Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut h5n1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG HÀ GS TS CHU HOÀNG MẬU THÁI NGUYÊN - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học chuyên ngành Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa công bố công trình khác Tác giả Nguyễn Thu Hiền ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu Hoàng Hà tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn toàn thể cán phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho trình nghiên cứu thực đề tài luận án Xin cảm ơn giúp đỡ nhóm nghiên cứu đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tập thể cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu đề tài luận án Tôi xin cảm ơn thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nơng nghiệp Phịng Quản lý sau đại học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm lãnh đạo Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện Ban chủ nhiệm khoa Khoa học bản, Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Ngun Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập thực thành cơng luận án Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Hiền iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Bệnh cúm gia cầm dịch bệnh cúm A/H5N1 1.1.2 Virus cúm A/H5N1 1.2 VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1 19 1.2.1 Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 19 1.2.2 Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 22 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT 27 1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương 27 1.3.2 Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen chọn giống đậu tương .38 1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật 43 Chương 2: VẬT LIỆ H ƠN H N HI N C 48 2.1 VẬT LIỆU 48 1.1 Nguyên liệu thực vật 48 Chủng vi khu n loại vector 48 2.1.3 Hóa chất 48 2.1.4 Thiết bị 48 iv PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2.2.1 Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen 50 Các phương pháp sử dụng xây dựng mô hình tái sinh chuyển gen in vitro 56 Phương pháp phân tích chuyển gen 61 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN 62 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U VÀ THẢO LUẬN 63 3.1 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 63 3.1.1 Kết thiết kế vector chuyển gen mang gen HA 63 3.1.2 Kết thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 77 3.2.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 85 3.2.1 Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen hai giống đậu tương ĐT1 DT84 86 3.2.2 Kết chuyển gen gus vào đậu tương thông qua vi khu n 94 3.2.3 Kết chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào đậu tương 99 3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 101 3.3.1 Phân tích có mặt đoạn gen HA1 dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 101 Phân tích dịng đậu tương chuyển gen hệ T1 103 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 107 C C B I B O ĐÃ CÔN BỐ LI N Q AN ĐẾN LUẬN ÁN 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 v DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyrigone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine purin bp Base pair CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Môi trường nảy mầm gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid kb Kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinothricin RM Môi trường rễ SDS Sodium dodecylsulfat vi SIM Môi trường tạo chồi SEM Môi trường kéo dài chồi Taq Thermus Aquaticus T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật Ti- plasmid Plasmid tạo khối u T0, T1, T2 Các hệ đậu tương chuyển gen T0 Cây đậu tương chuyển gen tái sinh từ chồi T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 T2 Hạt chuyển gen T1 nảy mầm thành T2 Vir Virulence Region v/p vòng/phút X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide YEP Yeast extract peptone vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 50 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 50 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation 52 Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid 52 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR 54 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt enzyme hạn chế 55 Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi khu n 56 Bảng 2.8 Thành phần loại môi trường nuôi cấy in vitro 57 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA 66 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1 78 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả nảy 86 mầm hạt Bảng 3.4 ết tái sinh đa chồi môi trường chứa AP 89 nồng độ khác Bảng 3.5 Ảnh hưởng GA IAA đến khả kéo dài chồi 91 Bảng 3.6 Ảnh hưởng I A đến khả tạo rễ 92 Bảng 3.7 Kết chuyển gen gus vào nách mầm đậu tương 95 thông qua vi khu n A tumefacines Bảng 3.8 Khả tái sinh thông qua nách mầm giống đậu tương ĐT1 sau biến nạp cấu trúc gen HA1 100 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 1.1 Hình thái, mơ hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein 11 virus cúm A/H5N1 Hình 1.2 Mơ hình cấu trúc protein Hemagglutinin 15 Hình 1.3 Sơ đồ xâm nhiễm virus cúm A/H5N1 tế bào chủ 18 Hình 1.4 Khối u thực vật A tumefaciens 30 Hình 1.5 Cấu trúc Ti- Plasmid 32 Hình 1.6 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens 34 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt 49 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh chuyển gen vào đậu tương 59 H nh Trình tự A cấu trúc đoạn gen nhân tạo 64 (SLHEP) (B) Hình 3.2 Trình tự gen HA thay đổi mã ba HAop) 65 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra kết PCR nhân đoạn gen 67 HAop XhoI-HA/HindIII-HA Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sản ph m thơi gel 68 Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector 69 p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1 Hình 3.6 Hình ảnh khu n lạc sau biến nạp plasmid tái tổ hợp 70 vào E.coli Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết chọn dòng plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA 71 116 expressing a bacterial 4hydroxyphenylpyruvate dioxygenase which provides strong herbicide tolerance Plant Biotechnol J 5: pp.118–133 46 Edwards K., Johnstone C and Thompson C (1991) A simple and rapid method for thepreparation of genomic plant DNA for PCR analysis Nucleic Acids Res 19: pp.1349 47 FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 48 Finer J.J and Nagasawa A (1988) Development of an embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill.) Plant Cell Tissue Organ Cult 15: pp.125–136 49 Hanif M (2004), Chracterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of fungi, University of Helsinki 50 Hansen G and Wright M.S (1999) Recent advances in the transformation of plants Trends Plant Sci 4: pp.226–231 51 Herman E.M.,Helm R.M., Jung R and Kinney A.J (2003) Genetic modification removes an immunodominant allergen from soybean Plant Physiol 132:pp 36–43 52 Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G and Fraley R.T (1985) A simple and general method for transferring genes into plants Science 227: pp.1229–1231 53 Ishimoto M., Rahman S.M., Hanafy M.S., Khalafalla M.M., El-Shemy H.A., Nakamoto Y., Kita Y.,Takanashi K., Matsuda F., Murano Y et al (2010) Evaluation of amino acid content and nutritional quality of transgenic soybean seeds with high-level tryptophan accumulation Mol Breed 25:pp 313–326 117 54 efferson R.A., avanagh T.A, and evan M.W 19 , “GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: pp 3901-3907 55 Kapusta J., Modelska A, Figlerowicz M., Pniewski T, Letellier M., Lisowa O., Yusibov V., Koprowski H., Plucienniczak A., Legocki AB (1999) A plantderived edible vaccine against hepatitis B virus The FASEB Journal 13:pp 1796 - 1799 56 Khalafalla M.M., S.M Rahman, H.A El-Shemy, Y Nakamoto, K Wakasa and M Ishimoto (2005) Optimization of particle bombardment conditions by monitoring of transient sGFP(S65T) expression in transformed soybean Breed Sci 55:pp 257–263 57 Khandelwal A., Stita L., Shaila MS (2003) Expression of hemagglutinin protein of rinderpest virus in transgenic tobacco and immunogenicity of plant-derived protein in a mouse model Virology 308: pp.207-215 58 Kita Y., M.S Hanafy, Deguchi M., Hasegawa H.,Terakawa T., Kitamura K and Ishimoto M (2009) Generation and characterization of herbicideresistant soybean plants expressing novel phosphinothricin N- acetyltransferase genes Breed Sci 59: pp.245–251 59 Kodihalli S., Goto H., Kobasa D L., Krauss S., Kawaoka Y., Webster R G 1999 , “DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice”, J Virol 73(3): pp 2094-2098 60 Laemmli U K (1970),Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227:pp.680-685 61 Lal P., Ramachandran V G., Goyal R., Sharma R , “Edible vaccines: current status and future” Indian J Med Microbiol 25(2): pp 93-102 118 62 Lauterslager T.G.M., Florack D.E.A, Wal T.J.V, Molthoff J.W., Langeveld J.P.M., Bosch D., Boersma W.J.A., Hilgers L.A.T (2001) Oral immunisation of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LT-B Vaccine 19: pp.2749 - 2755 63 Le Q M., Kiso M., Someya K., Sakai Y T., Nguyen T H., Nguyen K H., Pham N D., Ngyen H H., Yamada S., Muramoto Y., Horimoto T., Takada A., Goto H., Suzuki T., Suzuki Y., a aoka Y , “Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus”, Nature, 438(7069): pp.754 – 758 64 Liu S.J., Z.M Wei and Huang J.Q (2008) The effect of cocultivation and selection parameters on Agrobacterium- mediated transformation of Chinese soybean varieties Plant Cell Rep 27:pp 489–498 , “Sensitive t o-color whole-mount 65 Long S DNA Rebagliati M in situ hybridizations using digoxygenin - DNA dinitrophenol-labeled RNA probes“ BioTechniques 32:pp 494–500 66 Lopez S.J., Kumar R.R., Pius P.K., Muraleedharan N (2004), “Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis [L.] O untze ” Plant molecular biology reporter 22: pp 201a-201j 67 Lucca P., Ye X., Potrykus I regeneration of transgenic rice plants , “Effective selection DNA ith mannose as selective agent” Mol Breed 7: pp 43–49 68 Luong G and Palese P 199 , “Genetic analysis of influenza virus” Curr Opinion Gen Develop, 2: pp 77-81 69 Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J (1998) Edible vaccine protects mine against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene Vaccine 16: pp 1336-1343 119 70 Mason H.S., Lam D.M.K., Arntzen C.J (1992) Expresion of hepatitis B surface antigen in transgenic plants Proc Natl Acad Sci USA 89: pp.1745- 1749 71 Mason H.S., Warzecha H., Mor T., Arntzen C.J (2002) Edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, Tet C Phytochemistry 65: pp 989-994 72 Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J., Gubler F., Jacobsen J.V , “Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation ith adjacent ‘t in T-DNAs’ on stDNAard Agrobacterium transformation vector” Mol Breed 7: pp 195- 202 73 Maughan P.J., Philip R., Cho M.J., Widholm J.M and Vodkin L.O (1999) Biolistic transformation, expression, and inheritance of bovine βcasein in soybean (Glycine max) In Vitro Cell Dev Biol Plant 35: pp.344–349 74 Muhitch M 199 , “Characterization of pedicel β-glucuronidase activity in developing maize (Zea mays kernels” Physiol Plant 104: pp.423–430 75 Murphy R., Webster R G 1996 , “Orthomyxoviruses” In: Fields B.N., Knipe D.M., and Howley P.M et al Editors Virology Philadelphia Lippincott-Raven Publishers, pp.1397-1445 76 Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck AR., Hansen G , “The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Rep 19: pp 798–803 77 Nguyen T D., Nguyen T.V., Vijaykrishna D., Webster R G., Guan Y., Peiris M S and Smith G D , “Multiple Sublineages of 120 Influenza A Virus (H5N1) Vietnam 2005- ”, Emerging infectious diseases, 14(4): pp 632 - 636 78 Nishizawa K., Kita A., Doi C., Yamada Y., Ohinata K., Yoshikawa M and Ishimoto M (2008) Accumulation of the bioactive peptides, novokinin, LPYPR and rubiscolin, in seeds of genetically modified soybean Biosci Biotechnol Biochem 72: pp.3301–3305 79 Nishizawa K., Takagi K.,Teraishi M., Kita A and M Ishimoto (2010) Application of somatic embryos to rapid and reliable analysis of soybean seed components by RNA interference-mediated gene silencing Plant Biotechnol 27:pp 409–420 80 Nyilas I., Acs K., Papp T., Nagy E., Vagvolgyi C (2005), “Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of Mucor circinellnoides”, Fonia Microbiology, 50 (5): pp 415 – 420 81 Ohme-Takagi M., Taylor C.B., Newman T.C., Green P.J 199 , “The effect of sequences with high AU content on mRNA stability in tobacco” Proc Natl Acad Sci USA 90:pp.11811-11815 82 Olhoft P.M and Somers D.A.(2001)L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells Plant Cell Rep 20: pp.706–711 83 Olhoft P.M and Somers D.A (2007) Soybean In: Pua E.C and Davey M.R (eds.) Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol 61 , Springer, Berlin, pp 3–27 84 Olhoft P.M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N.C and Somers D.A (2001) The role of thiol compounds in increasing Agrobacteriummediated transformation of soybean cotyledonary-node cells Plant Cell Rep 20: pp.731–737 121 85 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M and Somers D.A (2003) Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method Planta 216:pp 723–735 86 Owens L.D and Cress D.E (1985) Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids Plant Physiol 77: pp.87–94 87 Palese P., Shaw M L., 2001, Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication, Fields Virology, 5th edition D.M Knipe and P.M Howley, Editors 2006, Lippencott Williams and Wilkins: Philadelphia ISBN-10: 0-7817-6060-7: pp.1647-1689 88 Parrott W.A., Hoffman L.M., Hildebrand D.F., Williams E.G.and Collins G.B (1989a) Recovery of primary transformants of soybean Plant Cell Rep 7: pp.615–617 89 Paz M.M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Banerjee A.K and Wang K (2004) Assessment of conditions affecting Agrobacterium- mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant Euphytica 136: pp.167–179 90 Paz M.M., Martinez J.C.,Kalvig A.B., Fonger T.M and Wang K (2006) Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacteriummediated soybean transformation Plant Cell Rep 25: pp.206–213 91 Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L., Fischhoff D.A 1991 , “Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes” Proc Natl Acad Sci USA 88: pp 3324-3328 92 Peyre M., Fusheng G., Desvaux S., Roger F ,“Avian influenza vaccinesa practical review in relation to their alication in the field with a focus on the Asian experience”, Epidemiology and infection,137(1): pp.1.-21 122 93 Prel A., Le Gall-Reculé G., estin V , “Achievement of avian influenza virus-like particles that could be used as a subunit vaccine against low- pathogenic avian influenza strains in ducks”, Avian pathology, 37(5):pp 513- 520 94 Qi Q., Huang J., Crowley J., Ruschke L., Goldman B.S., Wen L and Rapp W.D.(2011) Metabolically engineered soybean seed with enhanced threonine levels: biochemical characterization and seedspecific expression of lysine-insensitive variants of aspartate kinases from the enteric bacterium Xenorhabdus bovienii Plant Biotechnol J 9: pp.193–204 95 Qiao C., Tian G., iang Y., Li Y., Shi , Yu , Chen H , “Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China”, Annals of the New York Academy of Sciences,1081: pp 182-192 96 Rao S.S and Hildebrand D (2009) Changes in oil content of transgenic soybeans expressing the yeast SLC1 gene Lipids 44: pp.945–951 97 Ren G.X., Zhang B., Hong F.X (2007) Overexpression of a NTR1 in transgenic soybean confers tolerance to water stress Plant Cell Tiss Organ Cult 9: pp.177-183 98 Rodrigo SA, Caccia S, and Ferré J (2008) Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin-binding and pore-forming activity in brush border membrane vesicles prepared from anterior and posterior midgut regions of Lepidopteran larvae Applied and Environmental microbiology 74 (6): pp.1710-1716 99 Rodrigo S.A., Maagd R.A., Avilla C., Bakker P.L., Molthoff J., González ZJE and Juan FJ (2006) Lack of Detrimental Effects of Bacillus thuringiensis Cry Toxins on the InsectPredator Chrysoperla carnea: a Toxicological,Histopathological, and Biochemical Analysis Applied and Environmental microbiology 72 (2):pp 1595-1603 123 100 Sato H., Yamada T.,Kita Y.,Ishimoto M and Kitamura K (2007) Production of transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutaka Plant Biotechnol 24:pp 533–536 101 Sato S., Newell C., Kolacz K., Tredo L., Finer J and Hinchee M (1993) Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems Plant Cell Rep 12:pp 408–413 102 Skeik N., abr F I , “Influenza viruses and the evolution of avian influenza virus H5N1”, International journal of infectious diseases , 12(3): pp 233-238 103 Somers D.A., Samac D.A and Olhoft P.M (2003) Recent advances in legume transformation Plant Physiol 131:pp 892–899 104 Stanton B Gelvin, , “Agrobacterium mediated plant transformation: the biology behind the “Gene – ockeying” tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1):pp 16 – 37 105 Subbarao, K and C Luke (2007), H5N1 viruses and vaccines PLoS Pathog, 3(3): pp 40-45 106 Swayne D.E., Suarez D.L , “Highly pathogenic avian influenza”, Revue scientifique et technique, 19(2): pp 463-482 107 Sala F., Rigano M.M., Barbante A., Basso B., Walmsley A.M., Castiglione S , “Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives” Vaccine 21: pp 803-808 108 Sambrook J., Fritsch E.F and Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 109 Schlamp K., Weinmann A., Krupp M., Maass T., Galle P.R, Teufel A “ lot ase: A northern blot database” Gene 427: pp 47-50 124 110 Serres R., Mc Cown B., Zeldin E 199 “Detectable glucuronidase activity in transgenic cranberry is affected by endogenous inhibitors DNA plant development” Plant Cell Rep 16:pp 641–646 111 Simoens C., Alliotte T., Mendel R., Muller A., Schiemannm J Van Lijsebettens M., Schell J., van Montagu M., DNA inze D 19 , “A binary vector for transferring genomic libraries to plants” Nucl Acids Res, 14, pp 8073 – 8090 112 Silva J.V., Garcia A.B., Flores V.M.Q., Macedo Z.S., Acosta E.M , “Phytosecretion of enteropathogenic Escherichia coli pilin subunit A in transgenic tobacco and its suitability for early life vaccinology”, Vaccine 20: pp 2091-2101 113 Tacket CO, Mason HS 1999 , “A revie of oral vaccination ith transgenic vegetables” Microbes and Infection 1: pp 777-783 114 Tacket CO, Pasetti MF, Edelman RE, Howard JA, Streatfield S (2004), “Immunogenicity of recombinant LT-B delivered orally to humans in transgenic corn” Vaccine 73: pp 301-310 115 Takagi K., K Nishizawa, A Hirose, A Kita and M Ishimoto (2011) Manipulation of saponin biosynthesis by RNA interferencemediated silencing of βamyrin synthase gene expression in soybean Plant Cell Rep 30: pp.1835–1846 116 Takahashi M., Uematsu Y., Kashiwaba K.,Yagasaki K.,Hajika M., Matsunaga R., Komatsu K and Ishimoto M (2003) Accumulation of high levels of free amino acids in soybean seeds through integration of mutations conferring seed protein deficiency Planta 217: pp.577–586 117 Tanaka A., Mita S., Ohta S., Kyozuka J., Shimamoto K., Nakamura K 199 , “Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice but not in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficient splicing of the intron” Nucleic Acids Res 18: pp 6767-6770 125 118 Tavva V.S., Kim Y.H., Kagan I.A., Dinkins R.D., Kim K.H and Collins G.B (2007) Increased α-tocopherol content in soybean seed overexpressing the Perilla frutescens γ-tocopherol methyltransferase gene Plant Cell Rep 26:pp 61–70 119 Goodwin P., Arntzen C.J., Mason H.S , “Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis ” Proc Natl Acad Sci USA 102 :pp 3378-3382 120 Thanavala Y., Yang Y., Lyon P., Mason H.S., Arntzen C.J (1995), “Immunogennicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen” Proc Natl Acad Sci USA 92:pp 3358-3361 121 Thomasset B, Ménard M, Boetti H, Denmat LA, Inzé D, Thomas D 1996 , “β-Glucuronidase activity in transgenic DNA non-transgenic tobacco cells: specific elimination of plant inhibitors DNA minimization of endogenous GUS background” Plant Sci 113: pp.209–219 122 Thu T.T., Son L.V., Binh L.T., Angenon G , “Development of a plant based veterinary oral vaccine to combat avian influenza in Vietnam” Abstract BPBA Symposium on Secondary Metabolites and Molecular Farming, GentBelgium,7th Novermber 2008 123 Tian G., Zhang S., Li Y., Bu Z., Liu P., Zhou J., Li C., Shi J., Yu K., Chen H , “Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1- inactivated vaccine developed by reverse genetics”, Virology, 341(1): pp 153- 158 124 Topping D.L., Storer G.B, Calvert G.D., Illman R.J., Oakenfull D.G and Weller R.A (1980) Effect of dietary saponins on fecal bile acids and neutral sterols, plasma lipids, and lipoprotein turnover in the pig Am J Clin Nutr 33:pp 783–786 126 125 Tregoning J.S., Maliga P., Dougan G., Nixon P (2004) New advances in production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC Phytochemistry 65: pp 989-994 126 Tregoning JS, Nixon P, Kuroda H, Svab Z, Clare S, Bowe F, Fairweather N, Ytterberg J, van Wijk KJ, Dougan G, Maliga P (2003), “Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts” Nucleic Acids Res 31: pp 1174-1179 127 Trick, H.N and J.J Finer (1998) Sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue Plant Cell Rep 17: pp.482–488 128 Tripurani S.K, Reddy N.S, Sambasiva-Rao K.R.S (2003) Green revolution vaccines, edible vaccines African Journal of Biotechnology (12): pp 679-683 129 Tuong Van Nguyen (2008), Genetic engineering of grain sorghum (Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological Siences 130 Uiprasertkul M., Kongchanagul Kitphati R.,Puthavathana A.,Ungchusak K., P.,Kriwong Angkasekwinai R., S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N., and Auewarakul P , “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A H5N1 virus in humans” Emerg Infect Dis, 13(5): pp 708-712 131 Valente M.A.S., Faria J.A.Q.A., Soares-Ramos J.R.L., Reis P.A.B., Pinheiro G.L., Piovesan N.D., Morais A.T., Menezes C.C., Cano M.A.O and Fietto L.G et al (2009) The ER luminal binding protein (BiP) mediates an increase in drought tolerance in soybean and delays 127 drought-induced leaf senescence in soybean and tobacco J Exp Bot 60:pp 533–546 132 Van Eenennaam A.L., Lincoln K., Durrett T.P ,Valentin H.E., Shewmaker C.K., Thorne G.M., Jiang J.,Baszis S.R, Levering C.K and Aasen E.D (2003) Engineering vitamin E content: from Arabidopsis mutant to soy oil Plant Cell 15: pp.3007–3019 133 Vey M., Orlich M., Adler S., Klenk H D., Rott R., Garten W (1992), “Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R”, Virology, 188(1), pp 408-413 134 Wagner, R., M Matrosovich, and H Klenk (2002 , “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections” Med Virol, 12(3): pp 159-166 135 Walmsley A.M., Arntzen C.J (2000) Plants for delivery of edible vaccines Current Opinion in Biotechnology 11: pp 126-129 136 Wang A.S., Evans R.A., Altendorf P.R., Hanten J.A., Doyle M.C., Rosichan L , “A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplast” Plant Cell Rep 19: pp.654–660 137 Wang X.G., Zhang G.H., Liu C.X., Zhang Y.H., Xiao C.Z., Fang R.X (2001) Purified cholera toxin B subunit from transgenic tobacco plants possesses authentic antigenicity Biotechnology Bioengineering 72:pp 490-494 138 Warzecha H., Mason H.S., Lane C, Tryggvesson A., Rybicki E., Williamson A.L, Clements J.D, Rose RC (2003) Oral Immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato American Society for Microbiology 77(16): pp 8702-8711 128 139 Weber T and N Stilianakis , “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds” Emerg Infect Dis, 13(8): pp 1139-1143 140 Webster , Cooney M.L., Huang Z., Drew D.R., Ramshaw I.A., Dry I.B., Strugnell R.A., Martin J.L., Wesselingh S.L (2002) Successful boosting of a dna measles immunization with an oral plant-derived measles virus vaccine J Virol 76: pp.7910-7912 141 Webster R.G (1998), Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis, 4(3): pp 436-441 142 Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N.N., Govorkova E.A., Ellis T.M., Dyrting K.C., Sit T., Perez D.R., and Shortridge K.F , “Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China” J Virol, 76:pp 118-126 143 WHO (2011), Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness WHO report 144 WHO, guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies inrelation to Biological and Pharmaceutical Products WHO geneva 145 Wright M., Dawson J., Dunder E , “Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) DNA wheat (Triticum aestivum L.) using the hosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker” Plant Cell Rep 20: pp 429–436 146 Wu W., Chen Y., Wang P., Song W., Lau S., Rayner J., Smith G., Webster R., Peiris J., Lin T., Xia N., Guan Y., and Chen H (2008), “:Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from ” J Virol, 282(4): pp.1798-17807 to 129 147 Xinping YI and Deyue YU (2006) Transformation of multiple soybean cultivars by infecting cotyledonary-node with Agrobacterium tumefaciens African Journal of Biotechnology (20): 1989-1993 148 Xue R.G., Xie H.F and Zhang B (2006) A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells Biotechnol Lett 28:pp 1551–1557 149 Yamada T., Watanabe S., Arai M., Harada K and Kitamura K (2010) Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush increased frequency of Agrobacterium-mediated transformation in soybean Plant Biotechnol 27: pp.217–220 150 Yamada, Y., K Nishizawa, M Yokoo, H Zhao, K Onishi, M Teraishi, S Utsumi, M Ishimoto and M Yoshikawa (2008) Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds accumulating novokinin Peptides 29: pp.331–337 151 Yamada S., Y Suzuki, T Suzuki, M Le, C Nidom, Y Sakai-Tagawa, Y Muramoto, M Ito, M Kiso, T Horimoto, KShinya, T Sawada, M Kiso, T Usui, T Murata, Y Lin, A Hay, L Haire, D Stevens, R Russell, S Gamblin, J Skehel, and Y Kawaoka (2006), Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors Nature, 444(7117): pp 378-382 152 Zeng P., Vadnais D.A , Zhang Z and Polacco J.C (2004) Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] Plant Cell Rep 22: pp.478–482 153 Zhang Z., Xing A., Staswick P and Clemente T.E (1999) The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacteriummediated transformation of soybean Plant Cell Tissue Organ Cult 56: pp.37–46 130 154 Zhao, Z., Shortridge K., M.G M, Guan Y., and Wan X (2008), Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses J Gen Virol, 89(9): pp.2182-2193 155 Zhou H., Jin M., Yu Z., Xu X., Peng Y., Wu H., Liu J., Liu H., Cao S., and Chen H (2007), Effective small interfering RNAs targeting matrix and nucleocapsid protein gene inhibit influenza A virus replication in cells and mice Antiviral Res, 76(2): pp.186-193 156 Zyprian E and ado C.I 199 , “Agrobacterium – mediated plant transformation by novel mini- T- vectors in conjunction with a highcopy vir region helper plasmid” Pant Mol Biol, 15, pp 245 – 256