Tạo dòng ruồi giấm chuyển gen uch l1 nhằm ứng dụng trong nghiên cứu và hướng tới sàng lọc thuốc chữa bệnh parkinson

ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: TẠO DÒNG RUỒI GIẤM CHUYỂN GENE uch-l1 NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ HƯỚNG TỚI SÀNG LỌC THUỐC CHỮA BỆNH PARKINSON CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO THÁNG 11 NĂM 2011 ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: TẠO DÒNG RUỒI GIẤM CHUYỂN GENE uch-l1 NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ HƯỚNG TỚI SÀNG LỌC THUỐC CHỮA BỆNH PARKINSON CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) TS ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2011 TÓM TẮT ĐỀ TÀI Bệnh Parkinson gây thóai hóa tế bào thần kinh kiểm sóat vận động bắp Các tế bào thần kinh sản xuất dopamin – chất có vai trị quan trọng truyền tín hiệu tế bào Khi lượng dopamin não bị thiếu hụt, người bệnh có triệu chứng đứng khó khăn, cử động chậm, tay chân cứng rung, mặt bị liệt Đây bệnh phổ biến với tỷ lệ mắc bệnh khỏang 100/100 000 hàng năm có thêm khỏang 20/100 000 người mắc bệnh Tuy tình hình bệnh phổ biến nghiêm trọng, nghiên cứu ngun nhân gây bệnh, liệu pháp phịng bệnh, mơ hình nghiên mơ trị bệnh chưa mang lại đáp án mong đợi Gần đây, thông qua việc thiết lập mơ hình động vật có kiểu hình bệnh PD, nghiên cứu tiếp cận theo hướng phát đột biến đơn có liên quan đến di truyền số kiểu bệnh PD để góp phần hiểu sâu chế phân tử bệnh PD (Nature, 404, 394-398, 2000; Annu Rev Genet, 39, 153-171, 2005; J Pharma Exp Therapeutic, 300, 91 – 96, 2002) Mặt khác mơ hình động vật bị bệnh PD cịn dùng cho việc sàng lọc hợp chất hóa học có họat tính trị bệnh PD (J American Soci Exp NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005) Mơ hình chuột chuyển gene sử dụng rộng rãi để nghiên cứu bệnh người Tuy nhiên, mơ hình thường tốn tiền cần nhiều thời gian Mặt khác, sau dự án gen người thực hoàn tất, việc so sánh liệu gene người ruồi giấm, Drosophila, cho thấy có khỏang 70% gene bệnh người có gene tương đồng bảo tồn ruồi giấm Trên sở đó, nhà khoa học bắt đầu sử dụng mơ hình ruồi giấm chuyển gene nghiên cứu bệnh người Mơ hình ruồi giấm chuyển gene cho phép nghiên cứu mô cách rõ ràng mạng lưới gene liên quan, chế điều hòa biểu gene gây bệnh Mơ hình có ưu điểm rẻ tiền, thời gian thí nghiệm ngắn hơn, nên ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu bệnh người (Annu Rev Genet, 39, 153-171, 2005; J i Pharma Exp Therapeutic, 300, 91 – 96, 2002, J American Soci Exp NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005) Đề tài thực tạo dòng ruồi giấm mang phức hợp gene cho phép knock-down gene duch nhằm hướng tới việc nghiên cứu chế sinh học phân tử bệnh Parkinson ứng dụng sàng lọc thuốc trị bệnh Parkinson Mặt khác, Drosophila biết đến mơ hình nghiên cứu di truyền, đặc biệt di truyền phân tử, nhiên, đối tượng chưa sử dụng làm mô hình nghiên cứu di truyền phân tử Việt Nam Do vậy, việc thực đề tài việc đóng góp kết nghiên cứu khoa học giới cịn góp phần xây dựng lĩnh vực nghiên cứu quan tâm nghiên cứu mạnh giới hịan tồn chưa thiết lập Việt Nam Nhằm thực mục tiêu đề ra, chúng tơi đã:  Phân tích in silico thiết kế hệ thống vector phục vụ cho việc tạo dsRNA: Trong nội dung này, thu nhận phân tích liệu gene, protein UCH-L1 người tìm protein tương đồng với protein UCH-L1 người (protein CG4265, ký hiệu dUCH), protein có tương đồng (45.9%) giống (75.7%) cấu trúc chức vùng peptide protein UCH-L1 người protein dUCH Chúng tơi phân tích dự đốn mối tương quan protein UCH protein khác có liên quan đến bệnh Parkinson Kết phân tích cho thấy UCH-L1 có mối liên quan với nhiều protein cơng bố ngun nhân gây bệnh Parkisnon hay có liên quan đến bệnh Parkinson Chúng thu nhận gene mã hóa cho protein dUCH tạo thành công vector phục vụ cho việc knock-down gene duch ruồi giấm (vector pB/NdUCH; pB/CdUCH; pUAST/NdUCH; pUAST/CdUCH) Sau đó, kiểm tra hiệu knockdown cấu trúc ds RNA dUCH dòng tế bào S2 ruồi giấm Kết kiểm tra cho thấy đoạn dsRNS thiết kế cho hiệu knock down gene duch tốt ii  Tạo dòng biểu protein dUCH E coli tạo kháng thể kháng dUCH: Nhằm thu nhận kháng thể kháng dUCH phục vụ cho mục tiêu phân tích kiểm tra biểu gene duch, chúng tơi tạo dịng biểu thành cơng protein dUCH E coli Sau đó, thu nhận tinh chế thành công protein dUCH sử dụng protein tinh chế nhằm gây đáp ứng miễn dịch thỏ Chúng thu nhận kháng thể kháng dUCH kiểm tra độ chuyên biệt độ nhạy kháng thể phản ứng Wesern Blot phản ứng Elisa protein tái tổ hợp thu tổng protein thu nhận từ ruồi giấm Kết cho thấy, kháng thể tạo thành có độ nhạy, độ chuyên biệt cao  Tạo dòng ruồi giấm chuyển gene mang phức hợp UAS-IR-dUCH knock down gene dUCH định hướng mô: Các vector mang tạo dsRNA cho gene duch chuyển vào ruồi giấm phương pháp vi tiêm Chúng tơi sàng lọc, chủng dịng ruồi tạo 02 dòng ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH (ký hiệu 24-8 26-9) Sử dụng phép lai với balancer để định vị phức hợp UAS-IR.dUCH nhiễm sắc thể ruồi giấm chuyển gene Kết cho thấy phức hợp UAS-IR-dUCH nằm nhiễm sắc thể số ruồi giấm Dòng 24-8 dòng đồng hợp dòng 26-9 dòng dị hợp Chúng khảo sát hiệu knock dowm gene dUCH ruồi giấm chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH kết hợp với Gal4 Kết khảo sát cho thấy dòng ruồi chuyển gene có khả knock down gene dUCH 36% dòng ruồi 24-8 73% dịng ruồi 26-9 Chúng tơi knock down gene dUCH định hướng mô mắt (và mô não) khảo sát ảnh hưởng biểu kiểu hình ruồi giấm chuyển gene Kết cho thấy: iii a Knock down dUCH gây bất thường trình phát triển mắt ruồi, bất thường có liên quan đến trình sinh trưởng tế bào, biệt hóa tế bào trình apoptosis b Knock down dUCH làm giảm khả vận động ruồi giấm chuyển gene Sự giảm khả vận động có liên quan đến đường sinh tổng hợp dopamine tế bào thần kinh sản sinh dopamine  Các công bố khoa học sản phẩm đào tạo Cùng với kết nghiên cứu, đề tài góp phần đào tạo 04 cử nhân sinh học CNSH 01 Thạc sĩ Sinh học (02 Thạc sĩ Sinh học tiến hành) Các kết nghiên cứu đề tài tổng hợp công bố 01 báo khoa học, 01 báo cáo hội nghị, 02 phản biện tạp chí CNSH 01 gửi đăng tạp chí quốc tế iv SUMMARY Parkinson disease (PD) is a kind of chronic nervous diseases, caused by the degeneration of brain cells responsible for motor skills These brain cells produce dopamine – an important substance functioned as neurotransmitter When dopamine’s level in the midbrain is insufficient, the patient will have symptoms such as difficulty in walking, slowness of movement, rigidity or stiffness in the limbs and jaw, tremor This is a kind of common disease with the rate about 100/100 000, and there are 20/100 000 new patients annually Although this is a common, wide spread and dangerous disease, studies on the disease’s causes, preventions, mimicked research models, and treatments still have not yet given the expected results Many important questions about PD still not have satisfied explanation Recent studies start to move to find single mutations related to the hereditary of several PD, help us to have clearer understanding on the molecular mechanism of PD through the establishment of research models using genetically modified animals carried PD phenotype (Nature, 404, 394-398, 2000; Annu Rev Genet, 39, 153-171, 2005; J Pharma Exp Therapeutic, 300, 91-96, 2002) This method, not only can satisfy the requirements of biology molecular researches for the causing mechanism of the disease, it can also help us to proceed to the screening for chemical substances which have curable activity (J Americam Soci Exp NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005) The genetically modified mouse model has been widely used to study human diseases However, this model has high cost and time consuming One of the biological models can be used as a model for human diseases is the genetically modified fruitfly model, Drosophila This is an effective model for wide screening disease genes with low cost and time saving In this model, we can study and mimic clearly the related genes, and modulate the disease gene With these advantages, the genetically modified fruitfly model has been used in human diseases researches (Annu Rev Genet, 39, 153- v 171, 2005; J Pharma Exp Therapeutic, 300, 91-96, 2002; J America Soci Exp NeuroTherapeut, 2, 3, 438-446, 2005) In this research, we purposed to establish some transgenic Drosophila lines carry cassettes gene which can be used for knocking down duch gene The transgenic fly lines can be use for further research on Parminson disease molecular mechanism In addition, the results from this project can also be seen as the premise for using fruitfly model to screen potential natural substances for treatment of PD Moreover, Drosophila has been known by researchers all over the world as a hereditary research model, especially molecular hereditary Many published papers based on Drosophila researches have been showed to have great contribution to human beings However, the molecular hereditary models in Vietnam almost have not yet been developed Therefore, besides taking the above research idea, we are carrying this project with the wish to start creating a new research field in Vietnam, which is essential research field had been established long time ago in many countries in the world In this project, we:  In silico analyzing and constructing some vector which carry and produce dsRNA for duch gene We used bioinformatics to identify human UCH-L1 homologue in Drosophila (the CG4265 protein, named dUCH) The protein has 45.9% identity and 75.7% similarity to the UCH-L1 protein Based on some previous scientific data we predict UCH-L1 protein interaction network in order to find out some candidates for our research in understanding Parkinson disease mechanism After finding out UCH-L1 homologue in Drosophila we then constructing some vector which carry duch gene fragments and enable to produce dsRNA in vitro or in vivo vector pB/NdUCH; pB/CdUCH; pUAST/NdUCH; pUAST/CdUCH) vi Knocking-down ability of those designed dsRNA fragments were examined and verified by realtime PCR and Western Blot Our experimental data revealed that the dsRNA duch strongly reduced mRNA duch level and gene expression  Constructing of dUCH expressing vector and producing dUCh antibody We constructed a vector which carries duch cDNA gene and expresses the gene in E coli In the vector, duch cDNA was fused to 6xHis DNA fragment in order to produce fusion protein named 6xHis-dUCH The 6xHis – dUCH fusion protein was collected and purified by NiTA column We then used the above purified protein to immunize rabbit in order to produce dUCh antibody After immunization, we collected serum from the immunized rabbits and check the dUCH antibody by western blot and Elisa Our data clearly showed that the collected dUCH antibody is specific  Establishment of transgenic Drosophila lines carry UAS-IR-dUCH cassette gene and tissue specific knock down duch gene Vectors carry the UAS-IR-dUCH cassette gene fragment was microinject into fertilized fly embryos in order to produce dsRNA duch in transgenic flies We screened transgenic flies and made pure fly lines We finally collected 02 transgenic fly lines named 24-8 and 26-9.We then crossed the lines with balancer to identify chromomal linkage Our results showed the UAS-IR.dUCH cassette gene located on third chromosome Line 24-8 is homogenous and line 26-9 is heterogeneous We analyzed knock down dUCH effect in transgenic fly which carry both UASIR.dUCH and Gal4 Our data revealed that duch gene was knock down 36% in 24-8 line and 73% in 26-9 line We specifically knock-down duch gene in Drosophila eye or brain by using GMR-Gal4 or Ddc-Gal4, respectively We then analyzed transgenic knock down fly phenotype Our results showed: vii a Knock down dUCH caused rough eye phenotype It resulted from an abnormal eye development which related to apoptosis, photo receptor cell differentiation and proliferation b Knock down dUCH reduced Drosophila mobility and the reduction involved to dopamine synthesis pathway through tyrosine hydroxylase  Publications and Training Beside the above experimental results, this research project also contributed in training 04 Bachelor of Biology and Biotechnology; 03 Master of Biology (02 going on) We already published 01 paper, 01 conference publication, 02 revising papers in Journal of Biotechnology; 01 submitted in international journal viii NỘI DUNG 6: Kiểm tra kiểu hình biểu dịng ruồi bị knockdown gene Chúng tiến hành khảo sát ruồi trưởng thành để theo dõi tác động theo thời gian knock-down dUCH lên hệ vận động ruồi Kết biểu diễn thành đồ thị sau: Hình 6.1 Đồ th biểu diễn khả vận động c a ruồi theo thời gian Dựa vào biểu đồ, nhận thấy dòng ruồi knock-down dUCH di chuyển chậm dịng đối chứng Nhưng để nhận định có ý nghĩa mặt thống kê, tiếp tục tiến hành đánh giá mức ý nghĩa công cụ phân tích t-test so sánh cặp Kết phân tích thống kê sau: (phụ lục đính kèm) Ruồi 20cm Ruồi đực 20cm 0.01213 0.00195 P Từ kết trên, chúng tơi có nhận xét sau: - 91 - - Ruồi knock-down dUCH có khả leo trèo k m so với dòng đối chứng, điều thấy rõ so sánh mức 20cm Kết thống kê cho thấy có khác biệt Vậy, knock-down protein dUCH não ruồi có ảnh hưởng đến khả vận động ruồi - 100% ruồi mang kiểu gene UAS-IR.-dUCH Ddc- al cho kiểu miêu tả Chúng ta biết, nguyên nhân gây bệnh Parkinson thiếu hụt dopamine não Trong mục tiêu nghiên cứu chúng tôi, mong muốn hướng đến việc làm rõ vai trò protein UCH-L1trong chế phát sinh bệnh Parkinson Với mơ hình ruồi giấm chuyển gene knoc-down gene dUCH, chúng tơi thấy biểu bất bình thường khả vận động ruồi giấm Chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm nhằm tìm mối liên hệ ảnh hưởng kiểu hình nói với bệnh Parkinson Trước tiên, hướng tới việc khảo sát đường sinh tổng hợp dopamine ảnh hưởng knock-down dUCH đường Do vậy, tiến hành nhuộm não ruồi với kháng thể kháng tyrosine hydroxylase (TH), protein đóng vai trị quan trọng đường sinh tổng hợp dopamine Câu hỏi đặt biểu UCH-L1 có ảnh hưởng đến biểu tyrosine hydroxylase hay khơng? Hình 6.2 Nhuộm miễn d ch huỳnh quang não ruồi với kháng thể kháng TH - 92 - Kết nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy lượng TH ng ruồi knockdown dUCH giảm đáng kể so với dịng đối chứng Điều dẫn đến kết luận: knoc-down dUCH dẫn đến giảm lượng TH, từ làm cho lượng dopamine bị suy giảm làm giảm khả vận động ruồi giấm Bên cạnh việc sử dụng dòng ruồi Ddc- al để knock-down dUCh tế bào thần kinh sản sinh dopamine, tiến hành knock-down dUCH não với số dòng Gal4 driver khác Các kết khảo sát kiểu hình ruồi knock-down tổng kết bảng sau Bảng 3.2 Khảo sát ản ưởng c a knock-down dUCH mô khác ruồi giấm chuyển gene kỹ thuật biểu hi n gene đ n ướng mô sử dụng phức hợp Gal4-UAS Promoter chuyên biệt mơ Đích biểu Kiểu hình ruồi Mắt nhám, gây apoptosis, ảnh GMR-GAL4 hưởng đến q trình biệt hóa Mắt photoreceptor cell R7 Ruồi giảm khả vận động, Ddc-GAL4 Não (Tế bào thần kinh sản giảm sinh Dopamine) hàm lượng tyrosine hydroxylase tế bào sản sinh dopamine Elav-GAL4 TH-GAL4 Tdc2-GAL4 Ap-Gal4 Não (Các tế bào thần kinh não) Não (Tế bào thần kinh sản sinh Dopamine) Não (Tế bào thần kinh sản sinh Dopamine) Cánh Ruồi giảm khả vận động Ruồi giảm khả vận động Ruồi giảm khả vận động Ruối bị teo cánh - 93 - Các kết thu thống dòng ruồi knock-down dUCH promoter chuyên biệt mô não lần kh ng định kết thực nghiệm cho thấy ảnh hưởng việc knock-down dUCH làm suy giảm khả vận động ruồi giấm Bước đầu khảo sát, chúng tơi thấy, ảnh hưởng có liên quan đến hàm lượng tyrosine hydroxylase, enzyme quan trọng trình sinh tổng hợp dopamine - 94 - Giải trình nội dung thực khác với đề cương nghiên cứu Nội dung có đề cương kh ng tr nh bày kết thực nghiệm đề tài (nội dung 6.2) So với nội dung dự kiến đề cương, tự đánh giá thực hồn ch nh (có vượt mức) nội dung đề Tuy nhiên, trình thực hiện, dựa kết thực nghiệm thu nội dung trước, có số thay đổi nhỏ nội dung 6.2 để kết đề tài có ý nghĩa Chúng tơi in ph p giải trình cụ thể sau: Trong nội dung 6.2, theo đề cương nghiên cứu, dự kiến biểu định hướng mơ cánh chân ruồi phân tích kiểu hình để hướng đến việc sử dụng mơ hình sàng lọc thuốc đề tài nghiên cứu Trên thực tế, cho biểu định hướng mô cánh, chân ruồi Kết thực nghiệm cho thấy ruồi knock-down dUCH mô tiền phân sinh cánh gây kiểu hình teo cánh ruồi (Bảng 3.2, hình 6.3) Hình 6.3: Kiểu hình ruồi knock-down dUCH mô tiền phân sinh cánh - 95 - Tuy kiểu hình rõ dễ quan sát, cánh ruồi bị teo, ruồi thường dễ bị d nh vào môi trường chết, gây ảnh hưởng cho sàng lọc, nghiên cứu sau Do vậy, không tiếp tục sử dụng mô hình mà chuyển sang biểu mơ mắt Trong tương lai, với việc chứng minh vai trò protein UCH-L1 bệnh Parkinson thơng qua mơ hình ruồi giấm, chúng tơi hướng đến việc sử dụng kiểu hình mắt nhám biết mức độ tác động thuốc lên kiểu hình gây knock-down dUCH mơ mắt ruồi Từ sàng lọc thuốc ứng viên có khả ức chế tác động knock-down dUCH, giảm tác động tế bào thần kinh sản sinh dopamine Cũng nội dung 6.2, theo đề cương nghiên cứu, chúng tơi hướng đến việc nghiên cứu vai trị UCH- đới với tích tụ alpha-synuclein Chúng tơi bước đầu thực nội dung kết cho thấy knock-down dUCH có phần gây gia tăng tích tụ alpha-synuclein đĩa tiền phân sinh mắt ruồi (Hình Tuy nhiên, để có kết nghiên cứu sâu mối liên quan kiểu hình giảm khả vận động ruồi chuyển gene chất liên quan đến đường sinh tổng hợp dopamine não ruồi, khoảng giới hạn thời gian kinh phí đề tài, chúng tơi tiến hành thực phân tích ảnh hưởng knock-down dUCH lên tế bào thần kinh sản sinh dopamine (như kết trình bày hình 6.2) Hình 6.4: Khả sát tá động knock-down dUCH lên tích tụ alpha-synuclein mơ tiền phân sinh mắt ruồi - 96 - Các nội dung thực thêm so với nội dung đề cương Chúng t i thực thêm nội dung so với đề cương, nhằm có kết thực nghiệm logic, tiết kiệm thời gian, nguyên nhiện vật liệu Các nội dung thực thêm so với đề cương liệt kê sau: Nội dung khảo sát tác động đoạn RNS sợi đôi thiết kế mơ hình tế bào ni cấy kỹ thuật real-time PCR Western Blot (kết hình 2 Đây hai kết khơng có đề cươg nghiên cứu q trình thực đề tài, chúng tơi thấy thực cần thiết nhằm tiết kiệm chi ph tăng hiệu công việc Trên thực tế, sau thiết kế đoạn RNA sợi đơi, tiến hành thực cấu trúc plasmid vi tiêm vào ruồi Nhưng, đề tài này, tiến hành kiểm chứng tế bào Nếu thiết kế đúng, tiếp tục thực bước vi tiêm Thực kiểm chứng kháng thể kháng dUCh tạo mơ hình ruồi chuyển gen biểu vượt mức dUCH (kết hình 3.13) Trên thực tế, kết Elisa kết hợp với kết Western Bolt protein tái tổ hợp prtein tổng từ tế bào E coli biều dUCH protein tổng từ ruồi giấm cho phép kh ng định độ chuyên biệt kháng tể tạo thành Tuy nhiên, tận dụng lợi việc sở hữu dòng ruồi biểu vượt mức dUCH (kết đề tài nghiện cứu thuộc quỹ Nafosted), định tiến hành biểu vượt mức dUCH mô mắt ruồi sử dụng kháng thể kháng dUCH để phát mức dộ biểu protein dUCH Kết cho phép kết luận thêm độ đặc hiệu khả sử dụng kháng thể thu nghiên cứu dòi hỏi độ nhạy cho phép phân biệt mức độ biểu protein mục tiêu Chúng thực knock-down dUCH mô tiền phân sinh mắt ruồi nhằm xây dựng mơ hình sàng lọc chất ức chế tác động knock-down dUCH mục tiêu sàng lọc thuốc say (hình Đây nội dung thực thay nội dung knock-down mô cánh chân ruồi thực phần (như trình bày trên) Chúng tiến hành khởi đầu nghiên cứu tác động việc knock-down dUCH mô não ruồi phân tích ảnh hưởng yếu tố - 97 - đường sinh tổng hợp dopamine tế bào thần kinh sản sinh dopamine (hình 6.2) Đây kết hồn tồn có ý nghĩa khoa học liên quan trực tiếp đến định hướng nghiên cứu sử dụng mơ hình ruồi chuyển gene sàng lọc thuốc sau Trên số giải trình nội dung thực khác biệt so với đề cương nghiên cứu Các thay đổi hoàn toàn dựa kết thực nghiệm thu định hướng đề tài thông tin liên quan đến đề tài cập nhật qua trình nghiên cứu so với thời điểm viết đề cương X t số lượng nội dung công việc, so với đề cương, chúng tơi ch có thay đổi nhỏ nội dung 6.2 Chúng thực nội dung này, nhiên khơng trình bày nội dung báo cáo nghiệm thu Thay thế, tiến hành số nội dung khác để đề tài logic có ý nghĩa khoa học Do vậy, chúng tơi xin phép trình bày kết thay báo cáo nghiệm thu K nh mong chấp thuận hội đồng - 98 - CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ - 99 - KẾT LUẬN Trong trình thực đề tài, chúng tơi hồn tất nội dung đề sau: A: Phân tích in silico thiết kế hệ thống vector phục vụ cho việc tạo dsRNA Đã thu nhận phân tích liệu gene, protein UCH-L1 người tìm protein tương đồng với protein UCH-L1 người (protein CG4265, ký hiệu dUCH) Đã phân t ch tương đồng (45.9%) giống (75.7%) cấu trúc chức vùng peptide protein UCH-L1 người protein dUCH Đã phân t ch dự đoán mối tương quan protein UCH protein khác có liên quan đến bệnh Parkinson Đã thu nhận gene mã hóa cho protein dUCH tạo thành công vector phục vụ cho việc knock-down gene duch ruồi giấm (vector pB/NdUCH; pB/CdUCH; pUAST/NdUCH; pUAST/CdUCH) Đã kiểm tra hiệu knock-down cấu trúc ds RNA dUCH dòng tế bào S2 ruồi giấm B: Tạo dòng biểu protein dUCH E coli tạo kháng thể kháng dUCH Đã tạo dịng biểu thành cơng protein dUCH E coli Đã thu nhận tinh chế thành công protein dUCH Đã gây đáp ứng miễn dịch thu nhận kháng thể kháng dUCH tái tổ hợp Kháng thể thu có độ chuyên biệt độ nhạy cao C: Tạo dòng ruồi giấm chuyển gene mang phức hợp UAS-IR-dUCH knock down gene dUCH định hướng mô 10 Đã thực chuyển gene vào ruồi giấm tạo 02 dòng ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH (ký hiệu 24-8 26-9) 11 Đã định vị phức hợp UAS-IR.dUCH nhiễm sắc thể ruồi giấm chuyển gene - 99 - 12 Đã khảo sát hiệu knoc dowm gene dUCH ruồi giấm chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH kết hợp với Gal4 13 Đã knock down gene dUCH định hướng mô mắt (và mô não) khảo sát ảnh hưởng biểu kiểu hình ruồi giấm chuyển gene Kết cho thấy: a Knock down dUCH gây bất thường trình phát triển mắt ruồi, bất thường có liên quan đến q trình sinh trưởng tế bào, biệt hóa tế bào trình apoptosis (các kết khảo sát tiến hành, khơng trình bày báo cáo b Knock down dUCH làm giảm khả vận động ruồi giấm chuyển gene Sự giảm khả vận động có liên quan đến đường sinh tổng hợp dopamine tế bào thần kinh sản sinh dopamine D: Các công bố khoa học sản phẩm đào tạo 14 Đã đào tạo 04 cử nhân CNSH 01 Thạc sĩ Sinh học (02 Thạc sĩ Sinh học tiến hành) 15 Đã công bố 01 báo khoa học, 01 báo cáo hội nghị, 02 phản biện tạp ch CNSH gửi đăng tạp chí quốc tế - 100 - ĐỀ NGHỊ Các kết đề tài cho thấy tiềm sử dụng dòng ruồi giấm chuyển gene knockdown dUCH tạo thành việc nghiên cứu chế phát sinh bệnh Parkinson Các kết đề tài có tính ý nghĩa khoa học Do vậy, đề nghị: Tiếp tục sử dụng dòng ruồi chuyển gene thiết lập để làm sáng tỏ vai trò UCH-L1 bệnh Parkinson Nghiên cứu sử dụng mơ hình knockd-own gene dUCH mắt ruồi sử dụng kiểu hình mắt nhám ch thị để sàng lọc hợp chất có tiềm ức chế hay làm giảm tác động chức gene duch Kết sàng lọc sử dụng ứng viên thuốc tiềm việc làm giảm tác động tế bào thần kinh sản sinh dopamine - 101 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Aaron Ciechanover, A H (2004) Nobel Prize Awardees in Chemistry, 2004 Nobel Prize Committee Adams MD, C S (2000) The genome sequence of Drosophila melanogaster Science 287 (5461) , 2185–95 Bilen, J & (2005) Drosophila as a model for human neurodegenerative disease Annual Review of Genetics , 39, 153-71 Celotto, A M (2005) Drosophila: a "model" model system to study neurodegeneration Molecular Interventions , 5, 5, 292-303 De, L C (1996) Oxidative inactivation of tyrosine hydroxylase in substantia nigra of aged rat Free Radical Biology & Medicine , 20, 1, 53-61 Doran JF, J P (1983) Isolation of PGP 9.5, a new human neurone-specific protein detected by high-resolution two-dimensional electrophoresis J Neurochem 40 (6) , 1542–1547 Duffy, J (2002) GAL4 system in Drosophila: A fly geneticist's Swiss army knife Genesis , 1-15 Feany, M B (2000) A Drosophila model of Parkinson's disease Nature , 404, 6776, 394-8 Fujikake N, N Y (2008) Heat shock transcription factor (HSF1)-activating compounds suppress polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of multiple molecular chaperones J Biol Chem , 283, 261 10 Fujikake, N N ((2008)) Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of multiple molecular chaperones J Biol Chem , 283(38): 26188 26197 11 Gong B, C Z (2006) Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory Cell 126 (4) , 775–788 12 Goodwill, K E (1997) Crystal structure of tyrosine hydroxylase at 2.3 A and its implications for inherited neurodegenerative diseases Nature Structural Biology , 4, 7, 578-85 - 102 - 13 Ha, E M (2005) A direct role for dual oxidase in Drosophila gut immunity Science (new York, N.y.) , 310, 5749, 847-50 14 Haavik, J A (1997) Generation of reactive oxygen species by tyrosine hydroxylase: a possible contribution to the degeneration of dopaminergic neurons? Journal of Neurochemistry , 68, 1, 328-32 15 Hashimoto, R & (2006) Genetic link between beta-sarcoglycan and the Egfr signaling pathway Biochemical and Biophysical Research Communications , 348, 1, 212-21 16 Higashiyama H, H F (2002 ) Identification of ter94, Drosophila VCP, as a modulator of polyglutamine-induced neurodegeneration Cell Death and Differentiation , (3): 264-273 17 Jankovic, J & (2007) Parkinson's disease and movement disorders Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 18 Kabuta, T F (2008) Aberrant interaction between Parkinson disease-associated mutant UCH-L1 and the lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Journal of Biological Chemistry , 283, 35, 23731-23738 19 Kaufman (1995) Tyrosine hydroxylase Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol Advances in Enzymology - and Related Areas of Molecular Biology 70 , 103–220 20 Leroy, E B (1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease Nature , 395, 6701, 451-2 21 Liu Y., F L (2002) The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect α-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility Cell , 111 (2), pp 209-218 22 Nagai, Y F (2003) Prevention of polyglutamine oligomerization and neurodegeneration by the peptide inhibitor QBP1 in Drosophila Hum Mol Genet , 12, 1253-1260, 23 Nagatsu (1995) Tyrosine hydroxylase: human isoforms, structure and regulation in physiology and pathology Essays Biochem 30 , 15–35 24 Obeso, J A.-O.-T (2008) Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson's disease Movement Disorders : Official Journal of the Movement Disorder Society , 23, 548-59 - 103 - 25 Pendleton, R G ( 2002) Effects of pharmacological agents upon a transgenic model of Parkinson's disease in Drosophila melanogaster The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics , 300, 1, 91-6 26 Reiter, L., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., & Bier, E (2001) A Systematic Analysis of Human Disease-Associated Gene Sequences In Drosophila melanogaster Genome Research 11 (6) , 1114–1125 27 Reyes Turcu FE, V K (2009) Activity and Cellular Roles of Ubiquitin-Specific Deubiquitinating Enzymes Annual Review of Biochemistry 78 , 363–97 28 Sang, T K (2005) Drosophila models of neurodegenerative disease Neurorx : the Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics , 2, 3, 438-46 29 Setsuie, R W (2007) Dopaminergic neuronal loss in transgenic mice expressing the Parkinson's disease-associated UCH-L1 I93M mutant Neurochemistry International , 50, 1, 119-129 30 Shin, M (2010) Transduced Tat-DJ-1 protein protects against oxidative stressinduced SH-SY5Y cells death and Parkinson disease mouse model Bioinformatics and Biomedicine Workshops (BIBMW), 2010 IEEE International Conference , 805 - 805 31 Snapinn, K W (2011) The UCHL1 S18Y polymorphism and Parkinson's disease in a Japanese population Parkinsonism and Related Disorders , 17, 6, 473-475 32 Sugano, W O.-K.-Y (February 01, 2008) The myeloid leukemia factor interacts with COP9 signalosome subunit in Drosophila melanogaster Febs Journal , 275, 3, 588-600 33 Sun, Y.-J O.-L ( 2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron Human Molecular Genetics , 12, 16, 19451958 34 Vila, M & (2004) Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease Nature Medicine , 10, - 104 -