Plant_based_vaccine

Vaccine thực vật loại vaccine thế hệ mới có nhiều triển vọng Nguyễn Hoàng Lộc Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế TÓM TẮT Các tiến bộ gần đây trong lĩnh vực chuyển gen thực vật đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học, và thực vật đang được nhìn nhận như là các lò phản ứng sinh học (bioreactor) hoặc nhà máy sinh học (biofactory) để sản xuất các phân tử dùng trong liệu pháp miễn dịch (immunotherapeutic molecules). Nguyên liệu chuyển gen, ở dạng hạt hoặc quả, có thể dễ dàng bảo quản và vận chuyển từ nơi này đến nơi khác mà không lo ngại bị phân hủy hoặc hư hỏng. Hơn nữa, một lượng lớn sinh khối có thể được sản xuất dễ dàng bằng cách canh tác trên đồng ruộng với chi phí đầu tư tương đối ít. Vaccine là loại dược phẩm có một vai trò then chốt trong chăm sóc sức khỏe. Tuy nhiên, giá thành sản xuất và bảo quản một dây chuyền phân phối vaccine đã cản trở tiềm năng thật sự của chúng. Biểu hiện kháng nguyên như là một vaccine trong cây chuyển gen đã tạo ra một phương thức sản xuất thuận lợi các phân tử dùng trong liệu pháp miễn dịch với giá thành thấp. Các kháng nguyên khác nhau đã được biểu hiện thành công trong thực vật cho thấy chúng giữ lại được các dạng chức năng tự nhiên của mình. Vaccine thực vật phòng bệnh tiêu chảy, biểu hiện trong khoai tây, đang được thử nghiệm tiền lâm sàng ở người. Các cố gắng khác đang được tiến hành để biểu hiện trong cây nhiều protein trị liệu miễn dịch dùng ở nồng độ cao và sử dụng thực vật như là các lò phản ứng sinh học của kỷ nguyên hiện đại. Thông báo đầu tiên về sản xuất vaccine thực vật xuất hiện vào năm 1990 dưới hình thức một ứng dụng có bằng sáng chế, và khái niệm vaccine thực vật đã được phát triển sau khi Arntzen cùng các cộng sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B trong cây thuốc lá vào năm 1992 để sản xuất thành phần mang hoạt tính miễn dịch thông qua công nghệ di truyền thực vật. Điều này đã tạo ra một sự kích thích mạnh mẽ trong các nhà công nghệ sinh học, đặc biệt là về tiềm năng của vaccine thực vật đối với liệu pháp miễn dịch cho các nước đang phát triển. Từ khóa: vaccine thực vật, vaccine thực phẩm, biểu hiện gen, cây trồng chuyển gen 1. Mở đầu Thành công nổi bật của công nghệ gen thực vật bậc cao là tái sinh được cây chuyển gen (transgenic plant) đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, cây trồng biến đổi gen (genetically modified plant) đã và đang đóng góp rất nhiều trong việc đáp ứng nhu cầu lương thực và thực phẩm cho con người. Công nghệ gen hiện đang được sử dụng như một phương pháp sinh học hiện đại để nghiên cứu cải thiện di truyền các giống cây trồng và vật nuôi. Một trong những hướng nghiên cứu gần đây của công nghệ gen là chuyển gen ngoại lai (foreign gene) vào thực vật với mục đích tạo ra kháng nguyên để sản xuất 2 các vaccine phòng bệnh cho người và động vật. Vaccine thực vật (plant-based vaccine) hay vaccine thực phẩm (edible vaccine) là một mô hình lý tưởng cho các nước nghèo do có thể khắc phục các khó khăn của vaccine nhược độc được sản xuất theo phương pháp truyền thống (có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể người và vật nuôi) hoặc vaccine DNA tái tổ hợp (giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên tiêm chủng) (Sala et al., 2003). Nguyên lý cơ bản của mô hình vaccine thực vật là chuyển một loại gen mã hóa cho protein kháng nguyên vào tế bào thực vật. Loại gen này hoạt động trong cơ thể cây trồng, sẽ biến thành nơi sinh ra protein kháng nguyên. Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống không nấu chín, nếu không sẽ làm mất hoạt tính kháng nguyên) thì hệ thống miễn dịch sẽ thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Như vậy là đã thay việc tiêm chủng vaccine bằng việc ăn những sản phẩm thực vật có kháng nguyên. Vaccine thực vật có nhiều ưu điểm như: giá thành rẻ, ổn định, dễ sản xuất trên quy mô lớn, dễ quản lý, không cần tinh sạch, bảo quản lâu và dễ vận chuyển… (Lal et al., 2007). Một trong những nghiên cứu đã được công bố gần đây trong lĩnh vực kể trên đó là gây miễn dịch trong cơ thể người bằng vaccine thực vật để điều trị bệnh viêm gan B. Loại cây trồng được sử dụng để chuyển gen viêm gan B là khoai tây (Solanum tuberosum). Người ta hy vọng khi ăn loại khoai tây này, kháng nguyên sẽ gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể người theo các mức độ khác nhau. Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra đáp ứng miễn dịch cá thể đối với căn bệnh lây nhiễm viêm gan B (Thanavala et al., 2005). 2. Công nghệ sinh học và chuyển gen thực vật Công nghệ gen là chìa khóa vàng để phát triển các lĩnh vực công nghệ sinh học. Những thành tựu về cây trồng biến đổi gen trên thế giới không chỉ giới hạn trong lĩnh vực nông nghiệp, tạo ra những mùa màng bội thu, giải quyết nạn đói toàn cầu mà còn có thể sản xuất ra các loại biệt dược phòng chống được các bệnh hiểm nghèo cho con người. Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất những chế phẩm tổng hợp trong thực vật đã phát triển mạnh vào những năm 1990, chẳng hạn: các thành phần của máu như huyết cầu tố, albumin, các kháng thể, hormone, các yếu tố đông máu được sản xuất từ cây thuốc lá biến đổi gen (Goldstein và Thoman 2004). Nhiều công trình đã công bố về chuyển gen vào cây trồng để tạo vaccine thực vật như: vaccine phòng bệnh viêm gan B (Thanavala et al., 1995) và vaccine phòng bệnh tả được sản xuất từ cây khoai tây (Arakawa et al., 1997). Kang và đồng tác giả (2003a), Kim và đồng tác giả (2004) đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen CTB (cholera toxin B subunit) vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và gen HIV-1 gp120 V3 vào khoai tây. Daniell và đồng tác giả (2001a) đã chuyển gen CTB vào cây thuốc lá bằng kỹ thuật vi đạn. Hiện nay, chuyển gen đã được thực hiện ở trên 120 loài thực vật thuộc khoảng 35 họ bao gồm các cây trồng nông nghiệp, rau quả, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và cây cỏ bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp hay gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp là các phương pháp chuyển gen nhờ các tác nhân vật lý và hóa học, DNA 3 được biến nạp vào trong tế bào trần, tế bào, mô hoặc cơ quan nhờ các phương pháp như vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen (gene gun), silicon carbide, siêu âm (ultrasound) . Tuy nhiên, phương pháp thông dụng hơn cả là chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, vi khuẩn này được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào tế bào thực vật. Agrobacterium tumefaciens chứa một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb (gọi là Ti-plasmid) có cấu trúc mạch vòng bao gồm những vùng quan trọng như vùng T-DNA, vùng gây độc (vir), vùng khởi đầu sao chép (ori). Trong kỹ thuật chuyển gen, vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của nó được giữ nguyên (De la Rival el al., 1998). T-DNA là một vùng DNA có kích thước 25 kb trong đó có phần DNA chứa gen mã hóa sinh tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Vùng này có kích thước khoảng 40 kb, bao gồm 6 operon: virA, virB, virD và virG cần thiết cho việc tạo ra độc tính; virC và virE liên quan đến việc hình thành khối u. Trong quá trình chuyển T-DNA, đoạn T-DNA muốn chuyển được trước tiên phải được hoạt hóa, chính hoạt động của các gen vir đóng vai trò này. Hiện tượng hoạt hóa xảy ra khi Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hay tế bào trần. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng trong việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi tính chất của màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của tế bào cây chủ. Việc chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens đã thực hiện thành công trên nhiều loại cây trồng như thuốc lá, cà chua, đậu tương, lúa, mía… (De la Rival el al., 1998). 3. Vaccine và vaccine thực vật Những tiến bộ về khoa học và kỹ thuật trong lĩnh vực vi sinh vật học, hóa sinh protein nói chung, cũng như trong lĩnh vực kỹ thuật gen và công nghệ sinh học nói riêng đã cho phép chúng ta tiến xa hơn, đi sâu hơn và ứng dụng hiệu quả hơn những thành tựu đó trong nhiều ngành công nghệ mới, trong đó có công nghệ sản xuất và ứng dụng vaccine. Đề cập đến vaccine, phải nói đến yếu tố quyết định kháng nguyên của chế phẩm được chọn làm vaccine đó. Yếu tố quyết định kháng nguyên chính là thành phần protein kháng nguyên có trên bề mặt của tác nhân gây bệnh, hay trên bề mặt của chế phẩm vaccine của chính tác nhân gây bệnh đó. Vaccine truyền thống và vaccine tái tổ hợp là các chế phẩm sinh học của vi sinh vật được làm giảm độc lực, không còn khả năng gây bệnh đối với đối tượng nhận vaccine. Khi đưa vaccine vào cơ thể bằng các phương pháp khác nhau, chúng đều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịch. Khi cơ thể chịu sự kích thích của kháng nguyên, sẽ thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch sản xuất ra một loại protein mới có chức năng bảo vệ gọi là kháng thể. Thời gian gần đây người ta vẫn sử dụng vaccine sống nhược độc cung cấp nguồn kháng nguyên để kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi. Hiện nay, bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 4 người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh lở mồm long móng, bệnh dại, viêm gan B và nhiều loại khác. Tuy nhiên, vaccine được sản xuất theo phương pháp trên có giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, đồng thời cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng (Sala et al., 2003). Công nghệ sinh học phân tử thực vật cho phép chuyển nhiều gen quý vào genome thực vật, tạo nên thế hệ thực vật có ưu thế mang các gen sản xuất nhiều sản phẩm có lợi. Hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rất hữu hiệu nhằm chuyển gen ngoại lai có giá trị vào thực vật. Một khi gen ngoại lai nào đó được xâm nhập vào thực vật, genome thực vật sẽ xem nó như một gen hoạt động của chúng và gen này sản xuất sản phẩm tương ứng mà nó chịu trách nhiệm (Lessard et al., 2002). Mô hình sản xuất vaccine thực vật Xuất phát từ cơ sở khoa học trên, ý định gắn một hay nhiều gen kháng nguyên làm vaccine động vật và người vào hệ thống Ti-plasmid và A. tumefaciens đã được Kháng nguyên quan tâm Gen cấu trúc (gen mã hóa) Vector biểu hiện thực vật Biến nạp gián tiếp qua A. tumefaciens Tạo callus và chọn lọc Tái sinh cây Phân tích mức độ biểu hiện Phân tích khả năng sinh miễn dịch Tối ưu hóa mô hình 5 thực hiện. Sau khi chuyển gen, thực vật thế hệ mới đã tiếp nhận một nguồn gen làm vaccine từ vi sinh vật hoặc nguồn sản xuất protein có hoạt tính sinh học nào đó. Khi được canh tác, cây mang gen kháng nguyên đã tiến hành sản xuất sản phẩm và chứa trong các thành phần cơ thể chúng. Nếu tách chiết và tinh sạch chúng sẽ thu được sản phẩm protein kháng nguyên. Nếu sử dụng nguyên vẹn, động vật và người “ăn” loại thực vật này thì về nguyên tắc, sẽ tiếp nhận được nguồn vaccine và do vậy có được khả năng miễn dịch (Walmsley et al., 2000). Ưu thế của thực vật chuyển gen để sản xuất vaccine và các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là chúng dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, sản lượng cao, do vậy cho chúng ta thu được một lượng sản phẩm lớn (Sala et al., 2003). Những kháng nguyên được sản xuất trong thực vật không mang nguồn bệnh đến cho con người, những độc tố trong hệ thống vaccine được giảm thiểu vì những tác nhân gây bệnh cho người và động vật không gây bệnh trên thực vật (Walmsley et al., 2000). Tuy nhiên, có một số vấn đề cần phải giải quyết khi phát triển vaccine thực vật. Thứ nhất, chúng ta phải lựa chọn loại thực vật nào để dễ dàng thao tác đưa gen vaccine vào, lại vừa ngon miệng để con người và động vật ăn chúng. Sự lựa chọn thực vật để sản xuất và phát triển vaccine là rất quan trọng. Mặc dù những cây ngũ cốc có thể chứa protein LTB (B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin) trung hòa độc tố E. coli nhưng chúng sẽ bị mất hoạt tính kháng nguyên khi nấu chín. Khoai tây chuyển gen đun sôi trong thời gian ngắn (3 phút) mất đi 50% tác dụng của nó (Tacket, Mason 1999). Thứ hai, chúng ta nên chọn loại gen kháng nguyên nào ghép vào hệ gen thực vật, để sau khi chuyển vào cơ thể, chúng không bị enzyme của hệ tiêu hóa phân hủy, đảm bảo còn tồn tại để kích thích miễn dịch. Trở ngại chính của việc sử dụng vaccine thực vật là phải tìm cách khắc phục sự phân giải của protein trong môi trường ruột. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vaccine gây đáp ứng miễn dịch bằng đường miệng đòi hỏi một liều dùng phải cao hơn vaccine tái tổ hợp do một phần kháng nguyên bị mất tác dụng trong môi trường acid của dạ dày (Daniell et al., 2001b). Thứ ba, nếu dùng thực vật chuyển gen để sản xuất kháng nguyên làm vaccine phân tử thì phải chọn cây dễ trồng, năng suất cao, dễ dàng thu hoạch, chế biến và bảo quản. Một trong những loài thực vật được chọn đầu tiên để chuyển gen vaccine là cây thuốc lá, vì loại cây này dễ thao tác bằng kỹ thuật gen, dễ dàng nhân giống và dễ trồng. Năm 1992, Mason và đồng tác giả đã thực hiện chuyển gen kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B vào đối tượng này (Mason et al., 1992). Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thành công như chuyển gen kháng nguyên cholera phòng bệnh dịch tả (Daniell et al., 2001a), gen kháng nguyên phòng bệnh than (Aziz et al., 2002), gen BfpA phòng bệnh đường ruột do enteropathogeneic E. coli (EPEC) gây ra (Silva et al., 2002), gen kháng nguyên phòng bệnh uốn ván (Tregoning et al., 2004) và nhiều bệnh khác . Tuy nhiên, loại cây này không được người và động vật thích ăn, vả lại chúng rất độc nên chúng chỉ được dùng vào mục đích nghiên cứu, hoặc sản xuất chế phẩm sinh học bằng công nghệ gen. 6 Khoai tây và các loại cây ăn quả đang là mục tiêu được chọn để chuyển gen vaccine, vì nó vừa là thức ăn của người và động vật, vừa có thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao nên giá thành rẻ và dễ sử dụng. Các công trình nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây đã cho kết quả khả quan như chuyển gen kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (Thanavala et al., 1995, Kong et al., 2001), gen LTB (Lauterslager et al., 2001), gen phòng bệnh human papillomavirus-like particles (Warzecha et al., 2003), gen kháng nguyên bề mặt vỏ HIV-1 gp120 (Kim et al., 2004). Chuối cũng đã được Hassler và đồng tác giả (1995) đưa vào thử nghiệm. Sở dĩ loại cây này được chú ý vì quả được trẻ em ưa thích, lại dễ trồng và thường mọc tự nhiên ở các nước đang phát triển (Tripurani et al., 2003). Việc phát hiện ra vaccine thực vật đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trên con đường tìm ra phương thức sản xuất vaccine rẻ tiền, điều này rất có ý nghĩa đối với các nước đang phát triển (Tregoning et al., 2004). Người ta hy vọng rằng việc tạo ra loại vaccine này sẽ giúp các nước nghèo tự sản xuất được vaccine này và sử dụng chúng một cách thuận tiện bằng cách trồng các loài thực vật chuyển gen (Tripurani et al., 2003). 4. Tầm quan trọng của việc cải thiện mức độ biểu hiện gen Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy gen CTB vi khuẩn (Vibrio cholerae) biểu hiện chỉ khoảng 0,3% lượng protein hòa tan tổng số (total soluble protein) ở khoai tây (Arakawa et al., 1997); 0,095% ở thuốc lá (Wang et al., 2001); 0,02% và 0,04% tương ứng trong lá và quả cà chua (Jani et al., 2002). LTB tự nhiên (có nguồn gốc từ E. coli) biểu hiện trong thực vật rất thấp dưới 0,01% và rất hiếm khi đạt đến 0,4% protein hòa tan tổng số (Mason et al., 2002). Kháng nguyên bề mặt viêm gan B chỉ đạt 0,01% protein hòa tan tổng số trong thực vật (Mason et al., 1992). Mức độ biểu hiện thấp như vậy của các kháng nguyên ngoại lai trong cây trồng đã hạn chế sự phát triển hiệu quả của các vaccine thực vật. Vì thế, việc hướng tới các mức độ biểu hiện cao hơn của protein mong muốn đang được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm nghiên cứu. Một trong những biện pháp tăng cường sự biểu hiện của gen là chúng ta phải biến đổi gen, thiết kế lại cấu trúc gen và chuyển gen vào cơ quan thích hợp. Gen có thể được biến đổi để có được điểm gắn ribosome cần thiết trên phân tử mRNA nhằm giúp nó có hoạt động biểu hiện cao hơn. Ở vi khuẩn, đoạn gắn ribosome (chuỗi Shine-Dalgarno, SD) được mô tả rất rõ, nhưng ở thực vật thì khác nhau và không thống nhất. Từ 75 đoạn DNA nhân của thực vật bậc cao được công bố, Joshi (1987) tìm thấy đoạn bảo thủ của bộ mã khởi đầu ATG là TAAACAATGGCT. Nucleotide thứ 3 (A) trước ATG có vai trò quan trọng nhất để gen biểu hiện mạnh sản phẩm protein (Kozak 1989). Hiệu suất dịch mã được tăng cường khi ghép thêm một đoạn dẫn đầu (leader sequence) không dịch mã của virus vào giữa promoter với đoạn mã hóa của gen (Gallie et al., 1987). Những đoạn intron được kết hợp với gen chuyển vào trong thực vật đã làm tăng mức độ biểu hiện của gen, mặc dù cơ chế của hiện tượng này cũng chưa được làm sáng tỏ (Lessard et al., 2002). Tanaka và đồng tác giả (1990), thông báo mức độ biểu hiện cao hơn 90 lần của gen gus trong cây lúa chuyển gen khi gắn thêm vào 7 gen gus đoạn intron của gen catalase tách chiết từ cây đậu trắng. Sự gia tăng biểu hiện đã gắn liền với gia tăng mật độ mRNA, nhưng hiện tượng này không xảy ra trong cây thuốc lá chuyển gen. Maas và đồng tác giả (1991) nghiên cứu tác động của exon 1 và intron 1 của gen shrunken-1 ở cây ngô lên biểu hiện tạm thời của gen CAT (chloramphenicol acetyltransferase) trong mô ngô và lúa chuyển gen. Kết quả cho thấy đoạn exon làm tăng mức độ biểu hiện 10 lần, đoạn intron làm tăng 100 lần, còn khi tổ hợp cả hai đoạn exon và intron vào giữa promoter 35S với gen CAT thì hiệu quả gia tăng 1.000 lần. Những intron có tác động không giống nhau khi chuyển vào cây một lá mầm và hai lá mầm, chứng tỏ rằng những cách thức thích hợp cho sự ghép nối giữa 2 loài khác nhau là rất khác nhau (Lessard et al., 2002). Trình tự dẫn đầu 5’ không dịch mã (5’ untranslated leader sequence, 5’ UTLS) trên mRNA của virus, chẳng hạn như đoạn omega (Ω) của virus khảm thuốc lá, đã được sử dụng để tăng mức độ biểu hiện của gen trong tế bào cây thuốc lá. 5’ UTLS được phân lập từ genome của cây hai lá mầm sẽ tăng mức độ biểu hiện của gen khi được chuyển vào cây hai lá mầm và 5’ULTs từ cây một lá mầm cũng tăng biểu hiện khi nó được chuyển vào cây một lá mầm (Lessard et al., 2002). Perlak và đồng tác giả (1991) khi nghiên cứu biểu hiện của hai gen Bt là CryIA(b) và CryIA(c) trên cây thuốc lá và cà chua chuyển gen nhận thấy chúng có mức độ biểu hiện rất yếu. Có ba vấn đề chính liên quan đó là bộ mã không thích hợp cho thực vật, chuỗi tín hiệu polyadenyl hóa không đúng chỗ và mRNA không bền vững. Cả ba vấn đề đều là hậu quả của một nguyên nhân: tỷ lệ AT cao. Bộ mã giàu AT thường có ở những gen độc tố, nhưng rất hiếm ở thực vật (ví dụ, TTA là mã của leucine). Vì thế, khi dịch mã một gen lạ giàu TTA, ở thực vật thường có hiện tượng ngừng lại trong bộ máy ribosome làm cho quá trình sinh tổng hợp protein bị kết thúc sớm. Hiện tượng này xảy ra với gen Bt vì trong đó có nhiều chuỗi ATTTA dạng tín hiệu polyadenyl hóa (Dean et al., 1986). Ngoài ra, chuỗi ATTTA còn có tính chất làm giảm độ bền vững của mRNA. Ohme-Takagi và đồng tác giả (1993) cho rằng trình tự giàu AT gây ra sự phân hủy nhanh mRNA trong thuốc lá. Nghiên cứu của DeRocher và đồng tác giả (1998) cũng đã chứng minh sự suy giảm nhanh mRNA mã hóa protein kháng côn trùng phân lập từ vi khuẩn chuyển vào thực vật là do gen chuyển vào giàu AT (Kang et al., 2003a). Promoter thường có cấu trúc khá đồng nhất cho phép nhận được mức độ biểu hiện gen khác nhau thông qua hoán vị và tái tổ hợp các vùng của một promoter. Điều này thể hiện rất rõ ở promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus 35S). Phần lớn nghiên cứu sử dụng promoter cơ bản từ virus như CaMV 35S đã tăng mức độ phiên mã cao nhất trong mô thực vật. Trong một số trường hợp, promoter có thể xóa bỏ hiệu ứng im lặng của gen do hiện tượng đồng ngăn chặn. Hoạt lực của promoter có thể được tăng cường khi bố trí hai hoặc nhiều promoter nối tiếp nhau (Lessard et al., 2002). Mỗi loại protein thực vật thường có vị trí hoạt động riêng, rất đặc trưng trong tế bào, phần lớn là trong tế bào chất. Các loại protein thường được sinh tổng hợp bởi ribosome tự do trong tế bào chất và có tín hiệu đặc biệt để giữ chúng ở đó. Nhiều loại protein được tổng hợp trong tế bào chất nhưng được chuyển vào lục lạp, ty thể hoặc nhân. Như vậy, phải có tín hiệu đặc biệt cho sự định hướng đó. Ngoài 8 ra, sự định hướng cũng có trong cơ quan tử, ví dụ như trong các thể hạt của lục lạp cũng đòi hỏi phải có đoạn tín hiệu. Tín hiệu hướng về lục lạp và ty thể thường nằm ở đầu N (amine) của chuỗi protein và mất đi khi protein thâm nhập vào trong cơ quan tử. Trình tự SEKDEL thường nằm đầu C (carboxyl) của protein trên mạng lưới nội sinh chất. Protein SEKDEL thực hiện các chức năng cần thiết liên quan đến sự lắp ráp và cuộn xoắn protein trong mạng lưới nội sinh chất, giúp tích lũy và ổn định protein (Lessard et al., 2002). Sự gia tăng đáng kể lượng protein tái tổ hợp có thể đạt được trong lục lạp chuyển gen, đặc biệt là trong thuốc lá. Vì tế bào lá chứa khoảng 100 lục lạp và một lạp thể chứa khoảng 100 bản sao DNA, nên có khoảng 10.000 bản sao trong một tế bào (Golds et al., 2004). Operon Bt cry2Aa2 đã được cải thiện mức độ biểu hiện trong lục lạp của cây thuốc lá lên 45,3% protein hòa tan tổng số (Kang et al., 2003b). Tregoning và đồng tác giả (2003) chuyển gen phòng bệnh uốn ván (TetC) vào lục lạp của cây thuốc lá đã tăng mức độ biểu hiện lên 25% protein hòa tan tổng số. Vì vậy, các lục lạp chuyển gen là các “nhà máy” lý tưởng cho việc sản xuất sinh khối protein và nó có thể ứng dụng để phát triển vaccine thực vật. Chuyển gen vào hệ gen lục lạp có nhiều thuận lợi hơn so với chuyển vào hệ gen nhân vì lục lạp có mặt trong hầu hết các loài thực vật. Bên cạnh đó, sự quản lý các cánh đồng thực vật chuyển gen vào lục lạp dễ dàng hơn so với cánh đồng thực vật chuyển gen vào hệ gen nhân do sự lai tạo không mong muốn qua đường thụ phấn sẽ không xảy ra. Sự im lặng gen thường xảy ra trong hệ gen nhân, không xảy ra trong hệ gen lục lạp nên những thực vật chuyển gen được ổn định qua nhiều thế hệ (Golds et al., 2004). Một trong những rủi ro khi chuyển nạp gen là hiện tượng im lặng của gen (gene silencing). Nhiều đặc điểm của DNA chuyển nạp bị phát hiện thông qua cơ chế tự bảo vệ của sinh vật, gây nên hiện tượng im lặng của gen chuyển nạp. Sự methyl hóa (methylation) là nguyên nhân chính, nhưng không phải là nguyên nhân duy nhất làm bất hoạt gen lạ xâm nhập vào genome. Phân tử DNA xâm nhập vào cơ thể làm thay đổi những cấu trúc vùng, gây bất hoạt một phần của locus nào đó, làm cho vùng dị nhiễm sắc đậm đặc hơn và làm cho gen trở nên im lặng. Nếu DNA lạ xâm nhập vào vùng giàu GC, hiện tượng phiên mã có thể dễ dàng xảy ra. Trong khi đó, nếu DNA này đi vào vùng khác nó sẽ không thể thực hiện được. Khi phân tử DNA lạ xâm nhập vào vùng giàu GC, nếu phân tử này cũng giàu GC, nó sẽ tiếp hợp và gắn ở đây một cách ổn định và được phiên mã. Nếu phân tử này giàu AT, hiện tượng im lặng gen sẽ xảy ra. Trường hợp nó xâm nhập vào vùng giàu AT, nó sẽ im lặng hoàn toàn cho dù nó chứa chuỗi mã giàu AT hay GC. Hiện tượng bắt cặp lệch vị trí cũng tham gia vào kết quả làm im lặng gen (Dorer, Henikoff 1997). 5. Triển vọng phát triển vaccine thực vật Sản xuất vaccine thực vật là một kế hoạch kết hợp sự đổi mới của y học và công nghệ sinh học chuyển gen ở cây trồng (Mason et al., 2002). Dùng thực vật để sản xuất vaccine là một giải pháp rất kinh tế và có nhiều triển vọng. Gần đây, sự tiến bộ về chuyển gen thực vật hứa hẹn đã giúp tăng mức độ biểu hiện của gen, tạo ra nhiều kháng nguyên để phát triển vaccine (Mason et al., 2002). 9 Vaccine thực vật được phát triển đầu tiên vào năm 1990, khi Curtiss và Cardineau tiến hành chuyển gen kháng nguyên độc tố bề mặt của Streptococcus mutans (SpaA) vào cây thuốc lá. Khi cho chuột ăn cây thuốc lá này, chất miễn dịch với SpaA đã được sinh ra trong cơ thể của chúng. Tiếp theo công trình trên là hàng loạt các thông báo về vaccine thực vật như vaccine phòng bệnh than, bệnh sởi, dịch tả, tiêu chảy do E. coli, viêm gan, uốn ván . Mason và đồng tác giả (1998), Lauterslager và đồng tác giả (2001) đã chuyển gen LTB phòng bệnh đường ruột do E. coli vào khoai tây, khi thử nghiệm trên động vật đã chứng minh được trong cơ thể đã sinh ra kháng thể trung hòa độc tố của E. coli. Năm 2004, Tacket và đồng tác giả đã chuyển gen kháng nguyên LTB tái tổ hợp vào các cây ngũ cốc để tạo ra vaccine cho con người. Tính khả thi của vaccine thực vật đã được chứng minh, 1 mg sản phẩm protein LTB trong cây ngũ cốc hòa với đệm cho động vật ăn thì có 78% động vật thí nghiệm tạo ra kháng thể IgG kháng lại bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra (trong huyết thanh), 44% phát triển kháng thể IgA. Kang và đồng tác giả (2004) đã cải thiện mức độ biểu hiện của gen kháng nguyên độc tố E. coli ở lục lạp cây thuốc lá bằng cách thay serine thành lysine tại điểm 63 trên tiểu phần A (LTK63), kết quả đã tăng lượng protein LTK63 ở lục lạp cây thuốc lá lên xấp xỉ 3,7% protein hòa tan tổng số. LTK63 trong tế bào cây thuốc lá có thể được sử dụng như một tá dược để phát triển thành vaccine phòng bệnh tiêu chảy. Nghiên cứu của Daniell và đồng tác giả (2001a), bằng cách lắp ráp những oligomer chức năng ở tế bào trần cây thuốc lá đã cải thiện mức độ biểu hiện của gen CTB lên 4,1% protein hòa tan tổng số. Kang và đồng tác giả (2003a) đã thiết kế lại cấu trúc gen CTB của vi khuẩn bằng cách tối ưu các bộ ba của gen CTB, vẫn giữ lại chuỗi mã hóa amino acid của gen tự nhiên ngoại trừ vị trí số 2, nghĩa là bộ ba ATT của isoleucine được thay thế bởi bộ ba GTG của valine. Đặt G ngay sau mã khởi đầu ATG và gắn thêm chuỗi Kozak vào đầu 5’ đã tăng hiệu quả dịch mã lên 10 lần (Kozak, 1989). Sự thay đổi này sẽ không biến đổi trình tự của gen CTB hoàn chỉnh được sản xuất trong tế bào thực vật, do peptide tín hiệu ở đầu tận cùng NH 2 đã được loại bỏ trong suốt quá trình sản xuất và hoàn thiện protein. Các chuỗi DNA có thể làm mất tính ổn định của RNA trong thực vật, như chuỗi tín hiệu polyadenyl AATAAA, được loại khỏi gen. Trình tự SEKDEL được gắn vào đầu 3' của khung đọc mở CTB. Kết quả đã tăng mức độ biểu hiện lên khoảng 1,5% protein hòa tan tổng số. Mason và đồng tác giả (1998) đã thiết kế, lắp ghép và tổng hợp lại gen LTB của vi khuẩn. Gen LTB mới có trình tự của gen LTB tự nhiên, ngoại trừ bộ mã thứ 2 được thay thế từ ATT mã hóa cho asparagine thành GTG mã hóa cho valine, nhằm cung cấp một vị trí NcoI xung quanh vị trí phiên mã. Viêm gan B là một bệnh truyền nhiễm mãn tính do virus viêm gan B gây ra. HBsAg (hepatitis B surface antigen) là protein kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B, khi hiện diện trong cơ thể nó sẽ kích thích hệ miễn dịch sinh kháng thể chống lại virus viêm gan B. Hiện nay, người ta đã sản xuất vaccine DNA tái tổ hợp HBsAg trong nấm men hoặc vi khuẩn, tuy nhiên việc thu vaccine theo phương pháp này rất tốn kém và công phu. Vì thế, một dạng vaccine mới đã ra đời đó là vaccine thực vật với giá thành rẻ được hướng đến phục vụ cho các nước nghèo, nơi mà dịch 10 bệnh viêm gan B đang bùng phát và lây lan mạnh (Kong et al., 2001). Mason và đồng tác giả (1992) lần đầu tiên đã chuyển gen kháng nguyên bề mặt viêm gan B vào cây thuốc lá. Kapusta và đồng tác giả (1999) cũng đã tạo ra cây đậu lupin và cây rau diếp có chứa kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg). Các thí nghiệm trên chuột sau đó cho thấy cơ thể đã có khả năng đáp ứng miễn dịch ở mức độ cao. Với những người tình nguyện đã ăn những cây rau diếp chuyển gen, trong máu cũng đã có phản ứng trả lời (Kapusta et al., 1999). Kong và đồng tác giả (2001) đã chuyển gen này vào lúa mì và khoai tây, chứng minh kháng nguyên được bảo vệ tốt trong tế bào thực vật, không làm mất khả năng miễn dịch khi vào trong ống tiêu hóa. Các tác giả cũng chứng minh được khi cho chuột ăn khoai tây chuyển gen HBsAg cơ thể của chúng đã đáp ứng miễn dịch sinh ra kháng thể ở phúc mạc và phát sinh ra những đáp ứng miễn dịch thứ cấp ở mức độ cao. Gao và đồng tác giả (2003) đã chuyển gen HBsAg vào cây cherry tomatillo (Physalis ixocarpa), và chứng minh được mức độ biểu hiện cao của protein HBsAg trong lá (300 ng/g mô tươi), trong quả (10 ng/g mô tươi) và thử nghiệm trên động vật cho kết quả khả quan. Ma và đồng tác giả (2003) đã tiến hành chuyển gen kháng bệnh viêm gan E (HEV) ORF2 vào cây cà chua để tạo vaccine phòng bệnh viêm gan E. Các tác giả đã chứng minh được mức độ biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp phòng bệnh viêm gan E là rất cao, trong quả đạt 61,22 ng/g mô tươi, trong lá khoảng 47,9-6,37 ng/g mô tươi. Attar và đồng tác giả (2004) cũng đã tạo ra cây thuốc lá chuyển gen chứa kháng nguyên bệnh viêm gan C (hepatitis C virus-HCV). Trước đây, Tregoning và đồng tác giả (2003) đã chuyển gen phòng bệnh uốn ván (TetC) vào thực vật, nhưng mức độ biểu hiện của protein kháng nguyên rất thấp. Sau đó, nhóm tác giả này đã sử dụng phương pháp mới, chuyển gen vào lục lạp của cây thuốc lá và đã tăng mức độ biểu hiện của protein kháng nguyên lên đến 25% protein hòa tan tổng số (Tregoning et al., 2004). Bệnh than là một bệnh nguy hiểm, là bệnh chung của người và động vật ăn cỏ, do vi khuẩn Bacillus anthracis gây ra. Khi người bị nhiễm bệnh, vi khuẩn sẽ phá hủy da, ruột và cơ quan hô hấp. Vi khuẩn than có ba protein ngoại độc tố: kháng nguyên bảo vệ (PA, 83 kDa), yếu tố gây chết (LF, 90 kDa) và yếu tố gây phù (EF, 89 kDa). Dựa vào những đặc điểm này, Aziz và đồng tác giả (2002) đã chuyển gen kháng nguyên PA vào trong hệ gen nhân của cây thuốc lá. Kim và đồng tác giả (2003), đã tạo dòng cDNA -amyloid từ những người bị bệnh Alzheimer sau đó được chuyển vào khoai tây và chúng tổng hợp nên những protein kháng nguyên mã hóa từ gen -amyloid. Khandelwal và đồng tác giả (2003), đã sản xuất ra hemagglutinin protein trong cây thuốc lá để sản xuất loại vaccine phòng bệnh do virus rinderpest gây ra ở gia súc, vaccine này đã được thử nghiệm trên chuột cho đáp ứng miễn dịch cao. Bệnh sởi là căn bệnh truyền nhiễm do virus, nguyên nhân chính là do sự lây lan của Paramyxovirus trong không khí. Gần đây, các nhà khoa học đã tạo ra protein kháng nguyên bệnh sởi trong cây thuốc lá, khoai tây, lúa, rau diếp, chuối và cà rốt (Tripurani et al., 2003). Các thí nghiệm kiểm tra huyết thanh lấy từ các loại động vật ăn cây chuối chuyển gen cho thấy trong huyết thanh của chúng có chứa các kháng nguyên hemagglutinin protein . 2 các vaccine phòng bệnh cho người và động vật. Vaccine thực vật (plant- based vaccine) hay vaccine thực phẩm (edible vaccine) là một. immunization with an oral plant- derived measles virus vaccine. J Virol 76: 7910-7912. Plant- based vaccine New generation vaccine with potential