0288 structural characterization of animal adenovirus fibre heads luận văn tốt nghiệp

VIỆNHÀNLÂMKHOA HỌC VÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆN CÔNGNGHỆSINHHỌC NGUYỄNHỒNG THANH STRUCTURAL CHARACTERIZATION OFANIMALADENOVIRUSFIBRE HEADS Chunngành: Hóasinh họcMãsố :62 4201 16 TĨM TẮTLUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC HÀNỘI -2016 CơngtrìnhđƣợcthựchiệntạiTrungtâmcơngnghệsinhhọcHộiđồng nghiêncứuQuốcgiaTâyBanNha (CNB-CSIC, Madrid, Spain)& ViệnCơng nghệ sinhhọc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam(IBT-VAST,Hanoi,Vietnam) Ngườihướngdẫnkhoahọc: GS.TS.TrƣơngNamHải ViệnCôngnghệsinhhọc,IBT-VAST TS.MarkJohan vanRaaij CentroNacionaldeBiotecnologia,CNB-CSIC Phảnbiện1: PGS.TS.BùiPhƣơngThuận TrƣờngĐHKhoahọctựnhiên,HàNội Phảnbiện2: PGS.TS.TrƣơngQuốcPhong TrƣờngĐHBáchkhoa,HàNội Phảnbiện3: TS.Chu Nhật Huy ViệnCơngnghệsinhhọc LuậnánđƣợcbảovệtạiHộiđồngchấmluậnánphiênchínhthức tạiViệnCơng nghệsinhhọc Vàohồi ,ngày tháng năm2016 Có thểtìmluậnántại: - ThƣviệnQuốcgiaViệtNam - ThƣviệnViệnCơngnghệsinhhọc - TrangwebcủaBộGD&ĐT MỞĐẦU Tínhcấpthiếtcủađềtài Adenovirus đƣợc biết đến nhƣ vector hữu hiệu việc chuyểngen dùng liệu pháp gen Adenovirus xâm nhập vào tế bào vật chủ thông quavùnggắnđặchiệunằmtrênđỉnhcủacácproteinsợi(fibreprotein).Vùngnàynhận biết thụ thể nằm màng tế bào vật chủ, giúp adenovirus nhận dạng vàxâmnhiễmvàotếbàovậtchủthôngqua chếnhậpbào (endocytosis) Cấu trúccủa protein sợi adenovirus đƣợc công bố, nhiên, hầu hết cácadenoviruslâynhiễmtrênngƣờithuộcchiMastadenovirus Các vector có nguồn gốc adenovirus thƣờng đƣợc nghiên cứu phát triểndựatrênhệgiencủaadenovirustype5lâynhiễmtrênngƣời(thuộcchiMastadenovi rus) Một số đƣợc nghiên cứu dựa hệ gien ovine adenovirus7 (Hofmann 1999; Kümin 2002; Both 2004) Tuy nhiên, hiệu sử dụng cácvectorcónguồngốctừadenoviruslâynhiễmtrênngƣờibộclộcáchạnchếnhƣ: 1) Khơng vƣợt qua đƣợc hàng rào miễn dịch thể vật chủ (Daya 2008;Brunetti-Pierri 2013; Wold 2013); 2) Các vector thƣờng có xu hƣớng tậptrungtạicáctếbàogansaukhiđƣợcđƣavàocơthểvậtchủdotínháilựccaovớicoxsackie adenovirusreceptor(CAR)(Douglas2007).Dovậy,việcnghiêncứucấu trúc protein sợi adenovirus lây nhiễm động vật với vùng gắnđặc hiệu yếu tố quan trọng để hiểu rõ khác biệt chế xâm nhập cácadenovirus lây nhiễm ngƣời động vật Các nghiên cứu sở choviệc thiết kết vector chuyển gen phù hợp với mục đích điều trị bệnhhiểm nghèo liệu pháp gen Do thực đề tài: “Structuralcharacterization ofanimaladenovirusfibre heads” (têntiếngViệt:N g h i ê n cứu cấu trúc protein sợi đầu mútcủacácadenoviruslâynhiễmtrênđộngvật) Mụctiêunghiêncứu Để thực đề tài này, xác định mục tiêu theo từngcơng đoạn q trình nghiên cứu từ tách dòng, biểu tinh chế protein tớitạotinhthể,xácđịnhcấutrúcvàbƣớcđầusànglọccácthụthểtiềmnăng Cácmụctiêuchínhcủaluậnángồmcó: 1) Biểuhiệnvàtinhchếcácproteinsợiđầumútcủamộtsốlồiadenoviruslâynhiễmtrê nmộtsốđộngvậtkhácnhaunhƣchimsănmồi(raptoradenovirus),bị(bovinead enovirus),thằnlằn(lizardadenovirus)vàngỗng(gooseadenovirus) 2) Tạotinhthểcủacácproteinsợiđầumútcủacáclồiadenoviruskhácnhauvàxácđịnhcấu trúcbằngcácphƣơngphápphùhợpnhƣthaythếphântử(molecular replacement) phƣơng pháp single isomorphousreplacement(SIR)vàsingleanomalousdispersion(SAD) 3) Xácđịnhcácthụthểtiềmnăngcóliênquanđếnqtrìnhnhậndạngvàxâmnhậpcủa adenovirusvàocáctếbàovậtchủbằngkỹthuậtglycan-array Nộidungnghiêncứu Để thực đƣợc mục tiêu nêu trên, cơng việc cụ thể đƣợc tiếnhànhgồmcó: 1) Thiết kế plasmid mang vùng gen mã hóa cho protein sợi đầu mút (fibrehead) số loài adenovirus khác nhƣ raptor adenovirus, bovineadenovirus,lizardadenovirusvàgooseadenovirus 2) BiểuhiệnproteintronghệbiểuhiệnE.colivàtinhchếproteinquahaibƣớcgồmsắckýá ilựcHis-tagvàsắckýtraođổiion 3) XácđịnhđộđồngnhấtvàtínhbềnnhiệtcủacácproteinsautinhchếbằngkỹthuậtThermoFluor 4) Tạo tinh thể protein sử dụng điều kiện kết tinh khác nhằm tạo ratinhthểcóchấtlƣợngcaodùngchonhiễuxạtiaX 5) Giảicấutrúcvàtinhchỉnhcấutrúcproteinsợiđầumútcủacácadenovirusởdạngđơnlẻh oặcdạnggắnvớicácchấtgắn(ligand)đặchiệu 6) Sosánhsựkhácbiệtvềcấutrúcgiữacácproteinsợiđầumútcủaadenoviruslâynhiễmtrê nngƣờivàchođộngvậtnhằmtìmcácvịtrítƣơngtácđặchiệunằmtrênvùnggắn 7) Xác định thụ thể tiềm tham gia vào trình gắn đặc hiệu vớiprotein sợi đầu mút kỹ thuật glycan-array kỹ thuật vật lý – hóasinhkhác Ýnghĩakhoahọcvàthựctiễn Tạithờiđiểmtiếnhànhnghiêncứunày,chỉcóduynhất02cấutrúcproteinsợiđầumút củacácadenoviruslâynhiễmtrênđộngvậtđƣợccơngbốtrêntổngsố18cấutrúc protein sợi đầu mút adenovirus ngân hàng liệu cấu trúc protein(proteindatabank).Nghiêncứunàycóýnghĩarấtquantrọngtrongviệcxácđịnhcấutrúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật Việc sửdụngcácvectorchuyểngencónguồngốctừadenoviruslâynhiễmtrênngƣời(chủyếulàaden ovirustíp5)cịngặpnhiềuhạnchếdogặpphảihàngràomiễndịchcủangƣời tính khơng đặc hiệu tế bào đích Do đó, việc nghiên cứu sử dụng cácadenoviruslâynhiễmđộngvậtlàmvectorchuyểngenchongƣờiđƣợcxemnhƣlàmộtgiảipháp thaythếđầytriểnvọng.Cácvectornàysửdụngproteinsợiđầumútchoviệcnhậndạngtếbàovàtƣơngtácvớithụthể.Dovậy,nghiên cứucấutrúcprotein sợi đầu mút adenovirus có tác dụng tìm chế tƣơng tác củaproteinsợivớithụthể,từđóxácđịnhđƣợccácaxitaminthamgiatƣơngtácvớithụthể.N hữngthơngtinnàychophépcácnhàkhoahọc,bằngđộtbiếnđiểm,cóthểthayđổitrìnhtựaxita mintạivùngproteinsợiđầumútnhằmđịnhhƣớngvectorgắnvàocáctếbàođíchmongmuốn.Lu ậnánđãxácđịnhthànhcơngbốncấutrúcproteinsợiđầumútcủamộtsốlồiadenoviruslâyn hiễmtrênđộngvậtvàxácđịnhđƣơcmộtsốpolysaccharides tiềm tƣơng tác với protein sợi đầu mút adenovirus lâynhiễmtrênngỗng.Cáckếtquảnàycóýnghĩakhoahọcvàthựctiễncao,gópphầnvàoviệcb ổsungcácthơngtincấutrúcchoqtrìnhnghiêncứuvàpháttriểncácthếhệvectorchuyểngen mớidùngtrongliệuphápgen Đónggópmớicủaluậnán Luậnánđãthànhcơngtrongviệcxácđịnhcấutrúcproteinsợiđầumútcủamộtsốadeno viruslâynhiễmtrênđộngvật.Cụthể,genmãhóachoproteinsợiđầumútcủamộtsốlồiadeoviru sđãđƣợctáchdịngvàbiểuhiệnthànhcơngdạngtantrongmộtsốchủngE.colikhácnhau.Protein đãđƣợctinhchếthànhcơngquahaibƣớctinhchế,nhằmthuđƣợcproteincóđộsạchvàđộđồn gnhấtcao.Proteinsợiđầumútđãđƣợckếttinhtrongcácđiềukiệnkhácnhau,tạonêncáctinhthểcóch ấtlƣợngcaodùngchophântíchnhiễuxạtiaX.Bốncấutrúcproteinsợiđầumútđƣợcgiảivàtin hchỉnhvớiđộphângiảicao(1.2–2.0Å).Haitrongbốncấutrúcđãđƣợccơngbốtrêntạpchí Virology Journal chun virus đƣợc lƣu trữ ngân hàng liệu cấu trúcprotein(PDB).Cáccấutrúccịnlạicũngsẽđƣợcđăngtrêncáctạpchíchunngànhuytí nvàđƣợcbổsungtrênngânhàngdữliệuprotein.Qtrìnhsànglọcthụthểtiềmnăng kỹ thuật glycan-array cho thấy, protein sợi đầu mút adenovirus lâynhiễmtrênngỗng(gooseadenovirusfibrehead)cókhảnănggắnvớimộtsốloạiđƣờngxuấthiệntrê nbềmặtcáctếbàoungthƣvàkhốiu.Đâylàkếtquảmới,chƣatừngđƣợccơngbốvàrấtcógiátrịvềmặtth ựctiễnđốivớiviệcnghiêncứupháttriểnhệvectorchuyểngendựatrênadenoviruscónguồngốcđ ộngvật Cấutrúccủaluậnán Luận án gồm 150 trang, đƣợc chia thành phần: Mở đầu (02 trang);Chƣơng1:Tổngquantàiliệu(29trang);Chƣơng2:Vậtliệuvàphƣơngpháp(25trang) ; Chƣơng 3: Kết nghiên cứu (57 trang); Chƣơng 4: Thảo luận (13trang); Kết luận kiến nghị (02 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đếnluậnán(01trang);Tómtắt(7trang);Tàiliệuthamkhảo(14trang).Luậnánc ó52hìnhvà12 bảng sốliệu Chƣơng1 TỔNGQUANTÀILIỆU 1.1 Adenovirus Adenovirus đƣợc phân lập lần Wallace Rowe vào năm 1953 từdịchmơitrƣờngnicấymơhạchhạnhnhân(adenoid)củangƣời.Adenoviruscónguồn gốc từ tên tiếng anh adenoid mang ý nghĩa vùng vòm họng đƣợc đề xuấtbởi Joseph A Bell vào năm 1956 Adenovirus thuộc họAdenoviridaegồm chi:Mastadenovirus,Atadenovirus,Siadenovirus,Aviadenovirus,Ichtadenovirus, cókhả xâm nhiễm vào tất lớp động vật có xƣơng sống gồm cá, lƣỡng cƣ,bịsát,chimvàthú.Khixâmnhiễmvàocơthểconngƣời,adenovirusthƣờnggâyra triệu chứngởđƣờnghơhấptrênbaogồmcáctriệuchứngnhƣviêmmàngkết, viêm amidan, viêm tai, viêm bạch hầu, viêm quản mà chủ yếu xuấthiệnđồng thờicảhaitriệu chứnglàviêmmàng kếtvàviêmamidan Hình 1.1: Sơ đồ phân loại chi adenovirus thuộc họAdenoviridae.Adenovirus xâm nhập vào tế bào vật chủ khơng tích hợp vào genome tếbào vật chủ chép độc lập nhân tế bào vật chủ nhƣ thực thểbổ sung Do khơng có nguy gây hại mặt di truyền cho tế bào vật chủ.Chính điều mà adenovirus đƣợc quan tâm nghiên cứu sử dụng nhƣ mộtvectorchuyển gen liệu phápgen 1.2 Cấutrúcproteinsợicủaadenovirus Protein sợi (fibre) dạng tam phân (trimer), đơn phân đƣợc cấu tạogồm3 v ù n g ( d o m a i n ) r i ê n g b i ệ t : p e n t o n b a s e b i n d i n g d o m a i n : l v ù n g t r ì n h t ự đầu N protein sợi, làm nhiệm vụ gắn với penton góc hìnhkhốicapsid; prote in sợiđầumút:làvùngtrìnhtựđầu C,cấut rúc códạnghì nhcầuvớicácvịtrígắnđặchiệuvớicácthụthểnằmtrênmàngtếbàođích;vàvùngfibreshaft:làvùngliênkếthaivùnggắnpentonbase với protein sợi đầu mút.proteins ợ i đ ầ u m ú t l p h ầ n c ấ u t r ú c q u a n t r ọ n g n h ấ t b i n ó t h a m g i a v o q u trìnhnhậnbiếtbởicácthụthểtrênmàngtếbàotrƣớckhixâmnhiễmvàotếbàovật chủ thơng qua việc tƣơng tác protein sợi đầu mút với thụ thể trênbềmặttếbào.Dovậy,việcnghiêncứucấutrúc vùngproteinsợiđầumútlàrấtquantrọng Hình1.2:Mơhìnhcấutrúccủaadenovirus (A)Vỏcapsidđƣợccấutạobởimộthình20mặt(icosahedra).Cácproteinsợi(fibreprotein)gắnt ừcácđỉnhcủacapsid (B)Proteinsợiđƣợccấutạobởi3domainriêngbiệt:vùnggắnvớipentontạiđầuN,vùngtƣơngtá cvớithụthểtạiđầuCvàvùngfibreshaftlàmnhiệmvụliênkếtvùngđầuNvàđầuC 1.3 Ứngdụngcủaadenovirustrongliệuphápgen Adenovirusđƣợcsửdụngphổbiếnnhƣlàmộtvectorhữuhiệutrongviệcchuyểngenvớic ácđặcđiểmnổitrộinhƣkhơngtíchhợpvàogenomecủatếbàovậtchủ,tựsaochépmộtcáchđộclậptro ngnhâncủatếbàovậtchủ,dođókhơnggâynguyhạivềmặtditruyền.Adenovirusthuộcloạivi ruskhơngcómàngbọcvớigenomecóbảnchấtlàmộtsợiADNképvớikíchthƣớckhoảng35kb,t rongđó30kbcóthểđƣợcthaythếbởicácđoạnADNngoạilaiphụcvụchomụcđíchchuyểngentro ngliệuphápgen 1.4 Tinhthểhóaproteinvàxácđịnh cấutrúc Kỹ thuật nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) mở hƣớng nghiên cứuđầytiềmnăngtrongcáclĩnhvựcnghiêncứukhácnhaunhƣsinhhọccấutrúc,hóasinh,khoah ọcvậtliệu,yhọcphântử,nghiêncứuvàpháttriểnthuốc.Tinhthểhóaproteinlàbƣớctiênquyếttro ngviệcxácđịnhcấutrúcbằngkỹthuậtnhiễuxạtiaX.Ngunlýcủaqtrìnhtinhthểhóaprotein đƣợchiểuđơngiảnlàviệckếttủathuậnnghịchcủacácphântửproteinkhitồntạiởtrạngtháicónồngđộvàđộđồng nhấtcao Các phân tử protein dung dịch kết tinh kỹ thuật khuyếch tánkhơngkhí(vapourdiffusiontechnique)nhằmđƣanồngđộproteintrongcácgiếngđạttớitrạng tháibãohịa.Tạitrạngtháinày,mộtsốđiểmnucleationđƣợchìnhthành protein tập trung với nồng độ cao Các phân tử protein xung quanh đƣợcsắpxếpvàlắprápvàotinhthểtheomộttrậttựnhấtđịnh(spacegroup),tạonêncáctinhthểhì nhkhối3chiềuvớiđƣờngkínhkhoảngvàichụctớivàitrămmicromet Hình 1.3: Qui trình xác định cấu trúc phân tử protein.Bắt đầu từbiểu tinh chế protein, kết tinh protein, phân tích tinh thể nhiễu xạ tiaX,thu thậpsố liệu,xử lý số liệu,xácđịnhvàtinhchỉnh cấutrúc Cấu trúc không gian phân tử protein đƣợc xác định dựa vào việccác kỹ thuật nhƣ thay phân tử (molecular replacement) phân tửproteincóđộtƣơngđồngcaovớicấutrúcđãbiết,hoặckỹthuậtsingleisomorphous replacement (SIR) hay single anomalous dispersion (SAD) sử dụngtín hiệu khác biệt từ nhiễu xạ nguyên tử kim loại nặng Qui trình từtinh chế protein tới kết tinh, nhiễu xạ tia X, xác định tinh chỉnh cấu trúc, phântíchcấutrúcđƣợcthểhiệntronghình 1.3 1.5 Ýnghĩa việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút cácadenoviruslây nhiễmtrên động vật Cấu trúc protein sợi đầu mút đƣợc nghiên cứu rộng rãi, hầu hếtthuộc adenovirus thuộc chiMastadenoviruslây nhiễm ngƣời mộtsốđộngvật.Tạithờiđiểmbắtđầuthựchiệnnghiêncứu,có16cấutrúcprote insợiđầumútcủamastadenovirusvàchỉduynhất02cấutrúcproteinsợiđầumútcủa adenovirus lây nhiễm động vật đƣợc công bố ngân hàng liệuprotein Do việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenoviruslây nhiễm động vật cung cấp thông tin chi tiết cấu trúc sốloài adenovirus lây nhiễm động vật Tạo điều kiện cho việc so sánh với cáccấutrúcđãbiếtnhằmchỉracácvùngquyếtđịnhlênviệctƣơngtácvớithụth ể màng tế bào Việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút với vùng gắnđặc hiệu yếu tố quan trọng để hiểu rõ khác biệt chế xâm nhập cácadenovirus lây nhiễm động vật Nguồn liệu cấu trúc protein sợi đầumút tiền đề cho việc nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen địnhhƣớngtếbàođích Chƣơng2 VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệunghiêncứu Các hóa chất vật liệu dùng sinh học phân tử đƣợc sử dụng cáchãng uy tín giới nhƣ Sigma-Aldrich (Missouri, USA), Merck (NewJersey, USA) hay VWR (Pennsylvania, USA) Protein đƣợc tinh chế sắc kýáilực kim loạisửdụngchấtgiá Ni-NTAcủa hãngJena Biosciences(Jena,Germany) Tinh chế lần hai đƣợc tiến hành sắc ký trao đổi ion sử dụng cộttrao đổi ion dƣơng Resource S6 cột trao đổi ion âm Resource Q6 hãngGE-Healthcare (Madrid, Spain) Quá trình kết tinh protein sử dụng kit củahãng Jena Biosciences, Sigma-Aldrich, and Molecular Dimensions (Newmarket,Suffolk,UK) 2.2 Phƣơngphápnghiêncứu 2.2.1 Biểu hiện, tinh chế tạo tinh thể protein sợi đầu mút số loạiadenovirus Các đoạn DNA mã hóa cho protein sợi đầu mút đƣợc tách dịng trongplasmidpET28a(+).Proteinđƣợcbiểuhiệncácvùngproteinsợiởdạngtantronghệbi ểuhiệnE.coli,vàđƣợclàmsạchbằngquitrìnhtinhchếgồmhaibƣớc:tinhchếbằngcộtsắckýái lựckimloạivàtinhchếquacộtsắckýtraođổiion.Proteinsạchđƣợccơđặctớinồngđộthíchhợptừ10-20 mg/ml cột Unicorn, Millipore.ProteinđãcơđặcđƣợcsửdụngchoqtrìnhkếttinhtrênđĩaMRCSwissci96giếngởn hiệtđộ4hoặc21ºCsửdụngcácbộkitthƣơngmạicủacáchãngcungcấpuytín(SigmaAldrich,JenaBiosciences,EmeraldBioSystems).Cáctinhthểproteinđƣợcthunhậnvàphântíchbằngph ƣơngphápnhiễuxạX-ray(X- 3.1.3 Cấutrúcproteinsợiđầumútcủaraptoradenovirus1 Cấutrúcvùngproteinsợiđầumútcủaraptoradenovirus,thuộcchiSiadenovirus,đãđƣợ cxácđịnhbằngphƣơngphápthaythếphântử(molecularreplacement)sửdụngcấutrúcproteinsợiđ ầumútcủaturkeyadenoviruslàmcấutrúckhn.Vớitỉlệgiốnghệtvềtrìnhtựgiữaproteinsợi đầumútcủaraptoradenovirusvàturkeyadenoviruslà19%,việcxácđịnhcấutrúcdựatrênphƣ ơngphápthaythếphântửlàrấtkhókhăn.Tuynhiên,docấuhìnhkhơnggianvàcấutrúctổngthể proteinsợiđầumútcủaraptorvàturkeyadenoviruslàkhágiốngnhau,dovậyphƣơngphápthayth ếphântửđãđƣợcsử dụng thành cơng để xác định cấu trúc vùng protein sợi đầu mút raptoradenovirus.Cấutrúcnàyđƣợcxácđịnhởdạngtamphân(trimer)vớisựthamgialiênkếtcủ acácphiếnbeta-hairpinởcácđơnphân(monomer)nàyvớivùngHIloopcủađơnphânliềnkềnhƣđãmơtảtronghình3.3B.Đâylàmộtđặcđiểmmớichƣatừngđƣợccơ ngbốđốivớicấutrúccủacácproteinsợicủaadenovirus Hình 3.3: Cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus 1.(A) Cấutrúcdạng“propeller”với2phiếnbeta-sheetképABCJvàGHID.ĐầuNvàđầuCđƣợcđánhdấubởiNtvàCt.Vùngbetahairpin(axitamin359-373)đƣợcđánhdấu dấu (*) (B)Tƣơng tác đơn phân hình thành nên tam phân (C)Bềmặttíchđiệncủaproteinsợiđầumútđƣợcdựđốnbaogồmcácvùngtíchđiện âm (đỏ) vùng tích điện dƣơng (xanh nƣớc biển) (D) Tƣơng tác bềmặtgiữacácđơnphân Để nghiên cứu ảnh hƣởng vùng beta-hairpin việc hình thànhcấutrúckhơnggia nở dạngta m phân,độtbiế nmấtđoạ n đƣợctiếnhành nhằm loạibỏvùngbeta-hairpinkhỏicấutrúccủaproteinsợiđầumút.Tuynhiên,kếtquả phân tích cấu trúc cho thấy, khơng có khác biệt cấu trúc proteinbanđầuvàproteinđãđộtbiến mấtđoạn beta-hairpin (Hình3.4) Hình 3.4: So sánh cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus 1dạngnative(màuxanhlácây)vàdạngđộtbiếnmấtđoạnbeta-hairpin(màutím).Cấutrúc đƣợc so sánh dạng đơn phân (A) tam phân (B) Đầu N đầu C củaprotein sợiđƣợcđánh dấubởiNtvàCttronghìnhA 3.1.4 KếtquảxácđịnhđộbềnnhiệtproteinsợiđầumútcủaRAdV-1 Để nghiên cứu ảnh hƣởng vùng beta-hairpin việc hình thànhcấutrúckhơnggian dạngtam phân,độtbiế nmấtđoạ nđƣ ợc tiếnhành nhằm loạibỏvùngbeta-hairpinkhỏicấutrúccủaproteinsợiđầumút.Kếtquảxácđịnhđộ bền protein phƣơng pháp biến tính nhiệt (Thermo-Fluor) cho thấyprotein đột biến đoạn beta-hairpin (đƣờng vạch đứt) có nhiệt độ nóng chảythấp so với protein dạng native (đƣờng vạch liền) (Hình 3.5A) Trong thínghiệm này, hai protein dạng đột biến đoạn beta-hairpin dạng nativeđƣợc kiểm tra độ bền nhiệt dải nhiệt độ từ 4-95ºC với tham gia chấtphát huỳnh quang SYPROOrange Tại 95ºC, protein sợi đầu mút dạng đột biếnmất đoạn beta-hairpin có xuất đỉnh phát huỳnh quang tƣơng ứng với thờiđiểm protein bị biến tính nhiệt độ 95ºC Tuy nhiên, khơng xuất ở95ºCtrongtrƣờnghợpcủaproteindạngtựnhiên đỉnh pháthuỳnhquang Hình3.5:Nghiêncứutínhbềnnhiệtcủaproteinsợicủaraptoradenovirus1 (A) Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thể tính bền nhiệt protein sợi đầu mútcủa raptor adenovirus dạng tự nhiên (nét vạch liền) dạng đột biến đoạnbeta-hairpin(nétvạchđứt) (B)Kếtquả điệndikiểm tra trêngelbiếntínhpolyacrylamide 12% proteinsợi đầu mútdạngtựnhiên(đƣờngc h y 1) v proteinđộtbiếnmấtđoạnbetahairpin(đƣờngchạy2) Protein biến tính dạng tự nhiên đƣợc điện di kiểm tra gel biến tínhpolyacrylamide Kết điện di cho thấy, protein dạng đột biến (đƣờng chạy 2,Hình 3.5B) xuất nhiều dạng oligomer so với protein dạng native(đƣờngchạy1,Hình 3.5B) 3.2 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm trênbị (bovineadenovirus 4) 3.2.1 Biểuhiệnvàtinhchếproteinsợiđầumútcủabovineadenovirus4 Cácđoạngenmãhóachovùngtrìnhproteinsợi đầumútcủabovineadenovirus (gồm có 248-535,414-535vàproteinđầyđủ1-535)đƣợctáchdòngtrong vector pET28a(+) Tuy nhiên, phân đoạn 414-535 (protein sợiđầu mút) đƣợc biểu dạng tan hệ biểu E.coliJM109(DE3) Proteinđƣợctinhchếquahaibƣớcgồmsắckýáilựckimloạivàsắckýtraođổi iondƣơng Protein đƣợc đỉnh khác đƣợc ký hiệu a, b, c, d, e nhƣtronghình3.6A.Kếtquảđiệndikiểmtrachothấy,xuấthiệnmộtbăngduynhấtở kíchthƣớckhoảng15kDa,tƣơngứngvớikíchthƣớcđơnphân(Hình3.6B) Hình 3.6: Kết tinh chế protein sợi đầu mút 414-535của bovine adenovirus4bằngsắckýtraođổiion.Proteinthôiraởcácđỉnha,b,c,d,eđƣợcđiệndikiểm tra đƣờng chạy từ 3-12 Đƣờng chạy protein tinh chế lựckim loại đƣợc imidazole pH thấp Đƣờng chạy 3-12 proteintƣơng ứng thu đƣợc đỉnh a, b, c, d e theo cặp có xử lý biến tínhnhiệt(4,6,8,10,12) vàkhơngsử lýbiếntính nhiệt (3,5,7,9,11) 3.2.2 Kếtquảtạotinhthểproteinsợiđầumútcủabovineadenovirus4 Protein sau tinh chế đƣợc kết tinh điều kiện khác Các kitdùngđểkếttinhproteinđãđƣợcliệtkêtrongphầnvậtliệuvàphƣơngpháp.Từhơn 400 điều kiện kết tinh khác nhau, tinh thể có chất lƣợng cao đƣợc tìm thấy ởmột số điều kiện chứa PEG 3350 thiocyanate isothicocyanate (Hình3.7) Hình 3.7: Tinh thể protein sợi đầu mút bovine adenovirus 4đƣợc kết tinhở điều kiện chứa PEG 3350 thiocyanate isothiocyanate (A) thểcũngthuđƣợcởđiềukiệnchứaPEG400vàglycerol(B) Các tinh 3.2.3 CấutrúccủaproteinsợivùngđầuCcủaadenoviruslâynhiễmtrênbò Cấut r ú c v ù n g p r o t e i n s ợ i đ ầ u m ú t c ủ a b o v i n e a d e n o v i r u s t h u ộ c c h i Atadenovirusđƣợc xác định phƣơng pháp singleisomorphous replacement (SIR).Trongsốcáccấutrúcproteinsợi đầumútcủaadenovirus,haicấutrúcnàycónhiềuđặcđiểmtƣơngđồngvớiproteinsợiđầumú tcủaadenoviruslâynhiễmtrênrắn(snakeadenovirus1)dochúngđềuthuộcchiAtadenoviru s.Nhữngcấutrúcnàyđƣợcxemlànhữngcấutrúcnhỏnhấttrongsốcáccấutrúcproteinsợiđầ umútcủaadenovirusvớikhoảng120axitaminchomỗiđơnphân(monomer)(Hình3.8) Hình 3.8: Cấu trúc protein sợi đầu mút của bovine adenovirus 1ở dạngđơn phân (A) dạng tam phân (C) Topology cấu protein sợi đầu mút đƣợcthể dạng phiến beta màu vàng (B) Tính tích điện bề mặt đƣợc dự đốn vớicác vùng tích điện âm (màu đỏ) tích điện dƣơng (màu xanh) (D) Đầu Nv đầuCcủaproteinsợiđƣợcđánhdấubằngNtvàCttronghìnhAvàB 3.3 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm trênthằn lằn 3.3.1 Biểuhiệnvàtinhchếproteinsợiđầumútcủalizardadenovirus2 Vùng trình tự mã hóa cho protein sợi đầu mút lizard adenovirus đƣợcxác định dựa việc phân tích trình tự cấu trúc trục trung tâm gồm đoạnlặpbeta(betaspiralmotif)(Hình3.9).Cácphânđoạnđƣợcdựđốnchứavùngprotein sợi đầu mút gồm có 245-433, 305-433 vùng trình tự đầy đủ tồn bộproteinsợi1433.ProteinđƣợcbiểuhiệntronghệbiểuhiệnE.coliJM109(DE3) Hình 3.9: Phân tích trình tự mã hóa cho protein sợi lizard adenovirus 2.Vùngtrìnhtựđánhdấumàuđỏlàvùngtrìnhtự305433.Vùngtrìnhtựmàuxanhlàđoạnbổsungtừ245305.Cácplasmidmanggenmãhóachođoạn245-433,305-433vàtrìnhtựđầyđủ1433đƣợcbiểuhiệntrongE.coliJM109(DE3) Proteinđƣợctinhchếquahaibƣớctinhchếtƣơngtựnhƣquátrìnhtinhchếcủa protein protein sợi đầu mút bovine adenovirus Protein đƣợc thu lại từcác phân đoạn chứa nồng độ muối sodium chloride khoảng 50% Kết điện dichot h ấ y , p r o t e i n t n t i d n g đ n p h â n ( m o n o m e r ) k h i m ẫ u đ ƣ ợ c b i ế n t í n h nhiệt 95ºC phút trƣớc đƣợc tra vào gel điện di biến tính SDS-PAGE (Hình 3.10B, đƣờng chạy 4, 6, 8, 10) Dạng tam phân đƣợc tìm thấy cácđƣờngchạymàmẫukhơng đƣợcxửlýbiếntínhnhiệttrƣớckhichạy(Hình3.10B,đƣờngchạy 5,7,9,11) Hình3.10:Kếtquảtinhchếproteinsợiđầumútcủalizardadenovirus2bằngsắckýtrao đổiion.(A)Sắckýđồthểhiệnqtrìnhtinhchếproteinbằngsắckýtraođổication (B).ĐiệndibiếntínhproteintrêngelSDS-PAGE.Đ/ c1và2:proteinthuđƣợctừsắckýáilựcởphân đoạn250và500mMimidazole.Đ/c3-10: proteinthuđƣợctừcácphânđoạn1922củasắckítraođổiion.Mẫuđƣợcxửlýbiếntínhnhiệt95ºC(đ/c3,5,7,9)vàkhơngxửlýnhiệt(đ/ c4,6,8,10)trƣớckhitratrênbảngel.Proteindạngđơnphân(monomer)vàtamphân(trimer)đƣợ cđánhdấubằngmũitênđen