0850 nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng escherichia coli o157h7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu luận văn tốt nghiệp

1 Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng dƣới hƣớngdẫn PGS TS PGS TS Các số liệu trìnhbàytrongluậnánlàtrungthực Một số kết đƣợc công bố riêng đồng tác giả, phần cịn lại chƣađƣợcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác Tơixinhồntồnchịu tráchnhiệmvềnhữngsốliệutrong luậnánnày! HồngPhúHiệp 03năm2014 LỜICẢMƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TSLê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi hướng dẫn, bảo tận tình từnhữngbướcđiđầutiênvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợiđểtơihồnthànhluậnánnày Tơixinchânthànhcảmơnsựgiúp – thựchiệnđềtàiluậnán Tơi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đạihọc Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ suốtthờigianhọctập,nghiêncứu Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè tơi tạo điều kiện động viên tơitrongsuốtqtrìnhhọctậpvàhồnthànhluậnán Tơixintrântrọngcảmơn!!! TháiNguyên,ngày 05tháng03năm2014 Nghiêncứusinh HoàngPhúHiệp Trang MỞĐẦU 1 Đặtvấnđề .1 Mụctiêu nghiên cứu .2 Nộidungnghiêncứu Chƣơng1.T Ổ N G QUANTÀILIỆU .3 1.1 VIKHUẨNE.COLIO157:H7 1.1.1 ĐặcđiểmchungcủachủngvikhuẩnE.coliO157:H7 1.1.2 ĐộctốShiga-liketoxin: Bảnchấtvàtáchại 1.1.3 Nguyênnhânvàdiễnbiếnkhingộđộc 11 1.1.4 TìnhhìnhngộđộcthựcphẩmdovikhuẩnởViệtNam 13 1.2 CÁCPHƢƠNGPH Á P PHÁTHIỆN VÀXÁCĐỊNHVIK HUẨ N E.COLIO157:H7 14 1.2.1 Phƣơngpháp PCR dựa trênDNA 14 1.2.2 KỹthuậtLAMP .18 1.2.3 SửdụngkhángthểtáitổhợptrongpháthiệnE.coliO157:H7 .19 1.3 KHÁNGTHỂ 23 1.3.1 Mảnhkhángthể .25 1.3.2 Khángthểtáitổhợp 26 1.3.3 Kỹthuậtphagedisplay 27 1.3.4 Tìnhhìnhnghiêncứusử dụngkhángthểởViệtNam 32 Chƣơng2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊN CỨU .35 2.1 Vậtliệunghiêncứu 35 2.1.1 Sinhphẩm 35 2.1.2 Hóachất .35 2.1.3 Cáccặp mồiđƣợcsử dụng 36 2.2 Thiếtbị 36 2.3 Phƣơngpháp nghiêncứu 37 2.3.1 P ứuDNA 37 2.3.2 Kỹthuậtbộc lộtrênthựckhuẩnthể(phagedisplay) 43 2.3.3 ứuprotein 45 2.3.4 Phƣơngpháp phântíchvàxử lýsốliệu 51 Chƣơng3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨUVÀTHẢOLUẬN 52 : .52 3.1 XÁC ĐỊNHVIKHUẨNE.COLIO157:H7BẰNGKỸTHUẬTGEN 52 3.1.1 Xácđ ịn hc hủ ng v i kh uẩ n E c o l i O : H bằ n g k ỹ thuậtp h â n tí c h genmãhóa16SrRNA .52 3.1.2 Sửdụngđoạn genStx1vàStx2đểxácđịnhE.coliO157:H7 58 3.1.3 SửdụngkỹthuậtLAMPxácđịnhvikhuẩnE coliO157:H7 63 3.2 NGHIÊNC Ứ U T H U N H Ậ N K H Á N G T H Ể Đ Ặ C H I Ệ U Đ Ố I V Ớ I VIKHUẨNE.COLIO157:H7VÀTÁCHDỊNGXÁCĐỊNHTRÌNHTỰ GENMÃHĨAKHÁNGTHỂ 69 3.2.1 SànglọckhángthểtừthƣviệnGriffin.1 70 3.2.2 Chọndòngphagekhángthểđặchiệuvới vikhuẩnE.coliO157: H7 72 3.2.3 NhânbảngenmãhóakhángthểbằngPCR 74 3.2.4 Giảitrìnhtự genmãhốkháng thể 75 3.3 TẠO DÒNGVÀBIỂUHIỆNPROTEINKHÁNGTHỂTÁITỔHỢP 79 3.3.1 79 3.3.2.T h i ế t kế vectorpET28a-TRXbiểuhiệngenmãhóakhángthể 80 3.3.3 .82 3.3.4 3.4 ểuhiệngenmãhóakhángthể 83 TINHS Ạ C H V À X Á C Đ Ị N H H O Ạ T T Í N H C Ủ A K H Á N G T H Ể TÁITỔHỢP 85 3.4.1 85 3.4.2 pháplaiblot .88 3.4.3 KiểmtrahoạttínhcủakhángthểtáitổhợpbằngELISA .90 3.4.4 ạtnano .91 93 94 95 PHỤLỤC .108 iv vi THUẬTNGỮVIẾTTẮT STT Kýhiệu Amp bp CDC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 CDR Cfu ddNTP DNA dNTP E.coli EDTA EHEC ELISA EtBr FDA HRP HC HUS IPTG Kana Kb kDa LAMP LB mAb OD PBS PCR PEG rRNA SDS SDS-PAGE STEC TAE TE TEMED v/p VH VL Tênđầy đủ Ampicillin Basepair CentersforDiseaseControlandPrevention-TrungtâmKiểm sốtvàPhịngchốngDịchbệnhMỹ ComplementarityDeterminingRegion- Vùngquyếtđịnhtínhbổ trợ Colonyformingunit Dideoxynucleotide DeoxyribonucleicAcid Deoxynucleotide Escherichiacoli EthyleneDiamineTetraaceticAcid EnterohaemorrhagicE.coli-E.coligâyxuấthuyếtruột Enzyme-linkedimmunosorbentassay EthidiumBromide Foodand DrugAdministration Horseradishperoxidase HemorrhagicColitis-Viêmđạitràngxuấthuyết HemolyticUremicSyndrome-Hội chứngdunghuyếtvàsuythận Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside Kanamycin Kilobasepair KiloDalton Loop-mediatedIsothermalAmplification LauriaBertani Monoclonalantibody- khángthểđơndòng OpticalDensity Phosphate buffersaline PolymeraseChainReaction PolyethyleneGlycol RibosomalRNA SodiumDodecyl Sulphate SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis Shiga-liketoxinproducingEscherichiacoli Tris-Acetate–EDTA Tris–EDTA N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine Vòng/phút Variableheavy-Vùngbiếnđổichuỗinặng Variablelight-Vùngbiếnđổichuỗinhẹ v vii Sốhiệu bảng 1.1 Tênbảng hôngsốhệgencủavikhuẩnE.coliO157:H7 Trang 06 1.2 Đặcđiểmcủacácmảnhkhángthể 26 2.1 Trìnhtựcáccặp mồisử dụngtrong nghiêncứu 36 2.2 ThànhphầnphảnứngPCR 39 2.3 Thànhphần phảnứngxử lýDNAbằngenzmegiớihạn 40 2.4 Thànhphần phảnứng nốighép 40 2.5 Thànhphần vàchutrìnhnhiệtphảnứngLAMP 42 2.6 Thànhphầngelpolyacrylamide 46 3.1 3.2 3.3 3.4 Kếtquảso sánhtrìnhtựgenHQ658163với cáctrìnhtựgen16S rRNAtừGenBank Kếtquảso sánhtrìnhtựgenStx1vớicáctrìnhtựgenStx1từ GenBank Kếtquảso sánhtrìnhtựgenStx2với cáctrìnhtựgenStx2từ GenBank KếtquảcủaphảnứngELISAxácđịnhđộnhạycủakhángthểtái tổhợpvàkhángthểchuẩn 56 61 62 90 vi viii Sốhiệu hình 1.1 Tênhình Trang HìnhảnhvikhuẩnE.coliO157:H7trênkínhhiểnviđiệntử 03 1.2 HìnhảnhvikhuẩnE.coliO157:H7trênmơitrƣờngcóMUG 04 1.3 Bảnđồ 05 1.4 Cấutrúcđộctố Shiga-liketoxin 07 1.5 Nguyên lýgâychết tế bào củaShiga-liketoxin 08 1.6 NguyênlýgâybệnhcủaE coliO157:H7 12 1.7 Cấu trúcchungcủamộtsố loại khángthể 24 1.8 Sơđồ cấu tạocủamảnhkhángthểđơn chuỗi 25 3.1 Sơđồbố tríthí nghiệmcủaluậnán 52 3.2 Hìnhảnh điện ditách DNAtổngsố 3.3 Hìnhảnhđiệndi sảnphẩmPCRnhângen mãhóa16SrRNA 53 3.4 Hìnhảnh điệndi kiểm trakết quảtáchchiết DNAplasmid 54 3.5 Hìnhảnh điện dikiểm traDNAplasmid bằngenzyme giới hạnBamHI 55 (genome) củavikhuẩnE coliO157:H7 ẩnE.coliO157:H7 53 Sơđ h ì n h thểhi ện m ố i q u a n h ệ E c ol i O : H vớ i g khácđƣợcxâydựngtrêncơsởsosánhtrìnhtựgen16SRNA củachủng 3.6 E.coliO157:H7nghiêncứu(mãsốHQ658163)vàcácchủngkháctrên 57 NgânhàngGen Quốctế 3.7 Hìnhảnhđiện disản phẩmPCRnhângenStx1vàStx2 58 3.8 Hìnhảnh điệndi sản phẩmPCRnhân genStx1với cặpmồi vectorpJET 59 3.9 Hìnhảnh điệndi sản phẩmPCRnhân genStx2với cặpmồi vectorpJET 60 3.10 VịtrívàtrìnhtựcặpmồiFIP/BIP 64 3.11 HìnhảnhđiệnditáchchiếtDNAtổngsố 64 3.12 HìnhảnhđiệndisảnphẩmphảnứngLAMP 65 3.13 HìnhảnhđiệndisảnphẩmLAMPxácđịnhhàmlƣợngDNA 66 3.14 SảnphẩmLAMPkhinhuộm 68 SYBRGreen I Khảnănggắnkếtcủahỗnhợpphagethuđƣợcsaumỗivòngsànglọc 3.15 vớidòngtếbàoE.coliO157:H7 71 Sơ đồ nguyên lýkỹthuậtELISAdùngtrongxácđịnh áilựccủaphage 3.16 3.17 vớiE coliO157:H7 KếtquảcủaphảnứngELISAđánhgiá lực củahỗn hợpphagevòng 72 73 ix sànglọc5 Kếtquảđánhgiááilựccủadòngphage20với tế bàoE.coliO157:H7 3.18 74 vàtếbàoE coliATCC 25922 3.19 KếtquảđiệndisảnphẩmPCRcủadòng20vớicặpmồiLABF/LABR 75 3.20 Cấu trúc3Dkhángthể tái tổhợp 77 3.21 Hìnhảnh điện di sản phẩ 80 3.22 Thiếtkếvector pET28a-TRX biểu hiệngen mã hóakhángthể 81 -PAGE 3.23 82 3.24 3.25 Hìnhảnh điệ 3.26 83 khángthểtái tổ hợp Khảosátnhiệt độ biểuhiện củakhángthểtái tổ hợp - 84 ủakhángthểtáitổ 86 hợp Hìnhảnh kếtquảđiệndiSDS-PAGEquátrìnhtinh proteintái tổ 3.27 87 hợpbằngphƣơngphápHybrid Hìnhảnh điện di kết quảphản ứngWestern blotcủakhángthểtái tổ hợ 3.28 88 -tag Hình ảnh kết quảphảnứngDot blot củakhángthểtái tổ hợp vớikháng 3.29 3.30 89 thểchuẩnmã sốAB75244 (HãngAbcam) Hìnhảnhphức khángthể-silicabắt tếbàoE coliO157:H7 91 MỞĐẦU Đặtvấnđề Ngộ độc thực phẩm xảy sử dụng thức ăn, nƣớc uống khôngđƣợc bảo quản cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối nhiễm khuẩn hóachất độc hại Các nghiên cứu gần xác định nguyên nhâncủanhiềutrƣờnghợp ngộđộcthứcănlàdovikhuẩnE.coli E colithuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruộtEnterobacteriaceae, có nhiều trongtự nhiên, ruột ngƣời gia súc Trong đƣờng ruột, chúng diện chủyếu đại tràng nên đƣợc gọi vi khuẩn đại tràng.E colinhiễm vào đất,nƣớc… từphâncủađộngvật.Khigặpđiềukiệnthuậnlợichosựpháttriểnchúngsẽgâybệnh.ĐasốcácchủngE colilà chủng độc hại, nhiên có vàichủng độc nhƣ chủngE coliO157:H7 tìm thấy ruột phâncủa loài gia súc, đặc biệt phân bò, chất thải bò sản phẩm nhƣthịtbị,sữabịchƣakhử trùng [49] CácbệnhcóliênquanđếnE.colilàtiêuchảy,viêmphổi,viêmđƣờngdẫntiểuvàmộtsốbệnh khác.Triệuchứngbịnhiễmtrùngvikhuẩnthƣờngkhácnhau,nhƣngnhìn chung, bệnh nhân hay có triệu chứng nhƣ: nơn, đau bụng, sốt, xuất huyếtdƣớida,tănghuyếtáp,tiêuchảythƣờngcómáu Đạiđasốbệnhnhânphụchồisau5đến7ngày Vì vi khuẩnE coliq phổ biến, nên hàng năm khắp giới đềucóngƣờimắcbệnhdovikhuẩnnày.CácchungiaƣớctínhrằngởMỹmỗinămcókhoảng70ng hìnngƣờimắcbệnhliênquanđếnE.coliO157:H7[106] ỞViệtNam,theothốngkêcủaCụcVệsinhAntồnThựcphẩm,năm2010có175vụngộđộcvới 5664 ngƣời mắc, có 3978 ngƣời phải nhập viện 51ngƣờitửvong.Năm2011có148vụngộđộc, trongđócó4700ngƣời mắcvới3663ngƣờiphảinhậpviệnvà27ngƣờitửvong.Năm2012có168vụngộđộc,trongđócó5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện 34 ngƣời tử vong Nhƣ vậy, banămliêntiếpcó491vụngộđộcvới112ngƣờitửvong.Trongnăm2013nƣớctaxảyra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng tháng cuối năm Số liệu thống kêtrongquýIIInăm2013chothấy,trong40vụngộđộcthựcphẩmthì23vụdovisinhvậtgâyra.C hủngvi khuẩnE.coliO157:H7đƣợcxácđịnhlầnđầutiênởViệtNam