Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM a lu NGUYỄN TUẤN ANH n n va Tên đề tài: VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR p ie gh tn to BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC d a nv a lu u nf Hệ đào tạo ll : Chính Quy m : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học tz n oi Chuyên ngành : 2011 – 2015 z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, năm 2015 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM a lu NGUYỄN TUẤN ANH n n va Tên đề tài: VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR p ie gh tn to BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU d oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC a lu a nv Hệ đào tạo : Chính Quy u nf Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học ll : K43 CNSH m Lớp Khóa học : CNSH - CNTP tz n oi Khoa : 2011 – 2015 z Giảng viên hƣớng dẫn: 1.BS Nguyễn Thị Huyền @ m co l gm TS Nguyễn Văn Duy an Lu Thái Nguyên, năm 2015 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thầy cô trực tiếp giảng dạy tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt năm học vừa qua a lu Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: n TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực n va phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi tn to hướng dẫn tận tình tơi q trình thực đề tài p ie gh BS Nguyễn Thị Huyền, CN Trần Trung Anh, KTV Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa oa nl w Khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ, giúp đỡ cung cấp chủng sinh vật để thực đề tài d a nv a lu Tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ người bạn bên cạnh động viên giúp đỡ học tập làm việc hồn thành khóa luận u nf Tơi xin chân thành cảm ơn! ll m n oi Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2015 tz Sinh viên z gm @ Nguyễn Tuấn Anh m co l an Lu n va ac th si ii DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : isoamylalcohol (v/v) CFU Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP, a lu dGTP, dCTP, dTTP) n n va OD Optical Density - Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng tn to hợp - trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro p ie gh Ribonucleic Acid VSV Vi sinh vật ELSA Môi trường Baird Parker Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn d oa nl w BP RNA a nv a lu dịch liên kết với enzyme Vi khuẩn KS Kháng sinh MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus WHO Tổ chức Y tế Thế giới VRSA Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus S aureus Staphylococcus aureus ANSORP mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á PBP Biến đổi protein liên kết với Penicillin ll u nf VK m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 21 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 4.1: Kiểu hình 17 chủng S aureus phân lập Bệnh viên Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 33 Bảng 4.2 Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S aureus kháng thuốc bệnh nhân điều a lu trị bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên 36 n Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 17 chủng S aureus phân lập 39 n va Bảng 4.4: So sánh có mặt gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin tn to chủng Staphylococcus aureus thu thập 43 p ie gh d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus Hình 4.1: Phân lập S aureus môi trường thạch máu 31 Hình 4.2: Hình ảnh kết thử nghiệm kháng sinh đồ với chủng S aureus (S4) 32 Hình 4.3: Điện di kiểm tra dung dịch DNA tổng số tách chiết từ số mẫu S aureus 39 Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR 41 a lu Hình 4.5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi n MecAF-MecAR NucF-NucR 42 n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài a lu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học n 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn n va PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU tn to 2.1 Giới thiệu Staphylococcus: p ie gh 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm hình thái oa nl w 2.1.3 Danh pháp phân loại S aureus 2.2 Cấu trúc di truyền S aureus d a nv a lu 2.3 Các thị phân tử S aureus 2.4 Đặc tính sinh học S aureus u nf 2.5.Cơ chế gây bệnh ll m 2.6 Tình Hình Nghiên Cứu Tính Kháng Thuốc Ở S aureus n oi tz 2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 z 2.7 Cơ chế đề kháng kháng sinh 13 @ l gm 2.7.1 Ức chế enzyme 13 co 2.7.2 Giảm tính thấm tế bào vi khuẩn 14 m 2.7.3 Biến đổi vị trí gắn kết 15 Lu an 2.7.4 Bơm đẩy 16 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vi 2.7.5 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 17 2.8 Các phương pháp phát S aureus kháng thuốc 18 2.8.1 Phương pháp vi sinh 18 2.8.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu kháng sinh (MIC) 18 2.8.3 Kỹ thuật PCR 19 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 a lu 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20 n 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 20 n va 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20 tn to 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 20 p ie gh 3.3 Vật liệu nghiên cứu 20 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 20 oa nl w 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 21 3.3.3 Dụng cụ, thiết bị 22 d a nv a lu 3.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.4.1 Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S aureus kháng thuốc bệnh nhân điều trị u nf Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 22 ll m 3.4.2 Phân lập vi khuẩn S aureus kháng thuốc 22 n oi tz 3.4.3 Phát nhanh S aureus kháng methicillin kỹ thuật PCR 22 3.5 Phương Pháp Nghiên Cứu 23 z 3.5.1 Phương pháp phân lập S aureus, làm kháng sinh đồ từ bệnh nhân gm @ làm bệnh viên) 23 l co 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng hóa chất CTAB 27 m 3.5.3 Phản ứng PCR 29 Lu an 3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 30 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vii PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết phân lập 17 chủng S aureus kháng thuốc kháng sinh Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 31 4.2 Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh chủng S aureus bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 36 4.3 Thử nghiệm khả phát nhanh S aureus kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử 38 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 38 a lu 4.3.2 Kiểm định chủng S aureus 40 n 4.3.3 Nghiên cứu khả phát nhanh vi khuẩn S aureus kháng thuốc 41 n va PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 tn to 5.1 Kết luận 46 p ie gh 5.2 Kiến nghị 47 d oa nl w TÀI LIỆU THAM KHẢO a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Loài Staphylococcus aureus số vi khuẩn ký sinh da niêm mạc, nhiều mũi Có khoảng 10-40% người khỏe mạnh mang S aureus (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6] Khi có tổn thương da niêm mạc kèm theo rối loạn chức nhiễm trùng S aureus dễ dàng xuất Hiện nay, tượng S aureus a lu kháng kháng sinh trở nên phổ biến tình trạng sử dụng kháng sinh ngày n nhiều cộng đồng với kháng sinh có hoạt phổ rộng, nhiều loại n va kháng sinh khác với liều lượng không Hiện tượng kháng thuốc tn to không xuất vi khuẩn bệnh viện mà vi khuẩn p ie gh cộng đồng bệnh viện Việc nghiên cứu mức độ kháng thuốc vi khuẩn vấn đề cần thiết nhằm theo dõi diễn biến kháng thuốc, dự báo xu oa nl w kháng thuốc đề biện pháp thích hợp nhằm hạn chế mức gia tăng tính kháng thuốc từ giúp cho việc sử dụng kháng sinh cộng đồng d a nv a lu hợp lý tiết kiệm (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6] Theo kết khảo sát tính chất chống đối kháng sinh Thành u nf phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy chủng S aureus phân lập từ bệnh ll m phẩm có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% n oi tz kháng Amoxillin 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê cs, 2006) [8] Cũng theo báo cáo khác từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013, nghiên z cứu với 143 chủng S aureus tỉ lệ đề kháng KS S aureus 4.299 @ l gm bệnh phẩm, phân lập phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành co phố Hồ Chí Minh Kết cho thấy: S aureus chiếm 23,6%, đa số phân m lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) Lu an phân (10,5%) Qua kết từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng S n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 40 Từ kết đo OD thể bảng 4.3 kết điện di kiểm tra đại diện DNA tổng số 10 17 chủng S aureus (hình 4.3), cho thấy mẫu DNA thu có giá trị OD260/280 nằm khoảng 1,8 – 2,0, kết hợp với kết hình ảnh thu bảng điện di cho thấy mẫu DNA chúng tơi thu có băng sáng rõ Giữa kết điện di giá trị nồng độ DNA (bảng 4.3) cho thấy có mối tương quan Đường chạy số tương đương với DNA tổng số chủng S2 có băng sáng a lu cường độ cao, sản phẩm bị đứt gãy lẫn tạp, giá trị nồng độ DNA thu n 19,7 ng/μl; so với đường chạy khác: Đường chạy số tương ứng n va với DNA chủng S5, đường chạy số (S14), đường chạy số (S16), đường tn to chạy số 10 (S17) xuất băng sáng có cường độ thấp nồng độ DNA p ie gh thu thấp là: 8,2, 9,0, 5,3, 9,2 Các đường chạy cịn lại có cường độ sáng cao thu DNA có nồng độ cao Tuy oa nl w nhiên với giá trị OD260/280 nằm khoảng 1,8 – 2,0 mẫu DNA chúng tơi thu đủ yêu cầu để tiến hành thí nghiệm d a lu 4.3.2 Kiểm định chủng S aureus a nv Trong nghiên cứu trước, Nguyễn Văn Duy cộng (2014) [4], ll u nf thiết kế cặp mồi NucF NucR khuếch đại đặc hiệu vùng có kích thước m 439 bp gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt S aureus Nghiên cứu n oi chứng tỏ cặp mồi đặc hiệu cho việc phát S aureus Do đó, tz nghiên cứu này, để khẳng định chủng phân lập S aureus, z mẫu DNA tổng số 17 chủng sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR @ gm với cặp mồi NucF-NucR Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel m co l agarose 1,5% Kết điện di thể hình 4.4 đây: an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 a lu Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR n Đường chạy M: Thang chuẩn DNA 100 bp (Enzynomics - Hàn Quốc); đường n va chạy số 1: Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy - 18: mẫu kiểm tra tương ứng p ie gh tn to với chủng S aureus từ S1-S17 Kết kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR oa nl w hình 4.4 cho thấy, mẫu kiểm chứng âm tính (đường chạy số 1) khơng xuất sản phẩm PCR tất đường chạy từ số đến số 18 d cho băng DNA có kích thước khoảng 439 bp tương ứng với a lu a nv kích thước sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen nuc S aureus theo lý u nf thuyết chứng tỏ mẫu kiểm tra S aureus Kết thử ll nghiệm 17 chủng vi khuẩn phân lập khẳng định 17 m n oi chủng S aureus z thuốc kháng Methicillin tz 4.3.3 Nghiên cứu khả phát nhanh vi khuẩn S aureus kháng gm @ Trong loại thuốc kháng sinh thường sử dụng điều trị l Staphylococcus aureus, Methicillin nhóm kháng sinh sử dụng phổ m co biến Trong số 17 chủng S aureus chúng tơi phân lập có tới 15 an Lu chủng thể tính kháng với thuốc kháng sinh thuộc nhóm Methicillin n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 là: Penicillin (kí hiệu P) Oxacillin (kí hiệu OX5) Kết tổng hợp bảng 4.1 Trong nghiên cứu này, dựa công bố trước Kareen N.H (2013) [26], tập trung nghiên cứu khả phát chủng kháng Methicillin kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Để kiểm tra khả kháng Methicillin kỹ thuật PCR tiến hành thực phản ứng Multiplex PCR sử dụng cặp mồi MecAFMecAR phát tính kháng thuốc kháng Methicillin cặp mồi NucF-NucR a lu đặc hiệu cho Staphylococcus aureus Sản phẩm PCR kiểm tra điện n di gel agarose 1,5% Chủng S aureus kháng thuốc đánh giá n va chủng xuất băng DNA tương ứng với kích thước sản phẩm PCR tn to cặp mồi MucF-NucR cặp mồi kháng thuốc MecAF-MecAR Kết p ie gh kiểm tra chủng kháng không kháng Methicillin thể d oa nl w hình 4.5 a nv a lu ll u nf m tz n oi Hình 4.5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử z @ dụng cặp mồi MecAF-MecAR NucF-NucR gm l Đường chạy M: thang chuẩn DNA 100 bp (Enzynomics - Hàn Quốc), đường m co chạy số 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2-6: ứng với chủng S1, S2, S3, S5, S7, S10, S14; đường chạy - 14: tương ứng với chủng S4, S6, S8, S9, an Lu S11, S12, S13 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 43 Bảng 4.4: So sánh có mặt gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin chủng Staphylococcus aureus thu thập đƣợc Ký TT hiệu chủng Sự có Kiểu hình mặt kháng gen TT hiệu Methicillin mecA Sự có Ký chủng mặt gen Kiểu hình kháng Methicillin mecA S1 - - 10 S10 - + S2 - + 11 S11 + + S3 - - 12 S12 + + S4 + + 13 S13 + + tn to S5 - + 14 S14 - + S6 + + 15 S15 + + S7 - + 16 S16 + + + + 17 S17 + + S9 + + a lu n n va p ie gh d oa nl w S8 a lu a nv Kết điện di kiểm tra hình 4.5 cho thấy mẫu kiểm chứng u nf âm tính (đường chạy số 1) khơng hình thành sản phẩm PCR hoàn toàn đặc ll hiệu Tất mẫu kiểm tra xuất băng DNA có kích thước 439 bp m tz n oi sản phẩm khuếch đại cặp mồi NucF-NucR đặc hiệu cho S aureus Như tất chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus hoàn toàn z phù hợp với kết nghiên cứu kiểm định chủng S aureus Các @ gm đường chạy từ số đến số khơng xuất băng DNA có kích thước 533 bp l đường chạy từ số đến số 14 xuất thêm băng DNA Đây sản m co phẩm khuếch đại vùng gen mecA liên quan đến tính kháng Methicillin an Lu cặp mồi MecAF-MecAR theo công bố (Kareen N.H, 2013) [26] Từ n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 44 kết nghiên cứu cho phép kết luận chủng tương ứng với đường chạy từ số đến số 14 chủng S aureus kháng Methicillin Đối chiếu kiểu hình 17 chủng S aureus phân lập Bệnh viên Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên thể bảng 4.1 với kết điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi MecAF-MecAR NucF-NucR (hình 4.5), từ cho thấy có 10 chủng kháng Methicillin có mặt gen mecA (chiếm 66,66%), có chủng (chiếm 33,33%) âm tính với gen mecA Tất chủng mẫn cảm với Methicillin âm tính với gen a lu mecA Theo nghiên cứu công bố (Kareen N.H, 2013) [26], gen mecA n mã hóa cho phân tử protein 2a liên kết với Penicillin (Penicillin binding n va protein 2a - PBP2a) Protein định vị thành tế bào vi khuẩn có tn to lực liên kết yếu với thuốc kháng sinh β-lactam, gen khơng có mặt p ie gh chủng S aureus mẫn cảm với Methicillin Trong nghiên cứu năm 2013, Kareen N.H sử dụng kỹ thuật PCR với oa nl w cặp mồi MecAF-MecAR để phát có mặt gen mecA mã hóa protein 2a liên kết với Penicillin (Penicillin binding protein 2a – PBP2a) d a nv a lu 20 chủng vi khuẩn S aureus kháng Methicillin Kết cho thấy có 11/20 chủng (chiếm 55,0%) kháng Methicillin mang gen mecA [26] Trong nghiên u nf cứu Zmantar cộng năm 2013 (Zmantar T, 2013) [47], 39/59 chủng ll m kháng Methicillin dương tính với gen mecA, chiếm 66,1% n oi tz Từ công bố Kareen N.H (2013) Zmantar (2013) với kết nghiên cứu chủng kháng Methicillin dương tính với gen z mecA tương đồng Nghiên cứu cho thấy có 66,66% chủng @ m co 55,0% Zmantar (2013) 66,1% l gm kháng Methicillin dương tính với gen mecA, Kareen N.H (2013) an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 45 Như kết thử nghiệm chúng tơi, có chủng S aureus tổng số 15 kháng Methicillin khơng có mặt gen mecA, tính kháng methicillin chủng liên quan đến chế khác Theo nghiên cứu cơng bố, tính kháng Methicillin Staphylococcus aureus liên quan đến số thị phân tử khác bao gồm nhóm gen ermA ermB ermC, gen msrA blaZ Nhóm gen ermA ermB ermC mã hóa cho Methyl transferase dẫn đến tính kháng thuốc kháng sinh việc thay đổi vị trí liên kết ribosome 23S rRNA Nhóm gen a lu chủ yếu dẫn đến tính kháng thuốc kháng sinh nhóm Macrolide n có mặt số chủng S aureus kháng Methicillin [47] Gen msrA n va liên quan đến tính kháng thuốc thơng qua chế tăng cường hoạt động tn to bơm đẩy tế bào vi khuẩn [47] Trong nghiên cứu Zmantar p ie gh cộng sự, tổng số 59 chủng S aureus kháng thuốc kiểm tra kỹ thuật PCR, 22% số chủng mang gen ermC, 15% số chủng mang gen ermA oa nl w 30% số chủng mang gen ermB gen msrA có mặt 36% số chủng S aureus kháng Methicillin (Zmantar T, 2013) [47] d a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết Luận Từ kết nghiên cứu đưa số kết luận sau: - Đã khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh S aureus phân lập bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ tháng 12 năm 2014 đến tháng năm 2015 Kết cho thấy tất a lu kháng sinh sử dụng điều trị S aureus bị kháng lại n chủng Trong loại kháng sinh bị kháng nhiều Penicillin, n va Erythromycine, Neomycin, Clavithromycine, Oxacillin với tỉ lệ kháng (50%), tn to với Penicillin (86,6%) số chủng; Erythromycine (66,6%); Neomycin (63,3%); p ie gh Clavithromycine (56,6%); Oxacillin (50%); chủng kháng gồm có: Chloramphenicol, Pefloxacine, Noflloxacine, Clindamycin, Cifowxa, Gentamycine, oa nl w Vacomycine, Doxyciline, Amo+a.clavulanine, Oxacillin, Piperacicine, Cefoxitin, Cephazidine, Ampicillin, Cefalexin Chloramphenicol (43,3%) số chủng, d (33,3%); a nv a lu sau đến Pefloxacine, Noflloxacine, Clindamycin Cifowxa Gentamycine, Vacomycine (30%); Doxyciline (20%); u nf Amo+a.clavulanine (16,6%); Piperacicine, Cefoxitin Cephazidine (13,3%); ll m Ampicillin (10%); Cefalexin (6,6%); loại kháng sinh bị kháng Tobramycine; Cephalothin với tỉ lệ kháng (3,3%) Metroxondazla; tz Nitrofurantoin; n oi Piperacine; Ofloxacine; z - Đã phân lập 17 chủng vi khuẩn S aureus kháng thuốc từ @ l gm bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên Trong co đó, có chủng số kháng loại kháng sinh, chủng số 11 16 kháng loại m kháng sinh; chủng số kháng loại kháng sinh; chủng số 10 kháng loại Lu an kháng sinh; chủng số 3,17 kháng lại loại kháng sinh; chủng số kháng lại n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 47 10 loại kháng sinh; chủng số 4, 12 kháng lại 11 loại kháng sinh; chủng số 8, 13, 14 kháng lại 13 loại kháng sinh; chủng số 15 kháng lại 14 loại kháng sinh; chủng số kháng lại 15 loại kháng sinh; chủng số kháng lại 16 loại kháng sinh chủng số kháng lại 17 loại kháng sinh Tất 17 chủng khẳng định S aureus kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gen nuc - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh S aureus kháng thuốc kháng sinh nhóm Methicillin thơng qua thị gen mecA a lu Trong chủng kháng Methicillin dương tính với gen mecA chiếm 66,66% n 5.2 Kiến nghị va n - Tiếp tục khảo sát tỷ lệ chủng S aureus kháng Methicillin tn to có mặt gen mecA tập hợp lớn chủng để đưa số liệu thông kê p ie gh có ý nghĩa - Tiếp tục nghiên cứu phát S aureus kháng Methicillin thông qua oa nl w thị phân tử khác tính kháng thuốc kháng sinh khác S aureus kỹ thuật PCR d a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Hữu An, Trần Thị Tuyết Nga, Cao Hữu Nghĩa, Vũ Lê Ngọc Lan, (2013), "Tỷ lệ kháng kháng sinh Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh", số 10(146), Tạp chí Y học dự phịng Nguyễn Thị An., Nguyễn Thị Kim Hồng., Phạm Thị Thùy Dương., Võ Thị Huỳnh Mai., Lê Thị Thu Trúc , (2011), “Staphylococcus aureus điều cần a lu biết chúng” , Bộ Giáo Dục Và Đào Tạo - trường Đh Kỹ Thuật Công Nghệ n Tp.Hcm-khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học n va Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt p ie gh tn to Nam năm 2008-2009 Báo cáo Bộ Y tế - Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu kháng kháng sinh GARP Việt Nam Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford oa nl w Nguyễn Văn Duy (2011), “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật DNA macroarray nhằm phát nhanh tính kháng rifampicin isoniazid vi d a nv a lu khuẩn lao”, Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Hải (2010), “nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh trực u nf khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)”, luận văn thạc sĩ sinh học, ll m Đại Học Thái Nguyện - Trường Đại Học Sư Phạm n oi tz Trần Thị Như Hoa, (2012) “nghiên cứu tỷ lệ mang Staphylococcus aureus độ nhạy cảm với kháng sinh chúng trẻ tuổi địa bàn z phường vĩnh ninh, thành phố huế, Trường Đại học Y khoa @ l gm Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc Việt Nam năm 2008, m toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y Tế co dự báo giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, cục an an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn đỗ Phúc, Hoàng Hoài phương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga, (2006), “Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế cơng cộng Y học dự phịng, phụ tập 10 (số 4), tr 406-411 Trần Thị Xuân Mai (2011), “Phát nhanh Salmonella spp, Salmonella enterica diện thực phẩm kỹ thuật PCR đa mồi a lu (multiplex-PCR)”, Tạp chí Khoa học, 20, tr 198-208 n 10 Phạm Văn Phúc, (2013), “Nghiêm Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Multiplex va n PCR Phát Hiện Nhanh Và Đồng Thời Staphylococcus aureus Và p ie gh tn to Samonella Typhi Gây Bệnh Trong Thực Phẩm”, luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học - Đại Học Thái Nguyên - trường Đại Học Nông Lâm 11 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, oa nl w thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục 230 12 Tổ chức Y tế giới (WHO), ( 30/4/2014), Tình hình kháng thuốc kháng d a nv a lu sinh số biện pháp phòng ngừa 13 Quyết định số 2174/QĐ-BTC " Kế hoạc hành động quốc gia kháng u nf thuốc", Bệnh viện Nhi Trung ương ll m 14 Vi sinh vật Y học, môn Vi sinh vật học, Trường Đại Học Y Khoa, nhà tz Tiếng nƣớc ngoài: n oi xuất Y học, 1974 z @ l gm 15 Anton Y.P, David C Hooper (2010), “Hospital-Acquired Infections Due co to Gram-Negative Bacteria”, N Engl J Med, 362(19), 1804-1813 m 16 Agence de la santes publique du Canada Programme canadien de Lu an surveillance des infections nosocomiales : Surveillance de Staphylococcus n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 aureus resistant la méthicilline (SARM) chez les patients hospitalisés dans des hopitaux canadiens de soins de courte durese http://www.phacaspc.gc.ca/ nois-sinp/reports-rapport/mrsa-sarm_result-fra.php (site visité le 19 avril 2009 17 Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L., Yamamoto K , Hiramatsu K., (2002), “Genome and virulence determinants of high virulence community - acquired MRSA”, Lancet, 359(9320), pp 1819- a lu 1827 n 18 Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K., (2008), va n “Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and p ie gh tn to comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands”, J Bacteriol, 190 (1)300- 310 oa nl w 19 Baird R.M, Lee W.H (1995), “Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus”, Int J Food Microbiol, 26(1):15- d a nv a lu 24 20 Brakstad O.G.,Aasbakk K.,Maeland, J A., (1992), “Detection of u nf Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the ll m nuc gene”, J Clin Microbiol, 30 (7),pp 1654-1660 n oi tz 21 Bush, K., G A Jacoby (2010), “Update functional classification of lactamases”, Antimicrob Agents Chemother, 54, 969-976 z 22 CLSI (2010), “Performance standards for antimicrobial susceptibility @ l gm testing twentiethinformational supplement M100-S20”, 30(1), 2010 J.,Paulsen, I T.,Kolonay, J F.,Brinkac, L.,Beanan, m T.,Ravel, co 23 Gill, S R.,Fouts, D E.,Archer, G L.,Mongodin, E F.,Deboy, R Lu an M.,Dodson,R J.,Daugherty, S C.,Madupu, R.,Angiuoli, S V.,Durkin, A n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 S.,Haft, D H.,Vamathevan, J.,Khouri, H.,Utterback, T.,Lee, C.,Dimitrov, G.,Jiang, L.,Qin, H.,Weidman, J.,Tran, K.,Kang, K.,Hance, I R.,Nelson, K E.,Fraser, C M., (2005), “Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillinresistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain”, J Bacteriol, 187 (7): (2426-2438 ) 24 Guardabassi L, Courvalin P (2006), Modes of Antimicrobial Action a lu and Mechanisms of Bacterial Resistance, 1-18 In Aarestrup F n (ed), Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin ASM va n Press, Washington, DC tn to 25 Hoa, N.Q., et al., Unnecessary antibiotic use for mild acute respiratory p ie gh infections in 28-day follow-up of 823 children under five in rural Vietnam Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2007 oa nl w 26 Kareen N.H (2013) Detection and Evaluation of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus by Duplex PCR, Journal of Al-Nahrain University d a nv a lu Science, 16 (2): 157-162 27 Kenneth Todar , 2005, Todar’s Online of u nf University Wisconsin-Madison Textbook of Department of Bacteriology Bacteriology ll Kenneth m Todar University of Wisconsin-Madison n oi (Staphylococcus) tz Department of Bacteriology, 2005 28 Kumarasamy K.K et al (2010), “Emergence of a new antibiotic resistance z @ mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and l gm epidemiologic al study” Lancet Infect Dis , 10, pp 597 – 602 co 29 Larsson, M., Antibiotic use and resistance: Assessing and improving m utilisation and provision of antibiotics and other drugs in Vietnam PhD an Lu Thesis, 2003 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 30 Larsson, M., et al., Antibiotic medication and bacterial resistance to antibiotics: a survey of children in a Vietnamese community Trop Med Int Health, 2000 5(10): p 711-21 31 Lewis R US Food and Drug Administration (FDA).The rise of antibioticresistant infections.http://www.fda.gov/fdac/features/795_antibio.html (site visité le 23 avril 2009 32 B M Madison., V S Baselski., Copyright and License information , (1983), “Rapid identification of Staphylococcus aureus in blood cultures a lu by thermonuclease testing”, J Clin Microbiol, 18(3): 722–724 n 33 Mandell GL, Bennett JE, Dolin R Mandell Douglas and Bennett’s va n principles and practice of infectious diseases Sixiesme esdition, Elservier, Livingstone esditeurs, USA Edition en ligne p ie gh tn to Churchill http://www.ppidonline com (site visité le 1er avril 2009 34 Mary K Sandel and John L McKillip (2002), Virulence and recovery of oa nl w Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches Food control 15, pp 5-10 d a nv a lu 35 Michael R Mulvey, PhD and Andrew E Simor, MD (2009), Antimicrobial resistance in hospitals: How concerned should we be?, u nf CMAJ 2009 Feb 17; 180(4): 408–415 ll “Detection and Evaluation of Methicillin- m n oi 36 Noor H.Kareem (2013) tz Resistant Staphylococcus aureus by Duplex PCR, Journal of Al-Nahrain University Science”, Vol.16 (2)pp.157-162 z 37 Pinto B., Chenoll E., Aznar, R, (2005), “Identification and typing of @ co Microbiol, 28(4):340-352 l gm food-borne Staphylococcus aureus by PCR-based techniques”, Syst Appl m 38 Pitout JD, Hanson ND, Church DL, Laupland KB Population-based Lu an laboratory surveillance for Escherichia coli-producing extended-spectrum n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 βs-lactamases: importance of community isolates with blaCTX-M Genes Clin Infect Dis 2004;38:1736-41 39 Sandel M.K., McKillip J.L., (2002), “virulence and recovery of staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches”, Food control, 15, pp 5-10 40 Sasaki T.,Tsubakishita S., Tanaka Y.,Sakusabe, A., Ohtsuka, M., Hirotaki, S., Kawakami, T., Fukata, T., Hiramatsu, K., (2010), “Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive a lu Staphylococci”, J Clin Microbiol, 48(3):765-769 n 41 Scott E Martin, John J Iandolo, J Harvey, A Gilmour, Sita R Tatini, va n Reginald Bennett Merlin S Bergdoll, 2000 Staphylococcus p ie gh tn to Encyclopedia of Food Microbiology, (Richard K.Robinson, Carl A.Batt Pradip D.Patel) Academic Press, San Diego - San Francisco - New Yolk – Boston – London – Sydney - Tokyo p.2062-2083 oa nl w 42 Song, J.H., et al., High prevalence of antimicrobial resistance among clinical Streptococcus pneumoniae isolates in Asia (an ANSORP study) d a nv a lu Antimicrob Agents Chemother, 2004 48(6): p 2101-7 43 Wei H L., Chiou C.S., (2002), “Molecular subtyping of Staphylococcus u nf aureus from an outbreak associated with a food handler”, Epidemiol ll m n oi Infect, 128(1):15-20 tz 44 Wilson I G., Cooper J E., Gilmour, A., (1991), “Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of the reaction for amplification and detection of gm @ chain z polymerase staphylococcal enterotoxin genes entB and entC1 and the thermonuclease l m co gene nuc”, Appl Environ Microbiol, 57(6):1793-1798 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99
Ngày đăng: 25/09/2023, 08:00
Xem thêm:
