Ứng dụng kỹ thuật antisense trong quá trình làm chậm chín của quả

Báo cáo tiểu luận nhóm Trường Đại học Đà Lạt - Khoa Sinh Học Lớp CSK32 BÀI TIỂU LUẬN “ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ANTISENSE TRONG QUÁ TRÌNH LÀM CHẬM CHÍN CỦA QUẢ ” Giảng viên : ThS Sinh viên thực hiện: Nhóm Mã Phước Huyền Thanh An 0810928 Trần Thị Bảo Dư 0810950 Lê Thị Nhật Lệ 0811001 Đàm Quang Thanh Lịch - Lê Hữu Lực - Lê Thị Thùy Ngân - Trịnh Thị Thúy - Đặng Thế Triều - Nguyễn Minh Trí - 0811002 0811013 0811027 0811086 Trang Báo cáo tiểu luận nhóm Trường Đại học Đà Lạt MỤC LỤC A.Tổng quan Sơ lược liệu pháp Antisense B.Ứng dụng cà chua I Quá trình chín cà chua II Cơ chế chậm chín cà chua Cơ chế Ưu nhược điểm III.Một số ứng dụng khác Trong nông nghiệp Trong y học C Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Trang Báo cáo tiểu luận nhóm A TỔNG QUAN - Ở nước ta, mặt hàng nông sản xuất chủ lực, trái cây, rau hoa mặt hàng có ưu lớn sân chơi WTO với kim ngạch xuất gần 103 tỷ USD, lúa gạo, cà phê, cao su chiếm không 10 tỷ USD/năm loại Các loại nông sản khác chè, điều hồ tiêu nhỏ với tỷ USD/năm - Nhưng sau thu hoạch việc bảo quản nơng sản lại gặp nhiều khó khăn, q trình vận chuyển, chín trái lại gây thiệt hại không nhỏ cho nông dân người tiêu dùng Đối với chuyến hàng vận chuyển dài ngày, rau làm lạnh để giảm thiệt hại làm chậm q trình chín Thơng thường người ta thu hoạch xanh, sau vận chuyển đến nơi cần thiết, rau làm chín phương pháp phun khí ethylene, thu hoạch trước bảo quản lạnh lâu dài nên chất lượng mùi vị sản phẩm có khuynh hướng suy giảm Đơi việc sử dụng hóa chất để bảo quản cịn gây độc cho thể, ví dụ như: sorbitol, ethrel, acetylene, acid phosphoric - Do đó, để hạn chế thiệt hại q trình chín, nhà khoa học nghiên cứu để tìm phương pháp làm chậm trình chín giúp nơng dân chủ động tiêu thụ nông sản đảm bảo cho người tiêu dùng sử dụng sản phẩm chất lượng cách dùng liệu pháp antisense ức chế tổng hợp protein khống chế lượng ethylene tạo ra, giúp điều khiển q trình chậm chín Mục tiêu đề tài - Tìm hiểu liệu pháp Antisense - Làm rõ q trình chín tác hại - Sử dụng liệu pháp Antisense làm cà chua chậm chín Sơ lược liệu pháp Antisense 2.1 Định nghĩa liệu pháp antisense - Antisense phương pháp công nghệ sinh học để ngăn cản hoạt động gen Bình thường thông tin gen (DNA) nằm nhân tế bào phân tử mARN, chép Trang Báo cáo tiểu luận nhóm DNA, mang từ nhân đến ribosome, nhà máy chế tạo protein tế bào chất Tại ribosome dựa vào thông tin tổng hợp protein tương ứng Ðể ngăn cản trình này, nhà khoa học sử dụng chiến lược làm “lạc hướng” thông tin mRNA cách đưa vào tế bào loại gen bổ sung ngược chiều (antisense), aRNA, lắp vào mRNA chìa khóa đặt vào ổ khóa Qua mARN khơng thể đưa tin cho ribosome để tổng hợp protein tương ứng 2.2 Chiến lược liệu pháp antisense Có hai chiến lược trình liệu pháp antisense : - Chiến lược antisense oligonucleotide mã trình tự kháng nguyên miền mRNA đưa vào tế bào Cặp base thành mRNA mục tiêu, mRNA bảo vệ không dịch mã ( translation) - Chiến lược thứ hai là gen kháng nguyên (antisense) Gene nhân đưa vào tế bào 2.3 Cơ chế liệu pháp antisense - Học thuyết trung sinh học phân tử : Thông tin di truyền DNA quy định cho loại protein chép sang RNA sau dùng để tổng hợp protein Dịng thơng tin di truyền từ DNA qua mRNA đến protein Francis Crick, nhà khoa học người Anh đoạt giải Nobel, gọi “Học thuyết trung tâm” lĩnh vực sinh học phân tử Protein liên quan đến tất q trình sống, ví dụ men phân giải thức ăn, thụ thể tiếp nhận tín hiệu não, kháng thể giúp chống lại vi khuẩn Trang Báo cáo tiểu luận nhóm - Nhưng kỹ thuật Antisense người ta cách sử dụng đoạn nucleoticle nhỏ đối nghĩa với đoạn ADN tổng hợp lên protein làm bất hoạt gen để giảm việc sản xuất loại protein - Nhằm gia tăng tính sinh tồn (time-life), gia tăng tinh ổn định nhiệt (thermal stability), gia tăng dung điểm (melting temperature) họat tính RNA nhân tạo, chuyên gia Antisense dùng phương pháp sau đây: Biến đổi đầu 3' 5' (3'- and 5'-ends modification) làm tăng tính sinh tồn RNA nhân tạo: Thơng thường enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3' đến đầu 5', có enzyme cắt từ đầu 5' đến đầu 3' Để bảo vệ hai đầu RNA nhân tạo, tránh khỏi phản ứng Enzyme, người ta thường thay hai gốc nối phos-phát P=O hai đầu thành phosphorothioate, P=S, hay phosphoramidate, P-N, hay amine-linker ngắn, hay hóa chất thơng thường Cholesterol, Cyclodextrin Các hóa chất làm giảm hiệu khả phân giải Enzyme, làm tăng tính sinh tồn RNA nhân tạo trình sinh học Dùng hóa chất có tính hydrophobic, hydrophilic cao, polyamine, đầu 3' hay đầu 5' để làm gia tăng tính thẩm thấu qua màng tế bào, màng nhân tế bào: nhiều thí nghiệm cho thấy hóa chất co hydrophobic cao cholesterol, pyrene, hydrophilic cao nhu cyclodextrin, đa amine (polyamine) giúp việc chuyển DNA/RNA qua màng tế bào hữu hiệu Dùng RNA nhân tạo với biến đổi gốc 2'-Oxy để làm gia tăng ổn định nhiệt độ (Thermal Stability, melting temperature) RNA nhân tao: 2'-Omethyl, 2'amino, 2'-O-Alkyl, 2'-Fluoro, LNA (Lock Nucleic Acid) Để tìm loại oligonucleotides DNA/RNA nhân tạo có nhiều gốc biến đổi hóa học, mà hịa tan dễ dàng Trang Báo cáo tiểu luận nhóm dung dịch nước, bền vững phản ứng phân giải Enzymes, có tính kết hợp base-pairing chặt chẽ với Oligonucleotides DNA/RNA thiên nhiên, với gốc hóa học này, oligonucleotides cho thấy đặc tính ứng dụng vào y, dược sinh học, Mới đây, LNA (Lock Nucleic Acid), với cấu trúc hóa học biến đổi, mang đủ điều kiện RNA nucleoside LNA Oligonucleotides có đặc điểm xương sống phos-phat LNA không bị dễ dàng phân giải hoàn toàn, hay biến đổi từ 3'-Oxy, sang 2'-Oxy môi trường dung dịch với pH>7.0, pH60-90% có màu vàng đỏ  Thời kỳ chín đỏ: Diện tích bề mặt từ 90% trở lên - Sở dĩ có tượng chín trái tác động Ethylene, loại hormone tự nhiên liên quan đến trình sinh trưởng, phát triển, chín lão hóa thực vật Người ta cho phytohormone thúc đẩy q trình chín nhiều loại như: chuối, dứa, cà chua, xoài, dưa hấu đu đủ Nó tạo nhiều nồng độ khác nhau, phụ thuộc vào nhiều loại Nhưng nồng độ ethylene đạt từ 0.1 đến ppm bắt đầu xảy q trình chín vùng nhiệt đới Quả vùng nhiệt đới thường thu hoạch lần chúng đạt đọ trưởng thành định, sau chúng chín nhanh vận chuyển bảo quản Các loại nhiệt đới quan trọng như: chuối, xoài, dứa, đu đủ, ổi … ví dụ Các loại khơng thuộc vùng nhiệt đới khơng chín sau thu hoạch Do đó, để đạt độ chín hương vị quả, dâu tây cam thường thu hoạch lần sau chín Trang Báo cáo tiểu luận nhóm - Ở cà chua, khoảng 45 đến 55 ngày để trưởng thành hồn tồn, sau bắt đầu q trình chín Sản phẩm ethylene tín hiệu cho hoạt động nhiều loại enzyme khác dẫn đến thay đổi sinh lý như: thay đổi màu sắc từ xanh sang đỏ, mềm có mùi vị khác - Năm 1979, Adams Yang phát ethylense chế tạo trực tiếp từ acide 1- aminocyclopropane (ACC) Bước cuối tiến trình tạo sinh tổng hợp ethylene nơi trái thực nhờ xúc tác enzyme ACC oxydase (ACCO) Lúc sinh enzyme chứa vị điểm (site) hoạt động gồm ion đơn nguyên tử Fe (II), nối hai histidine với aspartate Người ta chưa rõ chế phản ứng này, họ ngờ giai đoạn đầu ACC oxygene gắn vào Fe để thành phức chất bậc ba Fe/ACC/O2 Sau có tham gia chất oxyde hóa mạnh Fe(III)OOH, Fe (V) =O,… - Trong thực tế tùy thuộc vào mục đích sử dụng cà chua khác nhau, mà yêu cầu cho loại cà khác nhau, thí dụ để chế biến phải có mầu sắc đẹp, có cấu trúc, hàm lượng chất khô, chất tan đường phải tuân theo tiêu chuẩn chế biến cà chua cô đặc, tương cà chua người tiêu dùng chuyên gia chế biến mong muốn yêu cầu cà chua phải chín đỏ - Tuy nhiên, vận chuyển đường dài khơng thể sử dụng chín đỏ Vì người sản xuất cần hiểu biết hợp đồng với nhà kinh doanh, người thu gom sản phẩm xác định thời điểm thu hái thích hợp Nhưng muốn bảo quản lâu cần có nhiều yếu tố độ ẩm, nhiệt độ, hóa chất bảo quản… ngồi người ta kéo dài thời gian chín quả, khiến cứng để bảo quản lâu hơn, giúp giảm thiệt hại vận chuyển cách biến đổi gene gây ức chế trình tổng hợp ethylene nội sinh Cơ chế làm cà chua chậm chín 2.1 Cơ chế - Thông thường nông dân thu hoạch xanh, sau vận chuyển đến nơi cần thiết, rau làm chín phương pháp phun khí ethylene Đối với chuyến vận chuyển dài ngày, rau làm lạnh để giảm thiệt hại làm chậm q trình chín Trang Báo cáo tiểu luận nhóm - Tuy nhiên, thực tế, có vài trở ngại sau thu hoạch Quả thu hoạch trước chín giảm mùi vị chất lượng Do nhà khoa học nghiên cứu sử dụng vài phương pháp điều khiển q trình chín cơng nghệ biến đổi gen như: a Điều khiển tổng hợp ethylene: - Ức chế biểu gen ACC synthase ACC (1-aminocyclopropane-1-carbonxylic acid) synthase enzyme chịu trách nhiệm chuyển hóa S-adenosylmethiomine (SAM) thành ACC; từ bước thứ hai tới bước cuối trình sinh tổng hợp ethylene Sự biểu enzyme bị cản trở antisense đoạn gen synthase chuyển vào genome thực vật - Ức chế biểu gen ACC oxidase xúc tác cho q trình oxi hóa ACC thành ethylene, bước cuối đường sinh tổng hợp ethylene Thông qua công nghệ antisense, giảm điều khiển gen ACC oxidase dẫn đến ức chế hình thành ethylene, làm chậm chín b.Ức chế hoạt tính polygalacturonase - Enzyme polygalacturonase (PG) chịu trách nhiệm cho việc phân giải pectin, chất trì độ cứng cho thành tế bào thực vật Việc phân giải pectin xảy lúc bắt đầu q trình chín, làm cho mềm - Để tạo delayed repening (DR) phương pháp nhà khoa học chuyển gen antisense đoạn gen PG vào genome thực vật dẫn đến ức chế tạo enzyme 2.2 Ưu - nhược điểm phương pháp a Ưu điểm - Thời hạn sử dụng sản phẩm tăng lên mang lại lợi ích cho người sản xuất người tiêu dùng - Bảo đảm chất lượng rau thị trường Giờ đây, nông dân chờ rau trưởng thành đầy đủ thu hoạch, người tiêu dùng mua hàng hóa tốt với giá tiền phù hợp - Nông dân yên tâm vận chuyển sản phẩm khoảng thời gian dài mà khơng cần phải bảo quản lạnh Trang Báo cáo tiểu luận nhóm - Giảm thiệt hại sau thu hoạch DR có độ cứng cao thơng thường nên khơng bị bầm dập q trình vận chuyển thời gian lưu thông thị trường lâu - Kéo dài thời gian sử dụng rau tươi ngon - Cà chua tạo từ công nghệ có thành phần dinh dương giống cà chua thơng thường khơng có sai khác mức độ dị ứng độc tố so với bình thường, khơng gây đe dọa thực vật sinh vật có ích khác - Tiết kiệm chi phí bảo quản, giảm thiểu khả gây độc cho thể hóa chất b Nhược điểm - Tạo sức ép thương mại lo ngại tính an toàn thực phẩm - Năm 1996, nhà quản lí an tồn thực phẩm Anh đưa lời tuyên bố đồng ý cho triển khai cà chua DR công ty Zeneca Seeds, sản phẩm khơng bán thị trường - Tính phổ biển phương pháp chưa cao Ứng dụng khác 3.1 Trong nông nghiệp a Thay đổi màu sắc hoa - Công nghệ chọn tạo giống hoa quan tâm hàng đầu quốc gia có cơng nghiệp hoa phát triển Ngày có nhiều giống hoa lạ, đẹp, đa dạng phù hợp với nhu cầu thị hiếu người Hầu hết phủ nhiều quốc gia coi việc đầu tư vào lĩnh vực cấp thiết mang lại lợi ích kinh tế lớn Hiện người ta sử dụng liệu pháp antisense để làm thay đổi màu sắc số loài hoa như: thuốc cảnh, long đởm, hoa yến thảo b Tăng khả chống hạn - Trong sản xuất nơng nghiệp, q trình hạn hán xảy thơì gian canh tác có khả gây sút giảm nghiêm mặt sản lượng Một ví dụ điển hình bắp, stress nước ngày trình hoa làm giảm 50% sản lượng (Claisen and Shaw 1970) Trang 10 Báo cáo tiểu luận nhóm - Nghiên cứu cho thấy thay đột biến chức cách sử dụng antisense với promoter rd29A (rough inducible) cảm ứng trình hạn Theo cách này, điều kiện bình thường, GM có suất khơng khác so với nguyên thủy 3.2 Trong y học a Điều trị HIV - Trong liệu pháp antisense, gen đưa vào tế bào đích (tế bào khởi biểu phân tử RNA), bổ sung đến RNA virus muốn công Trong tế bào, RNA liệu pháp gắn đặc hiệu tới phân tử virus đích, kìm hãm chức phá vỡ phân tử Chiến lược cho thấy có hiệu chắn dạng RNA virus tế bào nuôi cấy Các thử nghiệm pha I người bệnh nhiễm HIV tiến hành với liệu pháp antisense nhằm vào phân tử virus đích quan trọng: gọi chuỗi TAR, mRNA cho gen Rev, Pol gen RNA gen virus Chuỗi TAR điểm gắn Tat, protein virus điều hoà quan trọng cho tốc độ tái virus tế bào Protein Rev gắn với nhân tố RRE, nhân tố đại diện chung cho mRNA virus có chức định thông tin virus tế bào - Có số vấn đề với chiến lược antisense Đầu tiên, hiệu kháng virus đòi hỏi kết tụ nội bào cao RNA mạch đối biểu Vấn đề giải thơng qua tiến triển công nghệ mối quan hệ với hiệu biểu gen Một vấn đề quan trọng khác là, phổ biến phương pháp thuốc kháng HIV truyền thống rủi ro lớn phát triển kháng thuốc vật chất di truyền virus làm giảm trung hoà hiệu RNA mạch đối (antisense RNA) sử dụng Rất có thể, chiến lược antisense sử dụng kết hợp với liệu pháp khác để ngăn cản phát triển đối kháng b Chuyển gen antisense TGF-β ex vivo vào tế bào khối u não - Chúng ta rõ u nguyên bào xốp có sản sinh chất kiềm chế miễn dịch, số yếu tố tăng trưởng biến nạp β (transforming growth factor-β) (TGF-b) - Các thí nghiệm khối u chuột chứng minh việc sản sinh hiệu ứng kháng u qua trung gian miễn dịch cảm ứng sau tiêm da tế Trang 11 Báo cáo tiểu luận nhóm bào khói u biểu gen antisense TGF-β nhằm loại trừ tiết TGF-1 từ khối u (Fakhrai cộng sự., 1996) - Trong quy trình lâm sàng liều leo thang phê chuẩn, nhà khoa học cắt bỏ khối u bệnh nhân u nguyên bào xốp (đã xác định tổ chức học) tiến hành thử nghiệm tiết TGF-β dòng tế bào Nếu tế bào sản xuất TGF-β chúng biến đổi gen với plasmid có chứa gen antisense TGF-β nhờ electroporation Khi TGF-β điều hòa xuống đủ mức tế bào chiếu xạ để đề phòng tái tăng trưởng bệnh nhân lại tiêm vào da tuần, tuần liều Tuy nhiên, chưa có số liệu công bố C KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Thực trạng công nghệ chín chậm (Delayed repening ) Cơng nghệ DR áp dụng cho cà chua, dưa hấu, đu đủ Bên cạnh cơng nghệ áp dụng thử nghiệm nghề trồng hoa để làm chậm trình héo, thay đổi màu sắc hoa thay đổi hình thái hoa Ngồi cơng nghệ cịn làm tăng đáng kể hàm lượng dinh dưỡng đến tay người tiêu dùng cải thiện sống nông dân nghèo vùng Mặc dù phương pháp chưa ứng dụng rộng rãi cịn xa lạ nơng dân mỡ hướng cho chọn giống nông nghiệp cải thiện thu nhập cho nước nông nghiệp đặc biệt nước ta Kiến nghị Cho tới nay, vấn đề giới nguyên cứu ứng dụng 30 năm Việt Nam ứng dụng kĩ thuật Antisense mới, cần phải đầu tư nghiên cứu, sớm đưa vào thực tiễn sản xuất Trang 12 Báo cáo tiểu luận nhóm Tài thiệu tham khảo - Ths Đào Trọng Phương 2010, Giáo trình Sinh học phân tử, Đại Học Đà Lạt -Tailieu.com.vn -Thuviendientuviolet.vn -Wikepedia.com -Youtube.com Trang 13