo mẫu bổ sung cặp mã phân biệt không trùng lặp Thực phản ứng PCR để gắn mã phân biệt theo chu trình nhiệt: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 72oC phút 01 95oC 30 phút 01 95oC 10 phút 55oC 30 phút 72oC 30 phút 72oC 05 phút 10oC • 12 01 Bảo quản Tinh sản phẩm sau gắn mã phân biệt: Sử dụng sinh phẩm Agencourt Ampure XP Thư viện ADN tinh hịa tan 50 µl đệm Nếu chưa sử dụng, thư viện ADN bảo quản nhiệt độ – 8oC tuần; • Chuẩn hóa thư viện ADN: Thư viện ADN sau tinh đo nồng độ sinh phẩm QuBit dsDNA HS Assay Trên sở đo nồng độ tiến hành quy đổi từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM Sau đó, pha lỗng mẫu nồng độ nM Như vậy, chuẩn bị xong thư viện ADN hồn chỉnh sẵn sàng cho q trình giải trình tự gen + Giai đoạn – Giải trình tự gen: Sử dụng sinh phẩm Miseq Reagent Trước tiên, thực trình gộp mẫu cách trộn chung 10 µl thư viện hồn chỉnh mẫu vào ống xét nghiệm 1,5 ml Biến tính hỗn hợp thư viện ADN NaOH 0,2N theo tỉ lệ 1:1 Sau biến tính, tiến hành pha lỗng hỗn hợp thư viện nồng độ 20 pM Chuyển toàn ml hỗn hợp thư viện pha loãng vào khay MiSeq Reagent Cartridge vi trí Load Samples khay Đưa khay MiSeq Reagent Cartridge vào vị trí và thao tác máy để bắt đầu trình giải trình tự gen hệ thống Illumina MiSeq + Giai đoạn – Xử lý liệu giải trình tự: Dữ liệu giải trình tự phân tích Miseq Reporter (Illumina), CLC Genomics Workbench (Qiagen, Đức) IGV (Broad Institute, Mỹ) phần mềm tinsinh học chuyên dụng cho giải trình tự gen hệ Các chỉ số đảm bảo chất lượng mẻ giải trình tự hệ yêu cầu gồm: chỉ số Q30 > 90%, mật độ cụm > 800K/mm2, độ lặp bao phủ > 4000 Khi phân tích đột biến gen sai khác gọi tên tham chiếu với sở liệu đột biến công bố Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) Hình 2: Kết NGS bệnh nhân Nguyễn Thị Q có đột biến gen CALR typ (chèn nucleotide “TTGTC”) Hình 3: Kết NGS bệnh nhân Bùi Thị N có đột biến gen CALR typ (mất đoạn 52 nucleotide) Hình 4: Kết NGS bệnh nhân Nguyễn Thị T có đột biến gen MPL W515L (G1544T) Hình 5: Kết NGS bệnh nhân Nguyễn Thị Anh Đ có đột biến gen MPL W515K (TG1543_1544AA)