Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC KHÁN[.]
i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài : BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : CHÍNH QUY Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K43 - CNSH Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : BS Nguyễn Thị Huyền TS Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN – 2015 e i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thầy cô trực tiếp giảng dạy tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt năm học vừa qua Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình tơi q trình thực đề tài BS Nguyễn Thị Huyền, CN Trần Trung Anh KTV Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện đa khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ, giúp đỡ tơi tận tình cung cấp cho tơi chủng vi sinh vật để thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè bên cạnh động viên giúp đỡ tơi học tập làm việc hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 28 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Tuấn Anh e ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng đề tài nghiên cứu 18 Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 18 Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng đề tài nghiên cứu 19 Bảng 4.1: Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 30 Bảng 4.2: Kiểu hình chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 33 Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ chủng Pseudomonas aeruginosa 38 Bảng 4.4: So sánh có mặt gene kháng metallo β-lactamase với kiểu hình kháng β-lactam chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập 41 e iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.… 31 Hình 4.2: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số số mẫu Pseudomonas aeruginosa 36 Hình 4.3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi OPRLFOPRLR 38 Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi blaIMPF-blaIMPR blaVIMF-blaVIMR 40 e iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Từ, thuật ngữ viết tắt CIAA DNA dNTPs OD Hỗn hợp gồm 24 chloroform : isoamylalcohol (v/v) Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Optical Density - Mật độ quang Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp PCR chuỗi trùng hợp – trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro RNA ELISA Ribonucleic Acid Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme e v MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.2.1 Tình hình kháng thuốc Pseudomonas aeruginosa giới 2.2.2 Tình hình kháng thuốc Pseudomonas aeruginosa nước 2.3 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn 11 2.3.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc kháng sinh 11 2.3.2 Cơ chế thay đổi đích thuốc kháng sinh 11 2.3.3 Cơ chế ngăn xâm nhập kháng sinh vào tế bào 12 2.3.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas aeruginosa 13 2.4 Các phương pháp phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 14 2.4.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán đĩa thạch 14 2.4.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu kháng sinh (MIC) 15 2.4.3 Kỹ thuật PCR 15 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 17 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 e vi 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 17 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 18 3.3.3 Dụng cụ, thiết bị 19 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 3.5.1 Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân 19 3.5.2 Phương pháp xác định kháng sinh đồ 24 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 25 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh chủng Pseudomonas aeruginosa bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 29 4.2 Kết phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 32 4.3 Thử nghiệm khả phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 35 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 35 4.3.2 Kiểm định chủng Pseudomonas aeruginosa 37 4.3.3 Nghiên cứu khả phát nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 39 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO e Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Chúng gây nên bệnh lí với nhiều mức độ khác viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong cao Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện trực trùng mủ xanh (P aeruginosa) tăng dần năm gần giới Việt Nam Cùng với gia tăng tỉ lệ nhiễm khuẩn khả kháng kháng sinh tăng cao Theo báo cáo CDC ước tính năm Hoa Kì có hai triệu người mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh có 23.000 người chết có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa Trong ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa có 6000 (13%) đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong nhiễm trùng (Fatima A cs, 2012) [22] Theo kết nghiên cứu khác (2013), 112 mẫu P aeruginosa phân lập từ bệnh nhân điều trị bỏng bệnh viện năm 2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N M cs, 2013) [26] Ở Việt Nam, nghiên cứu 36 bệnh viện tỉnh phía Bắc từ Trung Ương đến địa phương năm 2006 – 2007 cơng bố có tới 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs) Có loại nhiễm khuẩn bệnh viện gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ nhiễm khuẩn tiêu hóa P aeruginosa nguyên nhân (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng cs, 2008) [8] Theo kết nghiên cứu từ bệnh viện Hà Nội: Việt Đức, e Xanh Pôn, Bệnh viện 108 Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P aeruginosa phân lập từ bệnh phẩm đề kháng cao với loại kháng sinh Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) Gentamicin (54%) (Bùi Khắc Hậu cs, 2008) [6] Tình hình đề kháng đa kháng sinh P aeruginosa ghi nhận nghiên cứu cho thấy gia tăng tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện P aeruginosa khả kháng lại kháng sinh vi khuẩn gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong tăng chi phí điều trị Để phát P aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường sử dụng nuôi cấy môi trường thạch kết hợp với thử nghiệm hóa sinh làm kháng sinh đồ Đây phương pháp phức tạp tốn nhiều thời gian, chậm cho kết (4 - ngày) Sự phát chậm P aeruginosa kháng thuốc nguyên nhân làm chậm hướng điều trị góp phần làm giúp cho tác nhân gây bệnh có hội lây lan cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe nhiều người Với phát triển sinh học phân tử, vùng gene đặc hiệu cho tính kháng thuốc loài vi sinh vật hiểu biết ngày đầy đủ Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng việc phát nhanh đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh mẫu phân tích dựa dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu Các kỹ thuật bao gồm kỹ thuật PCR, ELISA, DNA arrays… PCR kỹ thuật cho phép phát tác nhân gây bệnh kháng thuốc phép phân tích Đây kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên thuận lợi việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán Xuất phát từ thực tiễn đời sống, sở vào lực nghiên cứu Khoa CNSH CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu e phƣơng pháp phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam kỹ thuật PCR” Trong khn khổ khóa luận này, chúng tơi tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas aeruginosa bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng năm 2015 bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm βlactam 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu đề tài Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kỹ thuật PCR - Yêu cầu đề tài + Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên + Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc + Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Bước đầu xây dựng thành công kỹ thuật PCR phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc - Ý nghĩa thực tiễn + Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh Tạo tiền đề cho việc xây dựng kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa kỹ thuật PCR e ... 2015 bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm ? ?lactam 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu đề tài Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh. .. phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β- lactam kỹ thuật PCR? ?? Trong khn khổ khóa luận này, tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas... aeruginosa kháng thuốc + Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Bước đầu xây dựng thành công kỹ thuật PCR phát