Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGUYỄN THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ VI KHUẨN QUANH NẤM MỤC TRẮNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE VÀ KHAI THÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM NGUYỄN THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ VI KHUẨN QUANH NẤM MỤC TRẮNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE VÀ KHAI THÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 Xác nhận Học viện Khoa học Công nghệ Thầy hướng dẫn Thầy hướng dẫn GS.TS Trương Nam Hải TS Lê Thị Thu Hồng Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực chủ yếu cá nhân cộng sự hướng dẫn khoa học GS.TS Trương Nam Hải TS Lê Thị Thu Hồng Phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu kết luận án hoàn toàn trung thực Một phần lớn kết cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với cho phép đồng tác giả, phần chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2023 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Bình LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải TS Lê Thị Thu Hồng, Phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam dành nhiều thời gian tâm huyết để định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán đào tạo Khoa Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam hướng dẫn, bảo cho kiến thức, kỹ cần thiết tạo điều kiện thuận lợi cho học tập bảo vệ luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cán phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ, hướng dẫn nghiên cứu tạo điều kiện sở vật chất để hồn thiện thực nghiệm nghiên cứu Tơi xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Tự nhiên công nghệ, trường Đại học Thủ đô Hà Nội giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2023 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Bình MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN vi DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN .ix DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN ÁN x MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 3 Đối tượng nghiên cứu .3 Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đóng góp đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung lignocellulose 1.1.1 Cellulose 1.1.2 Hemicellulose 1.1.3 Lignin .9 1.2 Cellulase .9 1.2.1 Khái quát chung cellulase .9 1.2.2 Phân loại cellulase 12 1.2.3 Cấu trúc chế xúc tác cellulase 15 1.2.4 Ứng dụng cellulase 19 1.2.5 Tình hình nghiên cứu khai thác gen mã hóa cellulase giới Việt Nam.19 1.3 Nấm mục trắng khu hệ vi sinh vật xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân lignocellulose .22 1.3.1 Nấm mục trắng 22 1.3.2 Tương tác nấm mục trắng khu hệ vi sinh vật xung quanh nấm mục trắng…… .23 1.4 Metagenomic số công cụ tin sinh, sở liệu sử dụng khai thác DNA đa hệ gen 25 1.4.1 Các phương pháp khai thác gen metagenomics 26 1.4.2 Một số công cụ tin sinh để khai thác liệu DNA đa hệ gen 28 1.4.3 Một số sở liệu .33 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 Vật liệu, hóa chất .36 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 36 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36 2.1.3 Các chủng vi sinh vật, plasmid cặp mồi sử dụng nghiên cứu 36 2.1.4 Hóa chất thiết bị 37 2.1.5 Môi trường nuôi cấy số dung dịch sử dụng 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Các phương pháp vi sinh sinh học phân tử 39 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh protein 42 2.2.3 Các phương pháp tin sinh học 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn đất quanh khu nấm mục trắng 53 3.1.1 Tách chiết, tinh DNA đa hệ gen vi sinh vật đất .53 3.1.2 Kết giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật đất 55 3.1.3 Phân tích đa dạng vi sinh vật đất quanh khu nấm mục trắng .55 3.2 Nghiên cứu khai thác gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân lignocellulose.60 3.2.1 Dự đoán chức DNA đa hệ gen hệ vi khuẩn đất 60 3.2.2 Khai thác gen mã hóa lignocellulase dựa kết giải chức KEGG 61 3.2.3 Khai thác gen mã hóa lignocellulase dựa mơ hình HMM .64 3.2.4 Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mang gen mã hóa lignocellulase 65 3.3 Nghiên cứu khai thác lựa chọn gen tiềm mã hóa cellulase .68 3.3.1 Phân tích vùng chức cellulase 68 3.3.2 Dự đoán mức độ biểu gen mã hóa cellulase 73 3.3.3 Nghiên cứu lựa chọn gen mã hóa cellulase .76 3.4 Biểu hiện, tinh chế nghiên cứu tính chất protein GH3S2 80 3.4.1 Nghiên cứu biểu gen gh3s2 80 3.4.2 Tinh chế protein tái tổ hợp GH3S2 cột sắc ký lực 92 3.4.3 Nghiên cứu tính chất protein tái tổ hợp GH3S2 95 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate ARDB Antibiotic Resistance Genes Cơ sở liệu gen kháng Database thuốc kháng sinh BLAST Basic Alignment Công cụ so sánh mức độ Local tương Search Tools đồng trình tự nucleotide/axit amin bp Base pair Cặp base CAZY Carbohydrate-Active enZYmes Cơ sở liệu enzyme tham gia chuyển hóa carbohydrate CBD Carbohydrate-binding Vùng liên kết carbohydrate domain CBH Cellobiohydrolases Cellobiohydrolases CBM Carbohydrate-binding Vùng/cấu vùng/cấu trúc carbohydrate CD Catalytic Domain Vùng xúc tác CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose COG Cluster trúc liên kết Orthologous Cơ sở liệu protein sinh of groups vật nhân sơ/nhân chuẩn đơn bào CSDL Cơ sở liệu EC The Enzyme Commission Hội đồng enzyme EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid eggNOG Evolutionary genes: genalogy of Cơ sở liệu chứa nhóm Non-supervised Orthologous Orthologous Groups Expasy Expert System Protein Analysis Hệ thống Phân tích protein chuyên sâu Gb Gigabyte Gigabyte GH Glycoside hydrolase Emzyme thủy phân liên kết glycosidic GO Gene Ontology Bản thể gen học His Histidine Axit amin histidine HMM Hidden Markov models Mô hình đại diện Markov ẩn HTS High Giải trình tự thông lượng cao Throughput Sequencing IPTG KEGG Km Isopropyl-β-D- Isopropyl-β-D- thiogalactosidase thiogalactosidase Kyoto Encyclopedia of Cơ sở liệu hệ gen hệ Genes and Genomes gen Kyoto The Michaelis constant Hằng số Michaelis biểu thị nồng độ chất cho phép enzym đạt nửa Vmax KOG Eukaryotic Orthologous groups Cơ sở liệu từ hệ gen sinh vật nhân chuẩn (ba loài động vật, loài thực vật, Arabidosis thaliana, loài nấm ký sinh trùng nội bào) LBA Luria-Betani Ampicillin Môi trường ni cấy LB có bổ sung ampicillin LCA Least Common Ancestor Ít tổ tiên chung MCS Multi-cloning site Vùng đa nối MEGAN MEtaGenomic Analyser Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gen NCBI NR National Center for Trung tâm thông tin Công Biotechnology Information nghệ Sinh học Quốc gia Non-redundant Không dư thừa NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen hệ OD Optimal density Mật độ quang học ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PBS Phosphate buffer Đệm phosphate PERISCOPE Periplasmic expression Phần mềm ước đoán mức độ classifier for soluble protein biểu protein dạng hòa expression tan khoang chu chất PFAM Protein Family Cơ sở liệu họ protein pNP p-NitroPhenol p-NitroPhenol pNPG p-NitroPhenol-β-Glucoside p-NitroPhenol-β-Glucoside PHYRE Protein Homology/analogY Protein tương đồng/tương tự Recognition Engine SDS Sodium dodecyl sulphate SIB Swiss SVM Institute Sodium dodecyl sulphate of Viện nghiên cứu Tin sinh Bioinformatics học Thụy Sỹ Support Vector Machine Vector hỗ trợ phân tích tự động SWISS-PROT Swiss Protein Dữ liệu trình tự xác định chức qua thực nghiệm TBI Taiwan Bioinformatic Viện nghiên cứu Tin sinh Institue học Đài Loan TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine Tm Temperature melting Nhiệt độ nóng chảy Vmax The maximum velocity Tốc độ phản ứng tối đa đạt enzyme bão hòa với chất