TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ Khoa Cơ khí – Công nghệ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng kháng nấm gây bệnh mốc đen trên củ ném Sinh viên thực hiện Hồ Thị Tuy[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HUẾ Khoa Cơ khí – Cơng nghệ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ảnh hưởng nano bạc đến khả kháng nấm gây bệnh mốc đen củ ném Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Tuyết Như Lớp: CNTP 49A Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thỵ Đan Huyền Bộ môn: Cơng nghệ thực phẩm HUẾ, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HUẾ Khoa Cơ khí – Cơng nghệ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ảnh hưởng nano bạc đến khả kháng nấm gây bệnh mốc đen củ ném Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Tuyết Như Lớp: CNTP 49A Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thỵ Đan Huyền Bộ môn: Công nghệ thực phẩm HUẾ, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, thời gian thực đề tài, nhận nhiều giúp đỡ Đầu tiên tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến tồn q thầy khoa Cơ khí – Cơng nghệ tận tâm truyền đạt nhiều kiến thức cho suốt năm học vừa qua Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo ThS Nguyễn Thỵ Đan Huyền, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tiếp đến xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giáo viên phụ trách Phịng thí nghiệm khoa Cơ khí – Công nghệ trường đại học Nông Lâm Huế nhiệt tình đạo tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ, động viên tinh thần lo lắng cho suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tuy nhiên nhiều hạn chế lực, thời gian điều kiện sở vật chất, dù thân nổ lực cố gắng nhiều, bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học, nên không tránh khỏi sai sót q trình hồn thành khóa luận Vì tơi mong nhận ý kiến đóng góp cảm thơng q Thầy, Cơ để khóa luận tốt nghiệp này, thân tơi mở rộng để ngày hồn thiện tốt tương lai Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng 3, năm 2020 Sinh viên Hồ Thị Tuyết Như DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng chất dinh dưỡng 100g củ ném Bảng 4.1 Ảnh hưởng nano bạc đến đường kính tản nấm A niger M02 30 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nano bạc đến tỷ lệ nảy mầm bào tử nấm A niger M02 sau 12 38 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hành tăm Hình 2.2 Thân hoa ném Hình 2.3 Triệu chứng bị bệnh mốc đen củ ném Hình 2.4 Hình ảnh nấm Aspergillus niger Hình 2.5 Triệu chứng gây hại tuyến trùng củ ném Hình 2.6 Triệu chứng bệnh thối cổ củ Hình 2.7 Tác động ion bạc lên vi khuẩn nấm 11 Hình 2.8 Sơ đồ ion bạc vơ hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy vi khuẩn 11 Hình 2.9 Cơ chế diệt khuẩn nano bạc 12 Hình 3.1 Nano bạc 17 Hình 3.2 Mẫu ném bị bệnh mốc đen 18 Hình 3.3 Quy trình phân lập giám định định danh nấm gây bệnh mốc đen củ ném 19 Hình 4.1 Phân lập nấm giấy thấm môi trường PDA 25 Hình 4.2 Hình ảnh tản nấm, bào tử nấm sợi nấm làm môi trường PDA 26 Hình 4.3 Hình ảnh đại thể chủng nấm môi trường PDA 26 Hình 4.4 Hình ảnh vi thể chủng nấm 27 Hình 4.5 Kết trình tự nucleotide đoạn gen ITS1-4 chủng nấm 28 Hình 4.6 Kết so sánh tương quan di truyền chủng nấm định danh với chủng nấm Aspergillus niger ngân hàng gen 28 Hình 4.7 Hình ảnh đường kính tản nấm A niger M02 sau 10 ngày ni cấy nồng độ nano bạc 29 Hình 4.8 Ảnh hưởng nồng độ nano bạc đến khối lượng sinh khối khô sợi nấm A niger M02 sau ngày nuôi cấy 35 Hình 4.9 Hình ảnh sinh khối nấm A niger M02 sau ngày nuôi cấy nồng độ nano bạc khác 35 Hình 4.10 Hình ảnh bào tử nấm A niger M02 38 Hình 4.11 Hình ảnh khả ức chế nảy mầm bào tử nấm A niger M02 nồng độ nano bạc 39 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT A niger : Aspergillus niger CT : Công thức ĐC : Đối chứng PDA : Potato Dextrose Agar PDB : Potato Dextrose Borth HLUC : Hiệu lực ức chế MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài Phần TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan ném (Allium schoenoprasum L.) 2.1.1 Nguồn gốc, phân bố đặc điểm ném 2.1.1.1 Nguồn gốc phân bố ném 2.1.1.2 Đặc điểm ném 2.1.2 Giá trị dinh dưỡng thành phần hoạt tính ném 2.1.2.1 Giá trị dinh dưỡng ném 2.1.2.2 Thành phần hoạt tính ném 2.1.3 Ứng dụng ném 2.1.4 Tình hình sản xuất ném nước ta 2.1.5 Những bệnh thường gặp ném 2.1.5.1 Bệnh mốc đen 2.1.5.2 Bệnh tuyến trùng củ 2.1.5.3 Bệnh thối cổ củ 2.2 Tổng quan công nghệ nano bạc 2.2.1 Giới thiệu công nghệ nano 2.2.2 Giới thiệu nano bạc 2.2.2.1 Định nghĩa nano bạc 2.2.2.2 Tính chất nano bạc 10 2.2.2.3 Cơ chế diệt khuẩn nano bạc 10 2.2.2.4 Ứng dụng công nghệ nano bạc thực phẩm 12 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước liên quan đến đề tài 13 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 13 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 15 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phân lập tuyển chọn định danh chủng nấm gây bệnh mốc đen củ ném 18 3.3.1.1 Phương pháp thu mẫu nấm bệnh 18 3.3.1.2 Phương pháp phân lập giám định nấm 18 3.3.1.3 Bố trí thí nghiệm để quan sát đặc điểm sinh hóa nấm mơi trường 1/5 PDA, ½ PDA, PDA chuẩn 21 3.3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến đường kính tản nấm gây bệnh mốc đen môi trường PDA 21 3.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến hình thành sinh khối sợi nấm mơi trường ½ PDB 22 3.3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến thời gian nảy mầm tỷ lệ nảy mầm bào tử nấm 23 3.3.5 Phương pháp xử lí số liệu 24 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân lập tuyển chọn định danh chủng nấm gây bệnh mốc đen củ ném sau thu hoạch 25 4.1.1 Kết phân lập giám định hình thái 25 4.1.2 Kết định danh chủng nấm cấp độ loài 27 4.2 Ảnh hưởng nano bạc đến đường kính tản nấm Aspergillus niger M02 môi trường PDA 29 4.3 Ảnh hưởng nano bạc đến hình thành sinh khối sợi nấm A niger M02 môi trường PDB 34 4.4 Xác định thời gian nảy mầm ảnh hưởng nano bạc đến tỷ lệ nảy mầm bào tử nấm A niger M02 37 4.4.1 Xác định thời gian nảy mầm 37 Phần KẾT LUẬN 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Phần PHỤ LỤC 48 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước ta nằm vành đai nhiệt đới khí hậu gió mùa, điều kiện thích hợp cho việc phát triển nơng nghiệp, gia vị phổ biến cung cấp sản lượng lớn cho thị trường nội địa, mà mang lại giá trị cao xuất khẩu, tạo nguồn thu nhập ổn định cho nơng dân Một gia vị củ ném Ném (Allium schoenoprasum L) loại gia vị có giá trị kinh tế lớn trồng nhiều nước ta như: Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Ném có vị đắng cay mùi hăng nồng với nhiều hoạt chất có giá trị sử dụng phổ biến dân gian loại gia vị khơng thể thiếu nhiều ăn, thân củ giàu dinh dưỡng chữa trị nhiều bệnh Do việc bảo quản ném nhiều sản phẩm nông nghiệp khác vấn đề quan trọng đáng quan tâm Và bệnh thường gặp củ ném bệnh thối mốc đen Bệnh thối mốc đen thường xâm nhiễm từ hạt giống, đất trước thu hoạch phát triển mạnh củ ném bảo quản nhiệt độ 30°C độ ẩm 80% [18] Như biết từ thời xa xưa sống người cịn nghèo nàn lạc hậu người dân dựa vào kinh nghiệm để bảo quản, nhiên với kinh nghiệm ỏi bảo quản khoảng thời gian ngắn, thời gian ngắn mà cịn khơng hạn chế mầm bệnh nấm hại gây nên làm giảm chất lượng suất cách trầm trọng Về sau sống người phát triển thuốc trừ nấm hóa học đời, thuốc trừ nấm hóa học phịng trừ nấm hiệu thuận lợi giữ cho rau tươi ngon đẹp mắt việc lạm dụng chúng mức ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm, đến sức khỏe người mà cịn gây nhiễm nặng nề đến môi trường việc sử dụng chúng cách thường xuyên dẫn đến tình trạng kháng thuốc, với sống ngày tấp nập đại ngày quy định khắt khe dư lượng thuốc hóa học khơng thể tránh khỏi thiếu sót, điều khiến cho phương pháp kiểm sốt mầm bệnh sau thu hoạch hóa chất khơng khuyến khích áp dụng Chính việc nghiên cứu đưa phương pháp bảo quản phù hợp an toàn việc làm cần thiết cấp bách người Áp dụng phương pháp bảo quản phù hợp góp phần trì làm tăng phẩm chất tiết kiệm chi phí, có lẽ nên thu hút nhiều nhà nghiên cứu khoa học việc kiểm soát mầm bệnh Trong nghiên cứu đưa nhiều chiết xuất thực vật có tiềm lớn thay thuốc diệt nấm tổng hợp, thân thiện với môi trường dịch chiết gừng kháng nấm mốc gây bệnh thán thư chuối ớt [16], nanochitosan kháng nấm gây hại cà chua [17] hay chế phẩm nano bạc-TBS kháng nấm Macrophoma theicola gây hại quýt Hương Cần [12]…Trong số biết nano bạc dịch chiết xuất từ thực vật thân thiện với môi trường người ứng dụng rộng rãi, diện tích tiếp xúc với vi khuẩn nấm lớn nên khả diệt khuẩn diệt nấm cao, với việc sử dụng nano bạc để kháng nấm củ ném chưa nghiên cứu Chính việc tiến hành nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến khả kháng nấm gây bệnh mốc đen củ ném đề tài mẽ có tính khả thi cấp thiết 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến hình thành phát triển nấm gây bệnh mốc đen củ ném điều kiện in vitro Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Việt Hưng (1999), Tự điển thảo mộc dược học, Nhà xuất y học Lăng Thị Vân Anh (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học hành tăm, Khóa luận dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Hoàng Kim Toản, Tạ Sáu, Trần Đăng Hịa, Trần Thị Thu Giang Nguyễn Đình Thi (2017), Đánh giá thực trạng sản xuất hành tăm (Allium schoenoprasum) vùng đất cát ven biển từ năm 2010 đến 2014 Quảng Trị, Tạp chí khoa học Đại học Huế, 126(3C), 121-131 Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L., Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210, ACIAR: Canberra Nguyễn Ngọc Hùng (2011), Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc khả sát khuẩn nó, Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Quang Hoàng Vũ, Hoàng Thị Kim Hồng (2018), Ảnh hưởng nano bạc lên khả nảy mầm số tiêu hóa sinh hạt giống lúa Đài Thơm, Tạp chí khoa học đại học Huế, Khoa học tự nhiên, 127(1C), 181-191 Nguyễn Thị Trúc Anh, Võ Minh Trí, Phạm Quốc Huy (2012), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano công nghiệp thực phẩm, Đại học cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978), Phân loại học thực vật (Thực vật bậc cao), Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp 10 Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ Thực vật hạt kín Việt Nam, Nhà xuất Nơng nghiệp 11 Võ Văn Chi (1975), Cây cỏ thường thấy Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật 43 12 Võ Văn Quốc Bảo, Trương Ngọc Đăng (2018), Khả kháng nấm chế phẩm nano bạc-TBS Macrophoma theicola gây hại quýt Hương Cần, Tạp chí Khoa học Đại học Huế, Khoa học Tự nhiên, 127, 131-139 13 Lê Như Cương, Nguyễn Thị Nhung Nguyễn Thị Diễm (2018), Khả kháng nấm hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng lạc Sclerotium rolfsii dung dịch nano bạc, Tạp chí khoa học Đại học Huế, 127(3A), 161-171 14 Lê Quang Luân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Phan Hồ Giang (2014), Nghiên cứu hiệu ứng kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh chết nhanh hồ tiêu chế phẩm nano bạc – chitosan chế tạo phương pháp chiếu xạ, Tạp chí sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, 36 (1), 152-157 15 Đào Thiện, Trần Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Thủy, Trần Thị Lan Hương (2012), Mơ hình hóa với loại nấm mốc, Tạp chí khoa học phát triển, 10(5), 792-797 16 Nguyễn Thỵ Đan Huyền, Lê Thanh Long (2019), Khả kháng nấm mốc gây bệnh thán thư chuối ớt sau thu hoạch dịch chiết gừng, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp, 3(3), 1439-1447 17 Lê Thanh Long, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Cao Cường, Trần Ngọc Khiêm, Nguyễn Thị Thủy Tiên (2015), Khả ức chế nanochitosan Colletotrichum acutatum L2 gây hại cà chua sau thu hoạch, Tạp chí khoa học phát triển, 13(8), 1481-1487 18 Lê Thanh Long, Nguyễn Thị Kim Uyên, Nguyễn Thị Thủy Tiên, Lê Đại Vương (2019), Nghiên cứu khả kháng nấm Aspergillus niger N2 hành tăm sau thu hoạch nanochitosan tạo phương pháp gel ionic kết hợp sóng siêu âm, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp, 3(2) II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19 Jame L.B., Phil D (1990), Onions and allied crops, CRC Press 20 Monika G., Aneta W., Dorota J., Barbara J (2011), Nutritional value of chive edible flowers, West Pomeranian University of Technology, Szczecin, 10(2), 85-94 44 21 Dahlgren R.M.T., Clifford H.T., Yeo P.F (1985), The Families of monocotyledons, Springer-verlag berlin Heidelberg, New York Tokyo 22 Le D.V., Nguyen T.L., Dao D.H.N., Phan T.A., Vo V.Q.B (2017), Green synthesis of silver nanoparticles from fresh leaf extract of centella asiatica and their applications, International Journal of nanoscience, 16(1), 1650018 23 Sonia V.Z., Elsa C.L (2009), Quality changes in fresh chive (Allium schoenoprasum L.) during refrigerated storage, Journal of food quality, 32, 747-759 24 Filomena N., Florinda F., Laura D.M., Raffaele C and Vincenzo D.F (2013), Effect of essential oils on pathogenic bacteria, Journal list pharmaceuticals, 6, 1451-1474 25 Vo V.Q.B., Le D.V., Le V.L (2018), Biomimetic synthesis of silver nanoparticles for preparing preservative solutions for mandarins (Citrus Deliciosa Tenore), Nano life, 8(1), 1850003 26 Zdenka K., Jiri M., Petr H., Otakar R., Pavel V., Saha P (2011), Phenolic Compounds from Allium schoenoprasum tragopogon pratensis and rumex acetosa and their antiproliferative effects, Journal Molecules, 16, 9207-9217 27 Rabinowitch H.D., Currah L (2001), Allium crop science: recent advances, CABI publishing 28 James L Brewster (2008), Onions and other vegetable alliums, Crop production science in horticulture: 15 29 Mehra R.K., Winge D.R (1991), Metal ion resistance in fungi: molecular mechanisms and their regulated expressions, Journal of Cellular Biochemistry, 45, 30-40 30 Young K.J., Cromwell W., Jeong H.K., Thorkelson J., Roh J.H., Shin D.B (2015), Use of silver nanoparticles for managing Gibberella fujikuroi on rice seedlings, Crop protection, 74, 65-69 31 Kabir L., Sang W.K., Jin H.J., Yun S.K., Kyong S.K., Youn S.L (2011), Application of silver nanoparticles for the control of Colletotrichum species in vitro and pepper anthracnose disease in field, The Korean Society of Mycology, 39(3), 194-199 32 Armen takhtajan (1987), Disversity and classification of flowering plants, Columbia University Press, New York, 34(4), 497-499 45 33 Cota-Arriola O., Cortez-Rocha M.O., Burgos-Hern A.A., Ezquerra- Brauer J.M., Plascencia-Jatomea M (2013), Controlled release matrices and micro/nanoparticles of chitosan with antimicrobial potential-development of new strategie for microbial control in agriculture, Journal of the Science of Food and Agriculture, 93(7), 1525-1536 34 Young K.J., Byung H.K., Geunhwa J (2019), Antifungal activity of silver ions and nanoparticles on phytopathogenic fungi, University of Massachusetts Amherst, 93, 1037-1043 35 Hayam Abdelkader, Shrouaq Al.Z., Aisha Al.A (2019), Biosynthesis, characterization and antifungal activity of silver nanoparticles by Aspergillus niger Isolate, Journal of nanotechnology research, 1(1), 23-36 36 Sang W.K., Jin H.J., Kabir L., Yun S.K., Ji S.M., Youn S.L (2012), Antifungal effects of silver nanoparticles (AgNPs) against various plant pathogenic fungi, Journal Mycobiology, 40(1), 53-58 37 Kabir Lamsal, Sang W.K., Hee J., Yun S.K., Kyoung S.K., Youn S.L (2011), Inhibition effects of silver nanoparticles against powdery Mildews on cucumber and pumpkin, Journal Mycobiology, 39(1), 26-32 38 Weria W., Jahanshir A., Saadi S., Somaieh H., Shima Y., Paul C.S (2019), Nano silver-encapsulations of Thymus daenensis and Anethum graveolens essential oils enhances antifungal potential against strawberry anthracnose, Industrial Crops and Products, 141, 111808 39 Mafune F., Kohno J., Takeda Y., Kondow T., Sawabe H (2000), Structure and Stability of silver Nanoparticles in Aqueous Solution Producted by Laser Ablation, The journal of Physical Chemistry, 104(35), 8333-8337 40 Rajendiran R., Jegadeeshkumar D., Sureshkumar B.T., Nisha T (2010), In vitro assessment of antagonistic activity of Trichoderma viride against post harvest pathogens, Journal of Agricultural Technology, 6(1), 31-35 41 Ali A (2006) Anthracnose incidence, biochemical changes, postharvest quality and gas exchange of chitosan – coated papaya Unpublished doctoral dissertation, Universiti Putra Malaysia 42 Gautam A.K., Bhadauria R (2012), Characterization of Aspergillus species associated with commercially stored triphala powder, African Journal of Biotechnology, 11(104), 16814-16823 46 43 Hayam Abdelkader, Shrouaq Al.Z., Aisha Al.A (2019), Biosynthesis, Characterization and antifungal activity of silver nanoparticles by Aspergillus niger Isolate, Journal of Nanotechnology research, 1(1), 23-36 44 Kim S.W., Jin H.J., Kabir L., Yun S.K., Ji S.M., Youn S.L (2012), Antifungal effects of silver nanoparticles (AgNPs) against various plant pathogenic fungi, Mycobiology, 40(1), 53-58 45 Kabir Lamsal, Sang W.K., Jin H.J., Yun S.K., Kyong S.K., Youn S.L (2011), Application of silver nanoparticles for the control of Colletotrichum species in vitro and pepper anthracnose disease in field, Mycobiology, 39(3), 194-199 46 Karla, P.B., Guilherme F.R., Patricia C.S., Admilton G., Oliveira J., Nelson D., Gerson N., Marcia C.F., Ricardo S.A., Luciano A.P (2019), Antifungal activity of silver nanoparticles and simvastatin against toxigenic species of Aspergillus, International Journal of Foof Microbiology, 291, 79-86 47 Xia Z.K., Ma Q.H., Li S.Y., Zhang D.Q., Cong L., Tian Y.L., Yang R.Y (2016), The antifungal effect of silver nanoparticles on Trichosporon asahii, Journal of Microbiology, Immunology and infection, 49(2), 182-188 48 Abdallah M.E., Mohamed A.Y., Shaban R.S., Syed F.A., Khaled M.E., Marwa B., Mujeed K (2015), Antifungal silver nanoparticles: systhesis, characterizationand biological evaluation, Journal of Biotechnological equipment, 30(1), 56-65 III TÀI LIỆU TỪ INTERNET 49 http://ydvn.net/contents/view/10929.ky-thuat-trong-va-cham-soc-hanhtam.html 50 Nông nghiệp 24 bệnh mốc đen củ hành 47 Phần PHỤ LỤC Phụ lục Chuẩn bị môi trường PDA PDB Môi trường bao gồm: Dịch chiết khoai tây, đường glucose agar Khoai tây loại bỏ vỏ, rửa cắt nhỏ Cân lượng khoai tây cần thiết cho vào nước cất đun sôi 30 phút thu lấy dịch chiết Thể tích nước cất cho vào thể tích mơi trường cần thiết, thể tích nước chiết chưa đủ bổ sung thêm nước cất Dịch chiết thu đem khuấy với đường glucose agar tương ứng Sau đó, mơi trường PDA tiệt trùng trước sử dụng - Mơi trường PDA full (1 lít) + 250g khoai tây + 20g glucose + 15g agar - Môi trường PDA ½ (1 lít) + 125g khoai tây + 10g glucose + 15g agar - Mơi trường PDA 1/5 (1 lít) + 50g khoai tây + 4g glucose + 15g agar Môi trường PDB chuẩn bị tương tự môi trường PDA, nhiên khơng có bổ sung agar 48 Phụ lục 2: Phương pháp làm mẫu nấm Giai đoạn cuối việc giám định nấm gây bệnh việc làm mẫu nấm Chỉ bào tử đỉnh sinh trưởng sợi nấm cấy sang môi trường để đảm bảo nấm cấy hoàn toàn Cấy đơn bào tử: Khử trùng que cấy Tạo dung dịch bào tử cách dùng que cấy lấy lượng nhỏ sợi nấm mặt thạch có lẫn bào tử lấy chút bào tử từ khối bào tử lớn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng Lắc ống nghiệm để phân tán bào tử kiểm tra mật độ bào tử cách quan sát ống nghiệm trước ánh sáng kiểm tra giọt dịch bào tử kính lúp Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử cao Bằng kinh nghiệm, mật độ bào tử đánh giá mắt thường nhìn ống nghiệm Làm lỗng với nước vơ trùng cần Đổ dịch bào tử vào đĩa peptri có chứa lớp mỏng mơi trường thạch Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa peptri Một số bào tử nằm lại mặt thạch Để dựng đĩa peptri khoảng 18 bào tử nảy mầm Kiểm tra đĩa peptri kính lúp soi với nguồn sáng phía Dùng que cấy đẹp cắt lấy bào tử nảy mầm chuyển sang đĩa môi trường 49 Phụ lục 3: Thao tác đo đường kính tản nấm (a) (b) Chú thích: (a) Thước panme (b) Đo đường kính tản nấm thước panme 50 Phụ lục 4: Phương pháp xác định sinh khối khô nấm Tiến hành nuôi cấy dạng tĩnh mơi trường ½ PDB chai thủy tinh Nano bạc dùng với nồng độ khác lặp lại lần với CT: CT (0%), CT II (20 ppm), CT III (40 ppm), CT IV (60 ppm), CT V (80 ppm) Dùng dao cắt tản nấm có kích thước mm sau nuôi cấy ngày 28°C Sau dung dao kẹp nhẹ nhàng đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường Tiến hành ủ 28°C ngày, sau thu sinh khối cách loại bỏ dịch, cho vào tủ sấy sấy 55°C khối lượng không đổi (a) (b) Chú thích: (a) Lọc để thu sinh khối nấm tươi (b) Cho vào tủ sấy 51 Phụ lục 5: Phương pháp cấy chuyền (a) (b) (d) (c) (e) Chú thích: (a) Chuẩn bị mơi trường dụng cụ (b) Dùng dao cắt thạch từ tản nấm gốc (c) Cấy chyền sang môi trường (d) Dùng màng bao thực phẩm để bao đĩa nấm cấy (e) Cho vào bì theo dõi 52 Phụ lục 6: Một số hình ảnh q trình làm thí nghiệm (a) (b) (c) Chú thích: (a) Dùng kính hiển vi để soi bào tử (b) Dùng giấy lọc để thu sinh khối nấm (c) Cho phần sinh khối giấy lọc vào tủ sấy 53 Phụ lục 7: Một số thiết bị dùng phịng thí nghiệm (a) (b) (c) Chú thích: (a) Cân (b) Tủ sấy (c) Nồi hấp tiệt trùng 54 Phụ lục Phụ lục thống kê 8.1 Ảnh hưởng nano bạc đến đường kính tản nấm A niger M02 - So sánh đường kính tản nấm sau ngày theo dõi SAU_2NGAY Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 8200 1.4900 1.8433 2.3667 2.8433 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 - So sánh đường kính tản nấm sau ngày theo dõi SAU_4NGAY Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 1.2900 2.1867 2.8467 3.3833 3.9567 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 55 - So sánh đường kính tản nấm sau ngày theo dõi SAU_6NGAY Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 1.6167 2.6333 3.5367 4.0167 4.8300 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 - So sánh đường kính tản nấm sau ngày theo dõi SAU_8NGAY Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 2.0733 3.1167 4.1767 4.9767 5.7400 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 - So sánh đường kính tản nấm sau 10 ngày theo dõi SAU_10NGAY Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 2.3233 3.3833 5.1233 6.2300 7.5167 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 56 8.2 Ảnh hưởng nano bạc đến khối lượng sinh khối nấm A niger môi trường PDB - Khối lượng sinh khối khô sau ngày Sinh_khoi_kho Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 0567 0933 1367 1800 2900 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 8.3 Ảnh hưởng nano bạc đến nảy mầm bào tử nấm - So sánh tỷ lệ nảy mầm bào tử sau 12 quan sát Ty_le_nay_mam Tukey HSD CONG_THUC N Subset for alpha = 0.05 80 ppm 60 ppm 40 ppm 20 ppm ?C Sig 18.6667 36.3333 60.6667 78.6667 100.0000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 57