Nghiên cứu tuyển chọn giống và tối ưu điều kiện nuôi trồng quả thể nấm bông tuyết trùng thảo isaria tenuipes peck thu thập ở việt nam

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nghiên cứu tuyển chọn giống tối ưu điều kiện nuôi trồng thể nấm Bông tuyết trùng thảo (Isaria tenuipes Peck.) thu thập Việt Nam Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ : ThS Trần Văn Cảnh ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nghiên cứu tuyển chọn giống tối ưu điều kiện nuôi trồng thể nấm Bông tuyết trùng thảo (Isaria tenuipes Peck.) thu thập Việt Nam Chủ nhiệm nhiệm vụ Trần Văn Cảnh Cơ quan chủ trì nhiệm vụ MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC BẢNG Error! Bookmark not defined DANH SÁCH CÁC HÌNH .Error! Bookmark not defined DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu a) Mục tiêu tổng quát b) Mục tiêu cụ thể c) Đối tượng phạm vi nghiên cứu d) Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu giới nấm BTTT (Isaria tenuipes) 1.1.1 Khái niệm BTTT (Isaria tenuipes) 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc nấm BTTT (Isaria tenuipes) 1.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học, hợp chất có hoạt tính sinh học giá trị dược liệu nấm BTTT (Isaria tenuipes) 1.1.4 Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối nấm BTTT (Isaria tenuipes) .10 1.1.4.1 Thành phần dinh dưỡng 10 1.1.4.2 Điều kiện nuôi cấy 12 1.1.5 Nghiên cứu sản xuất Beauvericin 17 1.2 Nghiên cứu nước nấm KSCT BTTT 17 1.2.1 Nghiên cứu phân bố nấm BTTT làm dược liệu, thực phẩm chức năng, 17 i 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học giá trị dược liệu nấm BTTT loài Isaria 18 1.2.3 Nghiên cứu nuôi trồng thể nấm BTTT loài Isaria 19 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nội dung nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng giống nghiên cứu 21 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp phân lập, nuôi cấy nấm BTTT 22 2.3.2 Phương pháp bảo quản nấm BTTT (Isaria tenuipes) 23 2.3.3 Phương pháp đánh giá tuyển chọn chủng giống nấm BTTT 25 2.3.3.1 Tuyển chọn giống dựa vào khả sinh trưởng phát triển 25 2.3.3.2 Dựa vào khả sinh Beauvericin Adenosine 26 2.3.4 Phương pháp tối ưu 26 2.3.5 Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 28 2.3.5.1 Nghiên cứu tối ưu công thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 28 2.3.5.2 Nghiên cứu tối ưu yếu tố điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 32 2.3.5.3 Thực nghiệm kiểm chứng thông số tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 34 2.3.6 Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 34 2.3.6.1 Nghiên cứu tối ưu công thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 34 ii 2.3.6.2 Nghiên cứu tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 36 2.3.6.3 Thực nghiệm kiểm chứng thông số tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 38 2.3.7 Nghiên cứu tối ưu số điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 38 2.3.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mức nồng độ dịch nấm BTTT lây nhiễm ấu trùng tằm dâu 38 2.3.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 39 2.3.7.3 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 39 2.3.7.4 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 40 2.3.7.5 Kiểm chứng thông số tối ưu cho nuôi trồng thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 41 2.3.8 Phương pháp thực nghiệm pilot nuôi trồng thể nấm BTTT 41 2.3.8.1.Phương pháp thực nghiệm pilot nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 41 2.3.8.2 Phương pháp thực nghiệm pilot nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 41 2.3.8.3.Phương pháp thực nghiệm pilot nuôi trồng thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 42 2.3.9 Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC) 42 2.3.10 Phân tích hàm lượng vi sinh, kim loại nặng thử nghiệm độc tính chuột 43 2.3.10.1 Khảo sát tiêu kim loại nặng (As, Pb, Cd, Hg) Vi sinh có hại (E.coli, Salmonella) sinh khối BTTT 43 2.3.10.2 Đánh giá độc tính cấp sinh khối nấm BTTT chuột 44 2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 45 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .46 iii 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm BTTT thu thập phân lập vùng núi Việt Nam .46 3.2 Tuyển chọn chủng nấm có khả sinh trưởng tốt cho hàm lượng Beauvericin Adenosine cao 48 3.2.1 Sự phát triển chủng nấm BTTT môi trường thạch 48 3.2.2 Khảo sát hàm lượng hoạt chất chủng nấm BTTT 50 3.2.3 Sự hình thành thể nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 môi trường thạch 52 3.2.4 Mô tả số đặc điểm sinh học sinh thái nấm BTTT chủng Isaria tenuipes VHI-2 .53 3.3 Tối ưu số điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 54 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến phát triển thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 54 3.3.2 Tối ưu công thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 57 3.3.3 Tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 64 3.3.4 Thực nghiệm kiểm chứng điều kiện tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 70 3.4 Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 71 3.4.1 Tối ưu công thức dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 71 3.4.2 Tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 78 3.4.3 Thực nghiệm kiểm chứng yếu tố tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 84 3.5 Nghiên cứu số điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 86 3.5.1 Ảnh hưởng nồng độ bào tử đến khả lây nhiễm phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 86 iv 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 87 3.5.3 Ảnh hưởng độ ẩm đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 88 3.5.4 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 89 3.6 Thực nghiệm quy mô pilot nuôi trồng thể nấm BTTT chủng Isaria tenuipes VHI-2 .92 3.6.1 Thực nghiệm quy mô pilot nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 92 3.6.2 Thực nghiệm quy mô pilot nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 96 3.6.3 Thực nghiệm quy mô pilot nuôi trồng thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 99 3.6.4 Đánh giá hàm lượng hoạt chất từ nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 nghiên cứu 105 3.7 Kiểm tra tiêu an toàn thực phẩm thể nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 đánh giá độc tính cấp chuột .106 3.7.1 Phân tích tiêu kim loại vi sinh thể nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 106 3.7.2 Đánh giá độc tính cấp sinh khối nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 chuột 107 3.7.3 Bảng kê dự tính chi phí sản xuất nấm BTTT Isaria tenuipes 109 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 4.1 Kết luận 110 4.2 Kiến nghị 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 v DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Mô tả yếu tố tối ưu hóa cơng thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnhError! Bookmark not defined.0 Bảng 2.2 Nghiệm thức tối ưu công thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh Error! Bookmark not defined.1 Bảng 2.3 Mô tả yếu tố tối ưu hóa điều kiện ngoại cảnh ni trồngError! Bookmark no Bảng 2.4 Nghiệm thức tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh Error! Bookmark not defined.3 Bảng 2.5 Mô tả yếu tố tối ưu hóa cơng thức thành phần dinh dưỡngError! Bookmark Bảng 2.6 Nghiệm thức tối ưu hóa cơng thức thành phần dinh dưỡngError! Bookmark not Bảng 2.7 Mô tả yếu tố tối ưu hóa điều kiện ngoại cảnh ni trồngError! Bookmark no Bảng 2.8 Nghiệm thức tối ưu hóa điều kiện ngoại cảnh nuôi trồngError! Bookmark not d Bảng 2.9 Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50 Error! Bookmark not defined.5 Bảng 3.1 Mô tả đặc điểm 10 chủng nấm BTTT thu thập phân lập đượcError! Bookmar Bảng 3.2 Sự phát triển đường kính khuẩn lạc chủng nấm BTTT môi trường thạch sau 16 ngày nuôi .49 Bảng 3.3 Hàm lượng hoạt chất Beauvericin Adenosine sinh khối hệ sợi nấm BTTT chủng 51 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nguồn N đến trình phát triển thể nấm BTTTError! Book Bảng 3.5 Kết thực nghiệm tối ưu công thức thành phần dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh .58 vi Bảng 3.6 Bảng giá trị R2 luyện R2 thử kiểm tra mơ hình tối ưu cơng thức dinh dưỡng ni trồng thể BTTT môi trường lỏng tĩnh 63 Bảng 3.7 Kết kiểm chứng công thức dinh dưỡng tối ưuError! Bookmark not defined Bảng 3.8 Kết thực nghiệm tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh Error! Bookmark not defined.5 Bảng 3.9 Bảng giá trị R2 luyện R2 thử, kiểm tra mô hình tối ưu điều kiện ngoại cảnh ni trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh 66 Bảng 3.10 Kết thực nghiệm kiểm chứng tối ưu công thức dinh dưỡng điều kiện nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnhError! Bookmark not de Bảng 3.11 Kết thực nghiệm tối ưu công thức dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn Error! Bookmark not defined.2 Bảng 3.12 Bảng giá trị R2 luyện R2 thử kiểm tra mơ hình tối ưu cơng thức dinh dưỡng nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắnError! Bookmark not d Bảng 3.13 Kết thực nghiệm kiểm công thức dinh dưỡng tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 78 Bảng 3.14 Kết thực nghiệm tối ưu điều kiện ngoại cảnh nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn 79 Bảng 3.15 Bảng giá trị R2 luyện R2 thử kiểm tra mơ hình tối ưu điều kiện ngoại cảnh ni trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắnError! Bookmark not de Bảng 3.16 Kết kiểm chứng yếu tố tối ưu nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn Error! Bookmark not defined.5 Bảng 3.17 Ảnh hưởng nồng độ bào tử đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu .86 Bảng 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm dâu 88 vii Bảng 3.19 Ảnh hưởng độ ẩm đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm .89 Bảng 3.20 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm Error! Bookmark not defined.0 Bảng 3.21 Kết kiểm chứng ảnh hưởng số điều kiện đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằm Error! Bookmark not defined.0 Bảng 3.22 Kết kiểm chứng ảnh hưởng số điều kiện nuôi trồng đến phát triển thể nấm BTTT nhộng tằmError! Bookmark not defined.1 Bảng 3.23 Kết thực nghiệm nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường lỏng tĩnh quy mô pilot Error! Bookmark not defined.2 Bảng 3.24 Kết thực nghiệm nuôi trồng thể nấm BTTT môi trường bán rắn quy mô pilot 96 Bảng 3.25 Kết thực nghiệm nuôi trồng thể nấm BTTT môi nhộng tằm dâu quy mô pilot Error! Bookmark not defined.0 Bảng 3.26 Hàm lượng Beauvericin thu nhận từ thể số loàiError! Bookmark n Bảng 3.27 Hàm lượng Adenosine thu nhận từ thể số loàiError! Bookmark no Bảng 3.28 Kết kiểm tra tiêu an toàn thực phẩmError! Bookmark not defined Bảng 3.29 Kết khảo sát độc tính cấp đường uống sinh khốiError! Bookmark not Bảng 3.30 Khối lượng (g) chuột nhắt mơ hình độc tính cấpError! Bookmark not Bảng 3.31 Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50 Error! Bookmark not defined viii Thu nhận thể - Đặc điểm thể: Quả thể tươi màu vàng cam, dài > cm, sợi nhỏ 0,5 – 1,2 mm - Kết đạt được: + Khối lượng thể tươi: 58 g tươi/hộp (27.410 g tươi/quy trình) + Lượng Beauvericin: 2.430 mg/quy trình, Thu sinh khối + Lượng Adenosine: 1.730 mg/quy trình Bước Phun dịch nấm Bước Tằm hóa nhộng bị nhiễm nấm Bước Ủ sợi tạo mầm thể Bước Quả thể hình thành thu hoạch Hình 3.15 Quả thể nấm BTTT nhộng tằm dâu quy mô pilot 104 3.6.4 Đánh giá hàm lượng hoạt chất từ nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 nghiên cứu Do có nghiên cứu thu nhận Beauvericin từ thể nuôi trồng môi trường lỏng tĩnh, nên kết so sánh với hàm lượng thể nuôi trồng môi trường bán rắn Sumalee cs (2011) Kết bảng 3.26 cho thấy, hàm lượng Beauvericin thu nhận từ thể nấm BTTT chủng I.tenuipes VHI-2 nuôi trồng môi trường đạt từ 0,92 – 1,00 mg/g cao chủng I tenuipes BCC31640 nuôi môi trường bán rắn với 0,915 mg/g Bảng 3.26 Hàm lượng Beauvericin thu nhận từ thể số loài Chủng nấm Hàm lượng Beauvericin (mg/g) I tenuipes VHI-2 0,97 I tenuipes VHI-2 1,00 I tenuipes VHI-2 0,92 I tenuipes BCC31640 Tác giả Kết nuôi thể pilot môi trường lỏng Kết nuôi thể pilot môi trường bán rắn Kết nuôi thể pilot nhộng tằm dâu Sumalee cs (2011) 0,92 thể nuôi bán rắn Kết bảng 3.26 cho thấy, hàm lượng Adenosine thu nhận từ thể nuôi trồng môi trường nghiên cứu đạt từ 0,58 – 0,78 mg/g cao so với chủng I tenuipes (chỉ đạt 0,33 mg/g) từ nghiên cứu Hong cs (2007) 105 Bảng 3.27 Hàm lượng Adenosine thu nhận từ thể số loài Chủng nấm Hàm lượng Adenosine (mg/g) I tenuipes VHI-2 0,58 I tenuipes VHI-2 0,71 I tenuipes VHI-2 0,78 I tenuipes spp 0,33 Tác giả Kết nuôi thể pilot môi trường lỏng Kết nuôi thể pilot môi trường bán rắn Kết nuôi thể pilot nhộng tằm dâu Hong cs (2007) 3.7 Kiểm tra tiêu an toàn thực phẩm thể nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 đánh giá độc tính cấp chuột 3.7.1 Phân tích tiêu kim loại vi sinh thể nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 Bảng 3.28 Kết kiểm tra tiêu an toàn thực phẩm Quả thể Quả thể Quả thể ĐVT MT lỏng MT Chỉ tiêu nhộng tằm tĩnh bán rắn As mg/Kg 0,25 0,11 No Hg mg/Kg No No No Pd mg/Kg No No No Cd mg/Kg 0,12 0,07 No E.coli Cfu/g No No No Sammoela Cfu/g No No No Ghi chú: No Không phát hiện, kết kiểm nghiệm Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp.HCM (CASE) 106 Kết phân tích phát As Cd khối lượng thể nhân nuôi môi trường lỏng tĩnh môi trường bán rắn, không phát thể nuôi nhộng tằm dâu Theo QCVN – 2:2011/BYT hàm lượng Cd giới hạn cho phép 1,0 mg/kg thực phẩm bổ sung từ thiên nhiên 0,2 mg/kg nấm ăn, kết nghiên cứu phát Cd cao 0,12 mg/kg Cũng theo QCVN này, hàm lượng As giới hạn cho phép loại thực phẩm, rau, gia vị từ 0,5 – 1,0 mg/g, kết nghiên cứu phát As đạt cao 0,25 mg/kg 3.7.2 Đánh giá độc tính cấp sinh khối nấm BTTT chủng I tenuipes VHI-2 chuột Bảng 3.29 Kết khảo sát độc tính cấp đường uống sinh khối Lơ thí nghiệm Liều cao chiết Số động vật thử Số ĐVTN chết sau (mg/kg) nghiệm (con) ngày Lô 2500 mg/kg Lô 2500 mg/kg Liều 2500 mg/kg liều đậm đặc dung nạp cho chuột nhắt trắng thơng qua đường uống kim cho uống chuyên dụng Chúng tơi ghi nhận khơng có tượng gây chết động vật thử nghiệm, khơng có triệu chứng bất thường sau giờ, 24 sau cho uống (bảng 3.29) Chuột ăn uống, hoạt động bình thường, phân nước tiểu khơng có bất thường, quan sát thêm đến ngày chuột hoạt động bình thường, ăn khỏe, tăng thể trọng (bảng 3.30) Từ bảng số liệu cho thấy, khối lượng chuột nhắt tăng theo thời gian thử nghiệm Chứng tỏ, sinh khối I tenuipes không tác động tiêu cực đến khối lượng chuột nhắt 107 Bảng 3.30 Khối lượng (g) chuột nhắt mô hình độc tính cấp Thời gian Khối lượng trung bình chuột (g) a,b Ban đầu ngày 20.836 ± 1,769 a 27.214 ± 2,061b Khối lượng trung bình chuột với kí tự theo sau khác khác đạt ý nghĩa thống kê (p