2017 PBỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠOTRƯỜNGĐẠIHỌCCẦNTHƠ NGUYỄNVĂNLẸ MSNCS P000027 PHÂN LẬPVÀTUYỂN CHỌNCHỦNGVI KHUẨNCÓKHẢNĂNGPHÂN HỦY DIAZINONTRONGCÁC MÔHÌNHCANHTÁCLUÂNCANHLÚA MÀUVÀ CHUYÊNMÀUỞMỘTSỐTỈNHĐỒNGBẰNGSÔNGCỬ[.]
PBỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠOTRƯỜNGĐẠIHỌCCẦNTHƠ NGUYỄNVĂNLẸ MSNCS:P000027 PHÂN LẬPVÀTUYỂN CHỌNCHỦNGVI KHUẨNCĨKHẢNĂNGPHÂN HỦY DIAZINONTRONGCÁC MƠHÌNHCANHTÁCLNCANHLÚA-MÀUVÀ CHUYÊNMÀUỞMỘTSỐTỈNHĐỒNGBẰNGSÔNGCỬULON G LUẬNÁNTIẾNSĨ NGÀNHVISINHVẬTHỌC MÃNGÀNH: 62420107 2017 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠOTR ƯỜNGĐẠIHỌCCẦNTHƠ NGUYỄNVĂNLẸ MSNCS:P000027 PHÂN LẬPVÀTUYỂN CHỌNCHỦNGVIKHUẨN CĨKHẢNĂNGPHÂN HỦY DIAZINONTRONGCÁC MƠHÌNHCANHTÁCLNCANHLÚA-MÀUVÀ CHUNMÀUỞMỘTSỐTỈNHĐỒNGBẰNGSƠNGCỬU LONG LUẬNÁNTIẾNSĨ NGÀNHVISINHVẬTHỌC MÃNGÀNH: 62420107 CÁNBỘHƯỚNGDẪN Hướngdẫnchính:Ts.DƯƠNGMINHVIỄNHướ ngdẫnphụ:PGs.Ts.TRẦNNHÂNDŨNG LỜI CẢMTẠ Tơixinchânthànhcảmơn: Thầy TS Dương Minh Viễn Thầy PGS TS Trần Nhân Dũng dành thờigianquýbáutậnt ì n h h n g d ẫ n vàtạo m ọ i đ i ề u k i ệ n t h u ậ n l ợ i g i ú p t ô i h o n thànhluậnán Chânthànhcámơn quýThầy Cơgiảng dạy chươngtrình nghiênc ứ u s i n h chuyênngànhVi sinhvật học, trường Đại học CầnThơ truyềnđ t c h o t ô i n h ữ n g kiếnthức quý báutrong thờigianhọc tập Xin cám ơn cán phịng thí nghiệm Sinh Học Đất củaKhoa Nơng nghiệp vàSinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồnthànhluậnán Cámơ n g i a đ ì n h v t ấ t c ả bạn b è đãđộng v i ê n v g i ú p đ ỡ t ô i t r o n g s u ố t q u trìnhhọctậpvàthờigianthựchiệnđềtài! Tácgiả NguyễnVănLẹ TĨMTẮT Nơng dược hữu thường có xu hướng lưu tồn lâu dài hệ sinh thái, trongsinh thường gây độc cho người môi trường Diazinon cấm sử dụngđối với nhiều quốc gia giới Tuy nhiên, nông dân vẫns d ụ n g t h u ố c trừ s â u chứah o t c h ấ t D i a z i n o n đ ể phòngt r d ị c h h i c â y trồng.N h i ề u n g h i ê n c ứ u v ề p h â n hủy sinh học Diazinon đất vùng ôn đới, chưa có nghiên cứu giảmthiểuô n h i ễ m D i a z i n o n t r o n g đất v ù n g nhiệt đớibằngconđườngs i n h học V ì t hếđ ề tàiđượcthựchiệnnhằmcácmục tiêu: (1) phân lập khảo sát khả phân hủy hoạt chất Diazinon chủng vikhuẩn địa phân lập từ mẫu đất thu từ ruộng canh tác chuyên màu luâncanhlúa-màu ởĐBSCL (2) đánh giá ảnh hưởng yếu tố môi trường nhiệt độ, pH, nguồncarbon,nồngđộDiazinonđếnsựgiatăngmật độvikhuẩnvàtốcđ ộ p h â n h ủ y Diazinoncủamộtsốchủngvikhuẩntuyểnchọn (3) xácđịnhảnhhưởngcủacơcấucâytrồnglênkhảnăngphânhủythuốctrừsâu Diazinonởđiềukiệnthựctếngoàiđồngruộngvàtrongđiềukiệnnhà lưới (4) xác định ảnh hưởng cấu trồng lên cấu trúc tổ hợpvi khuẩntrongđiềukiện nhà lưới Phân lập vi khuẩn có khả phân hủy Diazinon từ mẫu đất phươngpháplàmgiàumậtđộvikhuẩn,trongmơitrườngkhốngtốit h i ể u c ó b ổ s u n g Dia zinon đạt nồng độ 20 ppm tách dòng môi trường TSA Xác định khả năngphân hủy Diazinon dòng vi khuẩn phương pháp theo dõi hàm lượngDiazinon cịn lại sau 30 ngày ni ủ Các dịng vi khuẩn phân hủy diazion, địnhdanhdựavàotrìnhtựgen16SrRNAsosánhvớicáctrìnhtựnucleotidecủacácchủngvi khuẩntrênNCBIvàđặcđiểmsinhhóa.Xâydựngcâyphảhệmốiquanhệditruyềncủa dịng vi khuẩnbằng phương phápMaximun-Likelihood Sựt h a y đ ổ i c ủ a c ấ u trúc tổ hợpvi khuẩn phân hủy Diazinon, xác định kỹ thuật điện di biến tínhtăng cấp(DGGE) Trên mơ hình chun màu, tổng số có 21 mẫu đất thu số địa điểm ởĐồngbằngsơngCửuLo ng K ếtquảbốtr í thínghiệmc ho th có1 t ổ hợpvikhuẩn cókhả phânhủy Diazinon hiệuquả,g i ả m t , % đ ế n , % s a u n u ô i ủ mơi trường khốngtối thiểu Kết phânlậpđ ợ c d ò n g v i khuẩn,trong đ ó có1 dịng v i khuẩncó k h ả năngphátt r i ể n t r o n g mơitr ườ ng kh ố ng t ố i th iể u c ó bổ sung Diazinon có nồng độ 20 ppm Tuy nhiên, có dịng vi khuẩn ký hiệu HA7.4,TA3.2, TA4.17 HA7.1 có khả phân hủy thuốc trừ sâu Diazinon hiệu quả, giảmtừ 15,4% đến 27,9% sau 30 ngày nuôi cấy Mật độ bốn dòng vi khuẩn đạt caonhất điềukiện môi trường nuôi cấy nhưs a u : oC, pH 7, có bổs u n g t h ê m nguồnT S B v n n g đ ộ D i a z i n o n d a o đ ộ n g t 20 ppm–50 ppm.Các dòng vi k h u ẩ n thể hiệnkhả phânhủy Diazinonh i ệ u q u ả n h ấ t n h i ệ t đ ộ oC với tốc độp h â n hủy dao động từ 0,55-0,94%/ngày, pH 6-7 với tốc độ phân hủy từ 0,50-0,94%/ngày, ởnồng độ Diazinon 20 ppm với tốc độ phân hủy từ 0,56-0,93%/ngày với mật độ vikhuẩnbanđầuđạt106CFU/mLcótốcđộphânhủy0,60-0,98%/ngày Trên mơ hìnhcanhtác lncanhlúa–màu,tổng sốc ó 20 mẫu đất đ ợ c t h u t i mộtsốđịađiểmởĐồngbằngsơngCửuLong.Kếtquảnghiêncứuchothấycó13tổhợpvi khuẩn thể khả phân hủy Diazinon, giảm từ 17,6% đến 97,8% sau 14ngày ni cấy Bên cạnh đó, 27 tổng số 109 chủng vi khuẩn phân lập từ 13 tổhợpvi khuẩn phát triển tốt mơi trường khống tối thiểu có bổ sung Diazinon đạtnồng độ20 ppm Tuy nhiên, có2dịng vi khuẩnký hiệuC L _ M v B T _ L phân hủy hiệu Diazinon 20,9% 29,3% sau 30 ngày ni cấy Mật độcủa hai dịng vi khuẩn CL36_M4 BT4_L1 đạt cao điều kiện môi trường như:30oC,p H , m ô i t r n g n u ô i c ấ y bổs u n g T S B v n n g đ ộ D i a z i n o n t – p p m HaidòngvikhuẩnCL36_M4v B T _ L , p h â n h ủ y D i a z i n o n h i ệ u q u ả n h ấ t đ i ề u kiện môi trường 30oC với tốc độ phân hủy từ 0,70-1,03 %/ngày, pH với tốc độphân hủy dao động từ 0,72-1,02 %/ngày, nồng độ Diazinon 20 ppm với tốc độ phânhủy từ 0,67-0,97%/ngày với mật độvi khuẩnc h ủ n g v o b a n đ ầ u 6CFU/mLchotốcđộphânhủytừ0,74-1,18%/ngày Dòng vi khuẩn HA7.1 thể khả phân hủy Diazinon hiệu môitrườngđấtdưới điềuk i ệ n p h ị n g t h í nghiệm s a u 30n g y nuôiủ C ác ng hi ệm t h ứ c cóbổsung vi khuẩn HA7.1 làmg i ả m h m l ợ n g D i a z i n o n v k h c b i ệ t c ó ý n g h ĩ a t h ố n g kê so với nghiệm thức đối chứng Trong đó, nghiệm thức 4: Đất khơng tiệt trùng bổsungvi khuẩnHA7.1có hàmlượng Diazinongiảm mạnh hơns o v i n g h i ệ m t h ứ c : Đất tiệt trùng bổs u n g v i k h u ẩ n HA7.1, giảmtương ứng 63,7% p h â n hủyDiazinon2,11%/ngàyvà48,6%vớitốc độ1,62%/ngày với tốc độ Trên mơ hình ln canh lúa màu ngồi đồng ruộng, cấu trúc tổ hợpvi khuẩnhiếu khí phân hủy Diazinon đất vào vụ màu chứa nhóm vi khuẩn khác nhau,trong vụ lúa chứa nhóm vi khuẩn Trong điều kiện nhà lưới, mơ hìnhchuyên màu cấu trúc tổ hợpvi khuẩn phân hủy Diazinon đất phân táchthành6 nhómv i khuẩnkhácnhau.Trongmơhìnhln ca nh lúamàuchothấy đấtvụ màucóchứa 4nhóm v i khuẩnkhác nhau,trong khiđấtt r o n g vụlúa chứa3nhóm v i khuẩnkhácnhau Kết giải mã trình tự gen 16S rRNA sáu dòng vi khuẩn HA7.1, HA7.4,TA3.2, TA4.17, CL36_M4 BT4_L1 cho thấy chúng định danh làLactobacillus plantarumHA7.1,Pandoraeasp HA7.4,Sinomonas atrocyaneaTA3.2,AchromobacterxylosoxidansTA4.17,Cupriavidussp.CL36_M4vàAchr omobacterxylosoxidansBT4_L1 Từkhóa:Tổ hợ pv i khuẩn,chuyênm àu, hệthống luân c a n h lúa-màu,hoạtchất Diazinon,vikhuẩnphânhủyhoạtchấtDiazinon SUMMARY Organicagriculturalpesticidesaresostableinecosystemsandb i o s p h e r e Thes ecompoundsaffecthumanhealtha n d e n v o n r i n m e n t D i a z i n o n , a t o x i c sub stance, hasbeen banned or restricted in most countries However, some placesfarmersstill continue using thissubstance in their farmasa p e s t i c i d e t o c o n t r o l t h e pest Diazinon degrading bacteria have been extensively studied in temperate soils, butinformation onbehaviourintropicalsoilsis limited Theaimofthisstudywas (1) toisolate andcharacterizeDiazinondegrading bacteriafrom uplandc r o p riceandcontinuousuplandcroppingsystemsoilsintheMekongDeltaofVietnam (2) tospecify theeffectsoftemperature,pH,carbonsourcesandDiazinonconcentration on the growth of some selected bacterial isolates, and to find out theoptimal conditions of innoculation environment uch as temperature, pH, innoculationdensityandDiazinonconcentrationtoenhancethebiodegradationrateofDia zinon (3) to evaluate the effects of two different cropping systems (continuous uplandcrop and upland crop-rice) on Diazinon degradation under nethouse condition and intheactualfields (4) to test the effects of different cropping systems on the Diazinon degradingbacterialcommunitystructureunder nethousecondition The isolation of Diazinon degrading bacteria was performed with soil collectedfromcontinuousuplandcropandu p l a n d c r o p - r i c e c r o p p i n g s y s t e m s S o i l b a c t e r i a were enriched in mineral salt medium solution containing 20 ppm Diazinon as the onlycarbon source for bacterial growth Tryptic Soya Agar (TSA) was used for the step ofpurification of bacterial strains Diazinon degrading bacteria were identified basedo n the sequencing of 16S rRNA gene, and these sequences were aligned with publishedsequencesinNCBIBLASTnucleotidedatabaseandbiochemicalcharacteristics of bacteria Then phylogenetic trees 16SrRNAsequencesbytheMaximum- were established based on the Likelihoodmethod.TheDiazinond e g r a d i n g bacterial community structure analysis was examined by PCR-denaturing gradient gelelectrophoresis(DGGE) Twenty one soil samples were collected from continuous upland crop croppingsystem in the Mekong Delta of Vietnam Results showed that 10 out of 21 bacterialcommunitiess h o w e d t h e i r degradation c a p a c i t y toward D i a z i n o n f r o m 14.3%to