Khảo sát tính đa dạng di truyền của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải trong ao nuôi cá tra và ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tai Lieu Chat Luong 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS TS HÀ THANH TỒN PGS TS NGƠ THỊ PHƢƠNG DUNG 2015 Cơng trình hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Trung tâm học liệu - Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Các báo công bố Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2013 Đa dạng di truyền vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long Báo cáo khoa học (Proceedings) hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2013; Quyển 1: Công nghệ Gen, Công nghệ Enzyme Hóa sinh, Cơng nghệ sinh học Y - Dược, Công nghệ sinh học Động vật: 137-141 Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2014 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long môi trường polysaccharide ứng dụng vào xử lý nước ao ni cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn - Kỳ 1- Tháng 4/2014 (số 7/2014): 69-76 Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2014 Tối ưu hóa ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học môi trường protein vào xử lý nước ao ni cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 30(2014): 13-21 Chƣơng TỔNG QUÁT VỀ LUẬN ÁN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Ni trồng, chế biến xuất thủy sản mạnh kinh tế đặc biệt đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL); đó, lồi thủy sản có tiềm lớn cá tra đạt sản lượng xuất nhiều lồi cá ni nước với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích kinh tế, việc ni cá tra cơng nghiệp có tác động tiêu cực lớn đến môi trường thức ăn dư thừa, chất thải trình trao đổi chất, hóa chất sử dụng… lắng xuống, tích tụ lại đáy ao nhanh chóng chuyển hóa thành ammonium, nitrate, phosphate hợp chất khác gây ô nhiễm môi trường Theo nghiên cứu Châu Minh Khơi ctv (2012) hàm lượng N P hịa tan ao ni cá tra cao gấp nhiều lần so với quy chuẩn QCVN 08:2008/BTNMT Nếu nuôi cá tra với mật độ cao (40-50 con/m2), sử dụng hồn tồn thức ăn cơng nghiệp lượng chất thải tích tụ ao ni lớn (Trương Quốc Phú Trần Kim Tính, 2012) Ngồi ra, theo Quyết định 3885/QĐ-BNN-TCTS (2014) quy hoạch đến năm 2020 diện tích ni cá Tra vùng 7.800 sản lượng khoảng 1,9 triệu Như thế, áp lực môi trường cao có nhiều khó khăn chất lượng nguồn nước cấp khả tiêu thoát Để xử lý nước, quy trình kết tụ sinh học đề nghị nhằm giúp loại bỏ tạp chất, tạo thuận lợi cho công đoạn xử lý sau với lợi điểm đầu tư sở hạ tầng ít, hiệu nhanh thân thiện với môi trường Chất kết tụ sinh học có hiệu cao, khơng độc hại, phân hủy sinh học, không gây ô nhiễm thứ cấp, phạm vi ứng dụng rộng vi khuẩn tạo chất kết tụ dễ phát triển tăng sinh khối Tuy nhiên, hoạt tính chất kết tụ sinh học xác định chất di truyền sinh vật (Salehizadeh ctv., 2000), chịu ảnh hưởng yếu tố thành phần chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy, điều kiện môi trường tạo chất kết tụ… Vì vậy, để có hiệu mong muốn, đề tài: “Khảo sát tính đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra ứng dụng vào xử lý nƣớc ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long” tiến hành nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao để ứng dụng vào xử lý nước ao ni cá tra, góp phần làm giảm thiểu nhiễm môi trường nước ĐBSCL 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao, đồng thời khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn tuyển chọn - Xác định điều kiện phù hợp pH, chất dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn để kết tụ đạt tỉ lệ cao nhằm chọn số chủng, tổ hợp vi khuẩn có khả ứng dụng vào xử lý nuớc ao nuôi cá tra ĐBSCL 1.3 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học từ mẫu (nước+bùn đáy) ao nuôi cá tra 10 tỉnh/thành phố vùng ĐBCSL 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Luận án phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả tạo kết tụ cao; xác định điều kiện phù hợp để kết tụ đạt hiệu nhất; đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn qua tính đa hình nucleotide thiết lập giản đồ phả hệ vi khuẩn tuyển chọn với chủng tương đồng di truyền Các kết đóng góp, bổ sung thơng tin cho tài liệu tham khảo, giảng dạy cho nghiên cứu chuyên ngành sâu Trong thực tiễn, đề tài mở hướng ứng dụng vi khuẩn tạo kết tụ giúp giải nhu cầu xử lý nước ao nuôi cá tra, góp phần làm giảm nhiễm mơi trường nước 1.5 Những đóng góp luận án - Tuyển chọn số vi khuẩn có khả tạo kết tụ cao từ ao nuôi cá tra ĐBSCL Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn xác định chủng tương đồng di truyền kỹ thuật sinh học phân tử Khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn qua tính đa hình nucleotide dựa dấu phân tử SNP Thiết lập sơ đồ phả hệ thể mối tương quan vi khuẩn tuyển chọn với chủng tương đồng di truyền - Xác định điều kiện phù hợp giúp chủng vi khuẩn tuyển chọn đạt tỉ lệ cao Giới thiệu số chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu cao ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra Chƣơng NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Luận án thực với nội dung sau: 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu Các thí nghiệm thực với thiết bị, dụng cụ hóa chất chuyên dụng phịng thí nghiệm Vi sinh vật Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA chủng vi khuẩn gửi sang công ty MACROGEN Hàn Quốc để xác định trình tự đoạn DNA Ảnh chủng vi khuẩn tuyển chọn chụp qua kính hiển vi điện tử qt Phịng thí nghiệm Chun sâu - Trường Đại học Cần Thơ Hàm lượng TSS COD mẫu nước ao phân tích Trung tâm Kỹ thuật Ứng dụng Công nghệ - Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Cần Thơ Phân tích tiêu Sinh-hóa Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Thu mẫu xác định mật số Thu mẫu (nước + bùn đáy) ao nuôi cá tra 10 tỉnh ĐBSCL An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long Ở tỉnh, thu từ 8-25 mẫu tùy theo số lượng ao nuôi cá Mẫu nước thu cách bờ ao từ m, cách mặt nước 0,5 m; mẫu bùn dùng gàu/lon múc mặt đáy Chứa riêng mẫu nước bùn đáy lọ nhựa 50 ml có nắp đậy, trữ lạnh 4oC phịng thí nghiệm Khi tiến hành phân tích trộn nước bùn đáy lại, khuấy đều, lấy dung dịch mẫu sử dụng Mẫu thu lần: lần vào mùa khơ lần vào mùa mưa để so sánh phát triển mật số vi khuẩn theo mùa 2.3.2 Phân lập vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học Sử dụng mẫu thu vào mùa khô để phân lập vi khuẩn Vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập loại môi trường môi trường kết tụ protein (theo Hazana ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) môi trường kết tụ polysaccharide (theo Deng ctv., 2003, Bùi Thế Vinh, 2012) Các khuẩn lạc vi khuẩn tạo chất kết tụ có bề mặt trơn, nhầy ướt Tái phân lập liên tục nhiều lần đến khuẩn lạc tách rời rõ đường cấy Sau kiểm tra độ rịng kính hiển vi, cấy chuyển sang ống, xem chủng riêng biệt trữ lại dùng cho thí nghiệm sau 2.3.3 Tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao Mỗi chủng vi khuẩn phân lập nuôi môi trường trên, không bổ sung agar Chứa 50 ml dịch mơi trường bình tam giác, lắc máy với vận tốc 120-150 vịng/phút nhiệt độ phịng thí nghiệm 27oC (theo Gong ctv., 2008; Xia ctv., 2008) khoảng ngày Chuẩn bị dung dịch kaolin (5g/L) CaCl2 (1%) theo tỉ lệ 9:1 Chuẩn pH = Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl2) 20µl dịch vi khuẩn nói (mật số ≥107 CFU/ml vi khuẩn kết tụ protein ≥108 CFU/ml vi khuẩn kết tụ polysaccharide) Mẫu đối chứng thực tương tự không chủng vi khuẩn Khuấy hỗn hợp giây máy khuấy giữ yên phút Lấy phần phía đo mật độ quang OD bước sóng 550 nm Mỗi nghiệm thức thực lần lặp lại Tính tỉ lệ kết tụ theo Deng ctv (2003) Tỉ lệ kết tụ % = OD đối ch ứng − OD (mẫu) OD (đối ch ứng ) x 100 Dựa vào tỉ lệ kết tụ, loại môi trường (kết tụ protein kết tụ polysaccharide) chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao / tỉnh Tổng cộng có 10 vi khuẩn kết tụ protein 10 vi khuẩn kết tụ polysaccharide chọn 2.3.4 Nhận diện, dịnh danh chủng vi khuẩn tuyển chọn *Quan sát khuẩn lạc qua: màu sắc, hình dạng, độ nổi, kích thước Hình dạng, chuyển động vi khuẩn quan sát qua kính hiển vi quang học * Định danh vi khuẩn qua phân tích trình tự gen 16S rDNA - Tách chiết DNA theo quy trình Breugelmans Uyttebrock (2004) - Khuếch đại chuỗi gen 16S rDNA kỹ thuật PCR Sử dụng cặp mồi (primer) theo Gao ctv (2006), Gupta ctv.(1983): Mồi xuôi 37F : 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3’ Mồi ngược 1497R: 5’-ACGGCAACCTTGTTACGAGTT-3’ Tiến trình thực PCR: Thành phần hợp chất dùng kỹ thuật PCR: Thành phần H2O (cất lần) PCR buffer dNTP MgCl2 Đoạn mồi xuôi Đoạn mồi ngược BSA Taq DNA polymerase DNA Tổng Nồng độ 10X 1mM 10X 50ng/µl 50ng/µl 5U/µl 5U/µl 25ng/ml Thể tích (µl) 24,0 5,0 8,0 4,0 2,0 2,0 0,5 0,5 4,0 50,0 - Điện di sản phẩm PCR gel, ước lượng kích thước đoạn DNA Đun nóng 0,5 g agarose 40 ml TAE 1X cho tan hoàn toàn Để nguội khoảng 50oC, cho 0,8 µl EtBr vào, lắc Đỗ vào khn để định hình tạo giếng, sau 90 phút sử dụng Trộn 10 µl mẫu DNA (đã qua PCR) với µl dung dịch tải giấy paraffin Cho dịch DNA thang chuẩn vào giếng mẫu DNA cần điện di vào giếng tiếp sau Tiến hành điện di hiệu 50-70 volt, khoảng 60 phút, dung dịch đệm TAE 1X Kết quan sát hệ thống máy chụp gel tia UV Kích thước band DNA vi khuẩn ước lượng dựa theo thang chuẩn - Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR chuyển sang công ty MACROGEN (Hàn Quốc) để xác định trình tự đoạn gen DNA chủng vi khuẩn tuyển chọn - Định danh vi khuẩn tuyển chọn, xác định chủng tương đồng di truyền Trình tự đoạn DNA vi khuẩn so với trình tự DNA vi khuẩn lưu trữ ngân hàng gen NCBI tìm tỉ lệ tương đồng phần mềm BLAST N Bước đầu định danh vi khuẩn tuyển chọn xác định chủng tương đồng di truyền (2 chủng tương đồng/1 vi khuẩn) 2.3.5 Khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn tuyển chọn 2.3.5.1 Tính đa hình nucleotide chuỗi trình tự Các phần mềm BioEdit (Hall, 1999), Clustal W (Thompson ctv., 1994), MEGA 5.1(Tamura ctv., 2011) sử dụng để so sánh 10 chuỗi trình tự vi khuẩn tuyển chọn (trên loại môi trường) Căn vào dấu SNP nhận điểm tương đồng biến đổi trình tự thêm vào mơi trường, nguồn dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy liều lượng vi khuẩn sử dụng xác định Chọn tổ hợp có tỉ lệ kết tụ cao đưa vào kiểm tra lần với chủng vi khuẩn chọn lọc - Lần 2: Lặp lại thí nghiệm tương tự thay dung dịch kaolin nước ao cá tra địa điểm khác (ao cá Ơ Mơn ao cá Trà Vinh) để khẳng định chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu cao Chọn vi khuẩn, tổ hợp vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao đưa vào ứng dụng 2.3.9 Ứng dụng xử lý nƣớc ao nuôi cá quy mơ phịng thí nghiệm Thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học vào xử lý nước ao nuôi cá tra thực bước đầu quy mơ phịng thí nghiệm với thể tích 100 L Ba ao ni cá tra chọn thu mẫu nước thực thí nghiệm Cần Thơ 1, Cần Thơ Cần Thơ thuộc cồn Khương, phường Cái Khế, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ - Ao Cần Thơ 1: ngưng cho cá ăn từ 10 ngày trước, chờ thu hoạch cá - Ao Cần Thơ 2: cá tra nuôi 4,5 tháng tuổi - Ao Cần Thơ 3: cá 6,5 tháng tuổi Mẫu nước thu bảo quản thùng 100L sử dụng ngày Các chủng, tổ hợp vi khuẩn sử dụng chọn kết kiểm tra; bước thực tương tự thí nghiệm trước theo điều kiện phù hợp xác định Khuấy nước ao thùng chứa tay với gỗ cứng tre (đường kính ≈ cm, dài ≈ 150 cm) với tần số 60 vòng/phút phút để lắng sau 30 phút Mỗi lần xử lý nước ao kiểm tra giá trị pH tỉ lệ kết tụ nước ao chủng vi khuẩn tổ hợp vi khuẩn Khả tạo kết tụ chủng, tổ hợp vi khuẩn kiểm tra cách đo lượng TSS COD nước ao trước sau xử lý nước với vi khuẩn để thấy tỉ lệ TSS COD giảm sau xử lý, từ đánh giá hiệu chúng * Các số liệu ghi nhận thí nghiệm phân tích phương sai (ANOVA) hệ số tương quan với phần mềm phân tích thống kê Minitab 16, phương pháp Fisher, để so sánh trung bình nghiệm thức, có tính đến độ lệch chuẩn Các biểu đồ, sơ đồ thể tương quan nghiệm thức xử lý phần mềm Excel 2007 10 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mật số vi khuẩn mùa khô mùa mƣa Các kết ghi nhận cho thấy mùa khô mùa mưa, trung bình mật số vi khuẩn kết tụ protein vi khuẩn kết tụ polysaccharide khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Như nhóm vi khuẩn phát triển tương đương điều kiện môi trường theo mùa năm (Hình 3.1) Ghi chú: TB: trung bình; VK: vi khuẩn; P: kết tụ protein; S: kết tụ polysaccharide Những số theo sau chữ khác biệt không ý nghĩa với độ tin cậy 95% Hình 3.1 Biểu đồ thể trung bình mật số vi khuẩn theo mùa 3.2 Kết phân lập chủng vi khuẩn tạo kết tụ sinh học 3.2.1 Số liệu tổng quát kết phân lập Từ 155 mẫu thu thập ao nuôi cá tra 10 tỉnh ĐBSCL phân lập 389 chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ Có 304/389 chủng có tỉ lệ kết tụ > 50% (117 chủng kết tụ protein 187 chủng kết tụ polysaccharide) Bảng 3.1 Số liệu kết phân lập vi khuẩn Ghi chú: TS: tổng số; P: vi khuẩn kết tụ protein; S: vi khuẩn kết tụ polysaccharide 11 3.2.2 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Phần lớn tế bào có dạng que ngắn, rời rạc; số que dài, hình cầu Các tế bào kết thành nhóm hay nhiều tế bào kết thành chuỗi dài Hầu hết chuyển động mơi trường nước Khuẩn lạc trắng trong, đục, kem ngà xám, vàng, cam… Đa số khuẩn lạc có dạng trịn, bìa ngun, mơ cao, đường kính 1,0-1,5 mm Các khuẩn lạc nhầy ướt ít, trung bình nhầy Nhìn chung, đặc điểm tương tự với nghiên cứu vi khuẩn tạo kết tụ tác giả trước (Gong ctv., 2008; Zaki ctv, 2011; Arafa ctv., 2014…) tất có chung đặc điểm bật khuẩn lạc nhầy ướt, láng 3.3 Kết tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao Trên loại mơi trường, có 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn để định danh khảo sát đa dạng di truyền (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn tuyển chọn TT 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Môi trường Protein Vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % AG08P 72,00±1,64 BT24P 67,50±0,50 CT04P 65,00±0,66 DT07P 74,25±0,43 HG06P 73,00±0,66 KG15P 55,75±1,56 ST05P 64,00±1,32 TG03P 67,50±0,43 TV05P 62,50±1,56 VL02P 65,50±0,90 TT 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Môi trường Polysaccharide Vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % AG19S 71,95±0,40 BT36S 69,66±0,60 CT27S 69,20±0,82 DT45S 56,78±1,80 HG09S 65,75±0,69 KG50S 57,70±0,83 ST37S 71,03±0,61 TG09S 70,57±0,80 TV35S 60,00±1,05 VL22S 67,82±0,83 3.4 Kết định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4.1 Kết điện di sản phẩm PCR từ DNA vi khuẩn Phổ điện di cho thấy vi khuẩn có band vị trí khoảng 1500 bp Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu vi khuẩn tạo kết tụ tác giả trước Methylobacterium sp Obi (Ntsaluba ctv., 2011), Bacillus sp Gilbert (Nontembiso ctv., 2011), Bacillus velezensis 40B (Zaki ctv., 2012), Bacillus thuringiensis (Arafa ctv., 2014) 3.4.2 Kết phân tích trình tự, xác định chủng tƣơng đồng di truyền, định danh chủng vi khuẩn (VK) tuyển chọn Kết Bảng 3.3, 3.4 cho thấy chi Bacillus chiếm tỉ lệ cao (16/20 12 chủng) phù hợp với nghiên cứu nhiều tác giả (Shih ctv., 2001; Deng ctv., 2003; Haleem ctv., 2008 ) Bên cạnh đó, tương tự với nghiên cứu trước, Staphylococcus, Arthrobacter sp Agrobacterium tumefaciens ghi nhận có khả tạo kết tụ (Qiang ctv., 2007; Su ctv., 2011; Li ctv., 2011) Bảng 3.3 Mười vi khuẩn kết tụ protein chủng tương đồng Bảng 3.4 Mười vi khuẩn kết tụ polysaccharide chủng tương đồng 13 Trên sở này, bước đầu định danh 20 chủng vi khuẩn sau: Vi khuẩn tạo kết tụ protein Bacillus megaterium AG08P Bacillus subtilis BT24P Bacillus amyloliquefaciens CT04P Bacillus megateirum DT07P Bacillus sp HG06P Bacillus subtilis KG15P Staphylococcus xylosus ST05P Bacillus amyloliquefaciens TG03P Staphylococcus xylosus TV05P 10 Bacillus methylotrophicus VL02P Vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide Bacillus megaterium AG19S Bacillus megaterium BT36S Bacillus sp CT27S Arthrobacter sp DT45S Bacillus megaterium HG09S Bacillus megaterium KG50S Agrobacterium tumefaciens ST37S Bacillus subtilis TG09S Bacillus megaterium TV35S 10 Bacillus megaterium VL22S 3.5 Đa dạng di truyền chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 3.5.1 Tính đa hình nucleotide 3.5.1.1 Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ protein * Với Pi Theta số giúp ước tính đa hình nucleotide, đường biểu diễn Pi Theta 10 chuỗi trình tự cho thấy vùng biến động nucleotide cao nằm khoảng vị trí base 124-693 (Hình 3.2) Hình 3.2 Đường biểu diễn Pi Theta (trên 10 chuỗi trình tự vi khuẩn tạo kết tụ protein) π = 0,09484 Đây giá trị số thể đa dạng nucleotide cao thơng thường π < 0,02 phần lớn acid nhân (Nei, 1987) θ = 66,102±23,366 Chỉ số cao, thể rõ đa hình nucleotide * Kết khảo sát 40 vị trí base có dấu SNP cho thấy vi khuẩn có nhiều dấu SNP Bacillus methylotrophicus VL02P (26/40); Staphylococcus xylosus ST05P TV05P có 14-15 dấu SNP; chủng 14 Bacillus megaterium AG08P, DT07P Bacillus sp HG06P có số dấu SNP 11 Cuối cùng, chủng Bacillus amyloliquefaciens TG03P, CT04P chủng Bacillus subtilis BT24P, KG15P có dấu SNP * Giản đồ phả hệ dựa 10 chuỗi trình tự vi khuẩn kết tụ protein, kết hợp với kết khảo sát vị trí base vùng biến động nêu cho thấy tương quan vi khuẩn với khoảng cách di truyền chúng Theo đó, chủng vi khuẩn có nhiều dấu SNP nhất, có khác biệt tách thành nhánh riêng; chủng có dấu SNP có khoảng cách di truyền ngắn chủng tương đồng xếp vào chung nhóm (Hình 3.3) Hình 3.3 Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan VK kết tụ protein 3.5.1.2 Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ polysaccharide * Hai đường biểu diễn Pi Theta chuỗi trình tự vi khuẩn kết tụ polysaccharide có dạng tương tự nhau; vùng biến động cao nằm khoảng vị trí base 233-903 (Hình 3.4) Hình 3.4 Đường biểu diễn Pi Theta (trên 10 chuỗi trình tự vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide) π = 0,08914 Đây giá trị số thể đa dạng nucleotide cao theo Nei (1987) thơng thường π < 0,02 phần lớn acid nhân θ = 81,655±28,864 Chỉ số cao, thể rõ đa hình nucleotide 15 * Kết khảo sát 40 vị trí base có dấu SNP cho thấy vi khuẩn có nhiều dấu SNP Arthrobacter sp DT45S (21/40), Agrobacterium tumefaciens ST37S với 16/40 dấu, đến Bacillus subtilis TG09S có 13/40 dấu SNP Các chủng cịn lại Bacillus sp CT27S, B megaterium BT36S, HG09S, KG50S, TV35S có 6-1 dấu SNP Riêng Bacillus megaterium VL22S B megaterium AG19S khơng có biến đổi chuỗi trình tự 40 vị trí khảo sát base giống * Giản đồ phả hệ dựa 10 chuỗi trình tự (Hình 3.5) vi khuẩn kết tụ polysaccharide cho thấy tương quan vi khuẩn với khoảng cách di truyền chúng Theo đó, chủng vi khuẩn có nhiều dấu SNP (nhóm 2, 3, 4) có khác biệt rõ rệt tách thành nhánh riêng; chủng có dấu SNP có khoảng cách di truyền ngắn chủng tương đồng xếp vào chung nhóm có vị trí gần (nhóm 1) Hình 3.5 Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan VK kết tụ polysaccharide 3.5.2 Giản đồ phả hệ thể tƣơng quan vi khuẩn tạo kết tụ đƣợc tuyển chọn chủng vi khuẩn tƣơng đồng di truyền Giản đồ phả hệ Hình 3.6 cho thấy vi khuẩn tạo kết tụ protein chủng tương đồng xếp thành nhóm Các số bootstrap cao (99-100) node nhánh thể mối liên hệ mật thiết chủng vi khuẩn nhóm mối tương quan gần gũi nhóm Giản đồ cho thấy chi Staphylococcus Bacillus có mối quan hệ gần nhau: chúng vi khuẩn gram dương thuộc Firmicutes Đặc biệt Bacillus methylotrophicus VL02P xếp thành nhóm riêng, khơng chung nhóm với chủng tương đồng (được xếp vào nhóm 4) có tỉ lệ tương đồng 98% Có thể 1loài mới, tương tự cách nhận định nghiên cứu Shcherbakova ctv (2011) chủng M2T tác giả 16 68 HQ231223-Bacillus-sp.-NyZ44-(China) HQ242772-Bacillus-aryabhattai-isolate-PSB59-(China) FJ620896-Bacillus-megaterium-strain-XTBG34-(China) JN084155-Bacillus-aryabhattai-strain-Y8-(China) 100 Bacillus-megaterium-DT07P FJ976552-Bacillus-megaterium-strain-LCR43-(India) JQ229803-Bacillus-megaterium-strain-1CK24-(China) Bacillus-megaterium-AG08P 99 Bacillus-sp-HG06P Staphylococcus-xylosus-TV05P Staphylococcus-xylosus-ST05P FJ210844-Staphylococcus-saprophyticus-strain-OTUC3-(China) 100 HM854231-Staphylococcus-xylosus strain-KTH6-1-(China) 100 GQ480491-Staphylococcus-saprophyticus-subsp.-saprophyticus-strain-xf1-4-China) HM854231-Staphylococcus-xylosus-strain-KTH6-1-(China) 42 Bacillus-subtilis-BT24P 39 Bacillus-subtilis-KG15P AF270793-Bacillus-subtilis-N5-(New Zealand) JQ039972-Bacillus-subtilis-strain-YNA61-(China) 100 HQ143570-Bacillus-pumilus-strain-YT1-(China) JF738142-Bacillus-sp.-PSM2-(China) Bacillus-amyloliquefaciens-CT04P HQ238495-Bacillus-methylotrophicus-strain-S521B-53-(China) JN086146-Bacillus-amyloliquefaciens-strain-Rx-34-(China) JF496465-Bacillus-vallismortis-strain-WA1-1-(China) JF496324-Bacillus-vallismortis-strain-A1-7-(China) Bacillus-amyloliquefaciens-TG03P HM055608-Bacillus-amyloliquefaciens-strain-JS-(China) JF899261-Bacillus-methylotrophicus-strain-Hk9-21-(China) Bacillus-methylotrophicus-VL02P 0.02 Hình 3.6 Giản đồ phả hệ mô tả tương quan VK kết tụ protein chủng tương đồng di truyền TroTng 100 100 EU912461-Bacillus-sp.-SuP1-(India) JF496312-Bacillus-megaterium-strain-XAS5-1-(China) Bacillus-megaterium-VL22S FJ976550-Bacillus-megaterium-strain-LCR41-(India) HQ231223-Bacillus-sp.-NyZ44-(China) HM027880-Bacillus-megaterium-strain-RKJ600-(India) 77 EU661789.1-Bacillus-sp.-C-18-(China) JF460759-Bacillus-aryabhattai-strain-Kt10-17-(China) GQ284474-Bacillus-megaterium-strain-PCWCW5-(India) JN642548-Bacillus-megaterium-strain-EN2-(India) 28 HQ908708-Bacillus-aryabhattai-strain-F77063-(India) EU834243-Bacillus-subtilis-strain-DS13-(Korea) Bacillus-megaterium-AG19S JN411325-Bacillus-megaterium-strain-IARI-BK-14-(India) 63 Bacillus-megaterium-TV35S Bacillus-megaterium-BT36S 66 9971 Bacillus-megaterium-HG09S Bacillus-sp.-CT27S 99 EU162025-Bacillus-sp.-PGBw5-(TAIWAN) Bacillus-megaterium-KG50S Bacillus-subtilis-TG09S JQ900635-Bacillus-subtilis-strain-ME-1-(CHINA) 99 JN700159-Bacillus-amyloliquefaciens-subsp.-plantarum-strain-P03-(CHINA) Agrobacterium-tumefaciens-ST37S JN048647-Rhizobium-sp.-SYF-5-(China) 100 GQ181060-Agrobacterium-tumefaciens-strain-BLN4-(Korea) HQ657321-Arthrobacter-sp.-D48-(China) Arthrobacter-sp.-DT45S 100 67 JF900051-Arthrobacter-sp.-C3-2-(China) Hình 3.7 Giản đồ phả hệ mô tả tương quan VK kết tụ polysaccharide chủng tương đồng di truyền 0.02 17 Đối với vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide chủng tương đồng (Hình 3.7), giản đồ phả hệ cho thấy có nhóm nhóm 3, xem nhánh riêng Nhóm với nhiều thành viên cho thấy phong phú chi Bacillus Chỉ số bootstrap 99-100 nhóm 2, 3, thể mối liên hệ chặt chẽ vi khuẩn tuyển chọn chủng tương đồng nhóm quan hệ gần gũi nhóm ** Tóm lại, khảo sát tính đa hình nucleotide chuỗi trình tự phân tích giản đồ phả hệ cho thấy đa dạng di truyền vi khuẩn tạo kết tụ sinh học phong phú đa dạng chi loài vi khuẩn tự nhiên Thơng qua tiến hóa, lồi phát sinh qua q trình biệt hóa biến đổi sinh vật giúp chúng có khả tìm thấy khai thác sinh thái thích hợp (Caliskan – 2012) 3.6 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ 70% Trên loại môi trường chọn chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ 70% sau: TT 01 02 03 Môi trường protein Môi trường polysaccharide Chủng vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % TT Chủng vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % DT07P (Hình 3.8a) 74,25 01 AG19S (Hình 3.8d) 71,95 HG06P (Hình 3.8b) 73,00 02 ST37S (Hình 3.8e) 71,03 AG08P (Hình 3.8c) 72,00 03 TG09S (Hình 3.8f) 70,57 a b c d e f Hình 3.8 Ảnh chủng vi khuẩn qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) 18 3.7 Các điều kiện để kết tụ đạt tỉ lệ cao 3.7.1 pH mơi trƣờng Hình 3.9 cho thấy vi khuẩn tuyển chọn có tỉ lệ kết tụ cao với pH = 6, chọn giá trị để thực thí nghiệm tiếp sau Kết tương tự nghiên cứu Dermlim ctv (1999), Qiang ctv (2007), Cao Ngọc Điệp ctv (2012)… chủng vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao pH6 Giá trị pH phù hợp với môi trường nước ao nuôi cá tra, thường có pH 6-7 (Dương Nhựt Long ctv., 2004) Tỉ lệ kết tụ % 75 73 71 69 67 65 63 61 59 57 AG08P DT07P HG06P AG19S ST37S pH = pH = pH = pH = pH = Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ kết tụ vi khuẩn theo giá trị pH 3.7.2 Ion kim loại mơi trƣờng Theo kết từ Hình 3.10, vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao khác biệt không ý nghĩa dung dịch kaolin có thêm CaCl2 NaCl vào Tỉ lệ kết tụ % 80 70 60 50 40 30 20 10 CaCl2 NaCl KCl MnSO4 MgSO4 AG08P DT07P HG06P AG19S ST37S TG09S Hình 3.10 Biểu đồ thể tỉ lệ kết tụ vi khuẩn theo ion kim loại Tuy nhiên, tỉ lệ kết tụ cao nhất, liều lượng vi khuẩn sử dụng môi trường có NaCl mơi trường có CaCl2 Vì vậy, NaCl chọn để sử dụng cho bước tiếp sau với ưu điểm như: NaCl thân thiện với môi trường CaCl2, đạt hiệu kinh tế (NaCl rẽ tiền 19 hơn, sử dụng sinh khối vi khuẩn hơn) cá tra phát triển bình thường độ mặn 0,1% NaCl Việc sử dụng ion Na+ để hỗ trợ cho hoạt động kết tụ tương tự nghiên cứu Li ctv (2007), Arafa ctv (2014) , vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao có diện Na+ 3.7.3 Nguồn dinh dƣỡng phù hợp cho vi khuẩn Kết với tỉ lệ kết tụ 48 tổ hợp có chứa nguồn carbon, nitrogen khống vơ khác cho thấy chủng vi khuẩn tạo kết tụ protein AG08P, DT07P, HG06P phát triển tốt môi trường có tinh bột, glutamate KCl Trong đó, chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ polysaccharide AG19S, ST37S TG09S cho tỉ lệ kết tụ cao nuôi môi trường chứa sucrose, glutamate CaCl2 Như thế, so với nghiên cứu tác giả khác (Kurane Nohata, 1994; Bùi Thế Vinh ctv., 2012; Arafa ctv., 2014; …), vi khuẩn chọn sử dụng nguồn dinh dưỡng dễ tìm rẽ tiền, khơng tốn nhiều, thuận tiện cho việc nghiên cứu, ứng dụng vào thực tế 3.7.4 Thời gian nuôi cấy liều lƣợng vi khuẩn sử dụng 3.7.4.1 Tỉ lệ kết tụ chủng vi khuẩn theo thời gian, liều lƣợng Các kết thí nghiệm ghi nhận liên tục qua thời điểm: ngày 2, 3, 4, sau chủng để xác định thời gian nuôi cấy liều lượng vi khuẩn sử dụng cho tỉ lệ kết tụ cao Theo đó, có chủng vi khuẩn đạt ti lệ kết tụ 80% AG08P, DT07P ST37S (Hình 3.11) Tỉ lệ kết tụ % 85 83,08 81,2 80,23 80 75 71,88 70,98 HG06P ngày 0,1% AG19S ngày 0,2% 70,14 70 65 60 AG08P ngày 0, 1% DT07P ngày 0,09% ST37S ngày 0,08% TG09S Chủng VK ngày Ngày nuôi cấy 0,1% Liều lượng VK Hình 3.11 Tỉ lệ kết tụ cao chủng vi khuẩn tuyển chọn 20 Kết Hình 3.11 cho thấy thời gian nuôi cấy vi khuẩn tương tự nghiên cứu tác giả khác (Xia ctv., 2008; Zaki ctv., 2011; Ntsaluba ctv., 2011 ) liều lượng sử dụng cho vi khuẩn tương đối ít, từ 0,08-0,2% 3.7.4.2 Tỉ lệ kết tụ tổ hợp vi khuẩn theo thời gian Kết cho thấy qua ngày khảo sát, có tổ hợp ln có tỉ lệ kết tụ cao tổ hợp DT07P + ST37S, DT07P + AG08P Hai tổ hợp phối từ chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao DT07P, AG08P ST37S DT07P chủng vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao có tổ hợp Có lẽ mà hiệu chúng cao tổ hợp lại 3.7.5 Tƣơng quan mật số tỉ lệ kết tụ theo thời gian nuôi cấy Tương quan mật số vi khuẩn tỉ lệ kết tụ theo thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát ghi nhận sau : - Ở vi khuẩn tạo chất kết tụ, sản xuất tế bào nhanh, sau ngày mật số đạt đến 107 CFU/ml (ở vi khuẩn tạo kết tụ protein) hay 108 CFU/ml (ở vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide) - Thời gian nuôi cấy để đạt tỉ lệ kết tụ cao khác theo chủng vi khuẩn Tuy nhiên chất kết tụ thường đạt hiệu tối đa sớm, cuối pha tăng trưởng đầu pha cân phát triển tế bào cho thấy chất kết tụ sinh học tạo cách tổng hợp trình phát triển vi khuẩn tự phân giải tế bào (Zaki ctv., 2011; Xia ctv., 2008; Gong ctv., 2008; Lu ctv., 2005) - Ở 5/6 vi khuẩn (trừ ST37S), thời điểm đạt tỉ lệ kết tụ tối đa mật số vi khuẩn cao không tương ứng Điều hướng đến lưu ý hiệu kết tụ khơng hồn tồn tương ứng với việc tạo thêm tế bào hay việc sản sinh vi khuẩn không song song với việc tạo chất kết tụ 3.8 Kiểm tra chủng, tổ hợp vi khuẩn tạo kết tụ với tỉ lệ cao Với điều kiện phù hợp pH, ion kim loại hỗ trợ, nguồn dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy liều lượng vi khuẩn sử dụng để có tỉ lệ kết tụ cao xác định trên, thực thí nghiệm kiểm tra tỉ lệ kết tụ chủng vi khuẩn để chọn chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu cao đưa vào ứng dụng 3.8.1 Kiểm tra tỉ lệ kết tụ dung dịch kaolin 21 Thí nghiệm kiểm tra lại hiệu kết tụ chủng, tổ hợp vi khuẩn dung dịch kaolin cho kết tương tự mục 3.7.4 Có chủng vi khuẩn tổ hợp vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ đạt 80% chủng AG08P (80,13%), DT07P (83,01%), ST37S (81,45%), tổ hợp DT07P+ST37S (83,51%) DT07P+AG08P (83,26%) Trên sở đó, chọn tổ hợp đưa vào kiểm tra lần nước ao nuôi cá tra với chủng vi khuẩn 3.8.2 Kiểm tra tỉ lệ kết tụ nƣớc ao nuôi cá tra Khi thay dung dịch kaolin nước ao ni cá tra Ơ Mơn Trà Vinh, tỉ lệ kết tụ chủng, tổ hợp vi khuẩn tuyển chọn giảm xuống rõ rệt Tuy nhiên kết phù hợp với kết chủng AG08P, DT07P, ST37S tổ hợp DT07P+AG08P DT07P+ST37S có tỉ lệ kết tụ cao, 50% (50,77%-53,26%) khác biệt có ý nghĩa thống kê với chủng vi khuẩn lại AG19S, HG06P, TG09S với tỉ lệ kết tụ từ 40,55% - 44,49% * Từ kết trên, chọn chủng vi khuẩn Bacillus megaterium AG08P, B.megaterium DT07P, Agrobacterium tumefaciens ST37S tổ hợp DT07P + ST37S DT07P + AG08P đưa vào giai đoạn ứng dụng Các kết tuyển chọn phù hợp với nghiên cứu Li ctv (2011) ghi nhận Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn tạo kết tụ sinh học hiệu Bunk ctv (2010) cho thấy Bacillus megaterium vi khuẩn tạo kết tụ với tỉ lệ cao có khả ứng dụng xử lý nước Tiếp theo, thực kiểm tra xác suất 2/3 chủng vi khuẩn đưa vào ứng dụng qua số tiêu sinh-hóa để khẳng định kết định danh Bảng 3.5 Đặc điểm sinh hóa Bacillus megaterium AG08P, DT07P Đặc điểm chi Bacillus theo khóa phân loại Bacillus megaterium B megaterium Bergey (Holt ctv., 2000) AG08P DT07P Dạng que nuôi cấy + + + Tạo nội bào tử + + + Chuyển động + + + Gram dương cịn non + + + Hiếu khí Tùy lồi + + Phản ứng catalase + + + Phản ứng oxidase Tùy loài - 22 3.9 Kết xử lý nƣớc ao nuôi cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Khi kiểm tra lượng TSS COD nước ao ni cá thấy lượng TSS COD cao tương ứng với thời điểm từ cá nhỏ đến cá lớn giai đoạn ngưng cho cá ăn lượng TSS COD thấp rõ rệt (Bảng 3.6) Ghi nhận cho thấy theo thời gian nuôi cá, lượng thức ăn sử dụng cho cá, chất thải q trình trao đổi chất cá số chất khác vitamin bổ sung, kháng sinh, chất hóa học xử lý nước… có tác động rõ rệt đến mơi trường nước ao Bên cạnh đó, tỉ lệ làm giảm TSS COD chủng, tổ hợp vi khuẩn tăng từ ao Cần Thơ đến Cần Thơ 2; tức từ ao có lượng TSS COD thấp đến cao hơn; sau tỉ lệ giảm ao Cần Thơ ao có hàm lượng TSS COD cao Điều cho thấy nước ao bị ô nhiễm nhiều, lượng TSS COD cao hiệu kết tụ chủng vi khuẩn bị ảnh hưởng việc xử lý nước trở nên phức tạp Bảng 3.6 Lượng TSS COD ao trước sau xử lý với vi khuẩn (VK) TSS (*) COD (*) TSS mg/L Tỉ lệ giảm % COD mg/L Tỉ lệ giảm % QCVN 02-20:2014/BNNPTNT 100 150 Đối chứng (nước ao không xử lý) 60,50 44 Cần DT07P 26,50 56,20 21 52,27 Thơ AG08P 24,50 59,50 30 31,81 ST37S 21,00 65,29 26 40,91 (ngưng DT07P + AG08P 19,00 68,60 21 52,27 cho ăn) DT07P + ST37S 22,00 63,63 31 29,55 Đối chứng (nước ao không xử lý) 124,50 49 Cần Thơ DT07P 57,00 54,22 21 57,14 AG08P 64,50 48,19 18 63,27 (cá 4,5 ST37S 63,50 49,00 16 67,35 tháng) DT07P + AG08P 61,50 50,60 31 36,73 DT07P + ST37S 29,00 76,71 17 65,31 Đối chứng (nước ao không xử lý) 152,50 52 Cần Thơ DT07P 67,00 56,07 29 44,23 AG08P 72,00 52,79 31 40,38 (cá 6,5 ST37S 64,50 57,70 29 44,23 tháng) DT07P + AG08P 77,50 49,18 34 34,62 DT07P + ST37S 75,00 50,82 31 40,38 Ao cá Chủng vi khuẩn, Tổ hợp VK *Kết phân tích Trung tâm Kỹ thuật Ứng dụng Công nghệ, Sở KH&CN-TPCT 23 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận - Từ 155 mẫu thu thập ao nuôi cá tra 10 tỉnh ĐBSCL, phân lập 389 chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học; đó, tuyển chọn 20 chủng vi khuẩn tạo kết tụ hiệu để định danh khảo sát đa dạng di truyền Kết khảo sát đoạn gen 16S rDNA vi khuẩn tuyển chọn cho thấy có 16/20 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, 2/20 chủng thuộc chi Staphylococcus, 1/20 Agrobacterium 1/20 thuộc Arthobacter - Trong 20 chủng vi khuẩn nói trên, chủng vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao Bacillus megaterium DT07P (83,01%), Agrobacterium tumefaciens ST37S (81,45%) Bacillus megaterium AG08P (80,13%) Môi trường nuôi cấy hữu hiệu cho chủng vi khuẩn tuyển chọn gồm chất có giá thành thấp, khơng khó tìm tinh bột, sucrose, glutamate, KCL, CaCl2 Các vi khuẩn hoạt động hiệu với diện NaCl, điều kiện pH môi trường 6, tương tự với môi trường nước ao Liều lượng vi khuẩn dùng xử lý thấp, từ 0,08% 0,10% (với mật số ≥ 107CFU/ml vi khuẩn kết tụ protein mật số ≥ 108 CFU/ml vi khuẩn kết tụ polysaccharide) nên thuận tiện, đạt hiệu kinh tế phát triển vi khuẩn - Ứng dụng vào xử lý nước ao ni cá tra quy mơ phịng thí nghiệm với thể tích thử nghiệm 100 L, chủng vi khuẩn DT07P, AG08P, ST37S tổ hợp vi khuẩn DT07P + AG08P DT07P + ST37S cho thấy có khả làm giảm lượng TSS nước ao từ 48,19% - 76,71% giảm lượng COD từ 29,55% - 67,35% 4.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần chất kết tụ chủng vi khuẩn tuyển chọn giúp nắm vững chế kết tụ, từ nâng cao tỉ lệ kết tụ Tiến hành thí nghiệm xử lý nước ao nuôi cá tra phạm vi rộng để xây dựng quy trình xử lý nước ao, tiến đến ứng dụng vào thực tế 24