Quá trình phiên mã

Sinh học phân tử_Nhóm 11 BÀI 6: Q TRÌNH PHIÊN MÃ I Một số đặc điểm trình phiên mã prokaryote: Enzyme RNA polymerase prokaryote: - Tế bào prokaryote chứa loại RNA polymerase Enzyme cấu tạo năm tiểu đơn vị, gồm hai tiểu đơn vị α tiểu đơn vị β, β’, ω Các tiểu đơn vị liên kết với để tạo thành enzyme lõi - Người ta làm thí nghiệm tinh enzyme lõi từ tế bào vi khuẩn cho vào dung dịch chứa DNA vi khuẩn ribonucleotide enzyme gắn với DNA tổng hợp RNA Tuy nhiên, RNA thu thí nghiệm khơng giống với RNA tế bào enzyme gắn vào vị trí khơng thích hợp DNA Nếu cho thêm loại polypeptide tinh gọi yếu tố σ trước enzyme gắn với DNA phiên mã bắt đầu vị trí xác tế bào - Việc gắn yếu tố σ vào enzyme lõi làm tăng lực enzyme với vị trí khởi động DNA, đồng thời làm giảm lực vùng khác Khi enzyme lõi gắn thêm yếu tố σ trở thành dạng holoenzyme Promoter gene prokaryote: - Promoter gene vi khuẩn nằm trước vị trí khởi đầu phiên mã Bằng cách phân tích trình tự DNA số lượng lớn gene vi khuẩn, người ta nhận thấy có hai đoạn ngắn tương đối giống gene gene khác, đoạn gồm sáu nucleotide Đoạn thứ nằm cách vị trí khởi đầu khoảng 35 bp, biến đổi trình tự TTGACA Đoạn thứ hai nằm cách vị trí khởi đầu khoảng 10 bp, biến đổi trình tự TATAAT Chúng gọi vùng 35 vùng -10 (hộp Pribnow) - Đối với promoter mạnh (ví dụ gen mã hóa rRNA), người ta cịn tìm thấy yếu tố UP làm tăng gắn RNA polymerase vào DNA Có số promoter thiếu vùng -35 thay yếu tố -10 mở rộng, bao gồm vùng -10 chuẩn thêm đoạn ngắn đầu 5’ (ví dụ gene gal E coli) - Yếu tố σ nhận dạng vùng -35 -0 yếu tố -10 mở rộng nhờ cấu trúc đặc biệt chúng Riêng yếu tố UP không nhận dạng σ mà nhận dạng = vùng đầu C tận tiểu đơn vị α, gọi α CTD (carboxyl terminal domain) Vai trò enzyme RNA polymerase promoter trình phiên mã - Khi khởi đầu phiên mã, RNA polymerase gắn với DNA vùng -35 cách lỏng lẻo tạo thành phức hợp đóng Sau đó, enzyme gắn vào promoter chặt phức hợp chuyển sang trạng thái mở Một vùng DNA mở xoắn nằm hai vị trí -11 +3, nghĩa bao gồm vị trí bắt đầu phiên mã +1 Sợi đơn DNA làm khuôn mẫu bộc lộ để sinh tổng hợp RNA - Một RNA polymerase tổng hợp 10 nucleotide (sau lần khởi đầu) yếu tố σ rời khỏi enzyme đến gắn vào promoter khác để khởi đầu trình phiên mã Sự tách rời yếu tố σ cho phép hình thành kênh mà thơng qua phần RNA tổng hợp chui khỏi enzyme kéo dài (Hình 1) Sinh học phân tử_Nhóm 11 Hình Các giai đoạn phiên mã prokaryote Tín hiệu kết thúc: Tín hiệu kết thúc trình tự DNA có vai trị thúc đẩy tách RNA polymerase khỏi DNA giải phóng chuỗi RNA tổng hợp Ở vi khuẩn, có hai loại tín hiệu kết thúc tín hiệu kết thúc khơng phụ thuộc Rho tín hiệu kết thúc phụ thuộc Rho 4.1 Tín hiệu kết thúc khơng phụ thuộc Rho: - Đó cấu trúc đặc biệt bao gồm hai trình tự đối xứng bổ sung giàu GC, sau loạt adenine (chúng phiên mã thành uracil) Những trình tự không ảnh hưởng đến RNA polymerase sau chúng phiên mã Khi trình tự đối xứng bổ sung RNA bắt cặp với tạo nên cấu trúc hình kẹp tóc (Hình 2) Cấu trúc kẹp tóc phá vỡ phức hợp kéo dài cách thúc đẩy mở kênh thoát cho RNA RNA polymerase cách phá vỡ mối tương tác RNA-khn mẫu DNA Hình 2: Cấu trúc kẹp tóc RNA Cấu trúc kẹp tóc hoạt động hiệu theo sau loạt U Tại thời điểm cấu trúc kẹp tóc hình thành, chuỗi RNA phát triển giữ khuôn mẫu liên kết A-U Vì liên kết A-U yếu G-C nên chúng dễ dàng bị phá vỡ hiệu cấu trúc kẹp tóc, RNA dễ dàng giải phóng Sinh học phân tử_Nhóm 11 4.2 Tín hiệu kết thúc phụ thuộc Rho: - Tín hiệu thành phần RNA mà muốn hoạt động, địi hỏi phải có yếu tố Rho Yếu tố Rho protein hình nhẫn (ở E coli có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa) gồm sáu tiểu đơn vị giống hệt Yếu tố có hoạt tính ATPase: gắn vào sản phẩm phiên mã, sử dụng lượng từ thủy phân ATP để kéo RNA khỏi khuôn mẫu polymerase - Yếu tố Rho điều khiển phân tử RNA đặc biệt nhờ tính đặc hiệu Thứ tính đặc hiệu vị trí gắn, đoạn khoảng 40 nucleotide mà không gấp lại thành cấu trúc bậc hai, chúng thường giàu C Tính đặc hiệu thứ hai yếu tố Rho giảm gắn với sản phẩm phiên mã dịch mã (nghĩa sản phẩm gắn ribosome) Ở vi khuẩn, phiên mã dịch mã song hành chặt chẽ: dịch mã khởi phát RNA tổng hợp kể từ RNA bắt đầu chui khỏi RNA polymerase Vì Rho kết thúc sản phẩm phiên mã đầu tận gen operon Sinh học phân tử_Nhóm 11 II Các giai đoạn trình phiên mã: *Giai đoạn khởi động: • RNA pol nhận biết trình tự khởi động (promotor) DNA nhờ tiểu đơn vị σ • RNA pol gắn cách lỏng lẻo vào trình tự 35 hình thành phức hợp “đóng” • Phức hợp “đóng” chuyển sang “mở”, vùng DNA từ trình tự -10 tháo xoắn, sợi đơn DNA dạng tự làm khn cho q trình tổng hợp RNA *Giai đoạn khởi đấu phiên mã Sự nhận biết promoter nhân tố σ; Phức hợp đóng; Phức hợp mở UV5 lac promoter gồm hai trình tự nucleotide vùng -35 vùng -10 *Giai đoạn kéo dài • Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng nucleotide, nhân tố σ tách khỏi phức hợp enzyme • Nhân tố σ thay nhân tố kéo dài (EF) • RNA pol tháo xoắn liên tục phân tử DNA chiều dài khoảng 17 nu • Sợi RNA tách dần khỏi mạch khn trừ đoạn khoảng 12 nu tính từ điểm tăng trưởng liên kết với DNA • Phần DNA tháo xoắn RNA pol xoắn lại Sinh học phân tử_Nhóm 11 * Giai đoạn kết thúc: • Khi RNA pol gặp dấu hiệu kết thúc DNA, trình tổng hợp RNA ngừng lại • Dấu hiệu kết thúc nhân tố ρ (Rho) cấu trúc đặc biệt sợi khn (gồm hai trình tự đối xứng bổ sung, trình tự gồm adenin) Nhân tố ρ protein gồm tiểu đơn vị, có chức tách enzyme RNA khỏi khn DNA • RNA phiên mã từ vùng cấu trúc đặc biệt hình thành cấu trúc kẹp tóc cản trở hoạt động RNA pol * Dấu hiệu kết thúc phiên mã vi khuẩn: Sự kết thúc phiên mã phụ thuộc yếu tố ρ RNA nằm cuộn bên phức hợp ρ, kéo RNA khỏi RNA pol khiến RNA pol tách khỏi DNA Sinh học phân tử_Nhóm 11 III Một số đặc điểm trình phiên mã Eukaryote: Sự phiên mã tạo RNA bổ sung với sợi DNA Các ribonucleotide nối tiếp RNA xác định dựa nguyên tắc bổ sung với nucleotide DNA khuôn mẫu Khi bắt cặp xác xảy ra, ribonucleotide liên kết đồng hóa trị với chuỗi RNA hình thành nhờ phản ứng có enzyme xúc tác Như vậy, sản phẩm phiên mã kéo dài ribonucleotide bổ sung xác với sợi DNA dùng làm khn mẫu Q trình phiên mã dù có tính xác cao nhiều so với trình tái DNA (tỷ lệ mắc lỗi 1/10.000 nucleotide so với 1/10.000.000 tái bản) Đó thiếu chế sửa sai hữu hiệu, trình tổng hợp RNA có hai dạng sửa sai tồn Tuy nhiên, RNA phiên mã khơng chép lại nên sai sót xảy khơng ảnh hưởng đến việc truyền đạt thông tin cho hệ sau Sự phiên mã phản ứng enzyme Những enzyme chịu trách nhiệm cho trình phiên mã tế bào prokaryote eukaryote gọi RNA polymerase phụ thuộc DNA (DNA-dependent RNA polymerase), gọi tắt RNA polymerase RNA polymerase xúc tác hình thành cầu nối phospho-diester để nối ribonucleotide thành chuỗi thẳng Enzyme dịch chuyển bước dọc theo DNA khuôn mẫu kéo dài chuỗi RNA theo hướng từ 5’3’, nghĩa ribonucleotide thêm vào đầu 3’ chuỗi RNA hình thành Các chất sử dụng để tổng hợp RNA ATP, GTP, CTP UTP Cũng giống tái DNA, lượng cho phản ứng cung cấp từ thủy phân cầu nối giàu lượng chất nói Sự phiên mã chép chọn lọc số phần genome tạo nhiều Sự lựa chọn vùng để phiên mã xảy ngẫu nhiên Mỗi vùng phiên mã điển hình bao gồm nhiều gen, có trình tự DNA đặc hiệu hướng dẫn khởi đầu kết thúc phiên mã Đối với vùng chọn phiên mã, có đến hàng trăm chí nghìn RNA tạo Sự tổng hợp phân tử RNA sau bắt đầu trước phân tử RNA trước hoàn thành Từ gen đơn độc, vịng tổng hợp nghìn phân tử RNA (đối với eukaryote) Sự lựa chọn vùng để phiên mã mức độ phiên mã điều hòa Vì vậy, tế bào khác tế bào thời điểm khác có nhóm gen khác phiên mã Chỉ hai sợi đơn phân tử DNA dùng làm khuôn mẫu Việc gắn RNA polymerase vào promoter gen định việc lựa chọn sợi hai sợi đơn DNA làm khn mẫu Promoter, ngồi việc mang vị trí gắn RNA polymerase cịn chứa đựng thơng tin xác định sợi hai sợi đơn DNA phiên mã xác định vị trí bắt đầu phiên mã Sự phiên mã khởi phát không cần mồi RNA polymerase khởi đầu tổng hợp RNA khuôn mẫu DNA mà không cần mồi DNA polymerase Điều đòi hỏi ribonucleotide mang đến vị trí bắt đầu phiên mã phải giữ ổn định DNA khuôn mẫu ribonucleotide thứ hai đưa đến để xảy phản ứng trùng hợp Sinh học phân tử_Nhóm 11 IV Cấu trúc gene mã hóa protein tế bào Eukaryote: Cấu trúc gen mã hóa cho protein eukaryote bao gồm vùng sau: Vùng 5’ kiểm soát biểu gene Vùng bao gồm trình tự nucleotide điều hịa biểu gen hoạt hóa phiên mã, bao gồm - Promoter: Là trình tự định vị đầu 5’ khơng dịch mã gen có chức xác định vị trí bắt đầu phiên mã, kiểm sốt số lượng mRNA đơi tính đặc hiệu mơ (tissuespecific) Promoter dài đến vài nghìn bp Vùng thường chứa trình tự bảo thủ gọi hộp TATA nằm cách vị trí phiên mã khoảng 25-30 bp Hộp giúp xác định xác vị trí bắt đầu phiên mã Ngồi ra, cịn có hộp CCAAT nằm cách vị trí bắt đầu phiên mã khoảng 75-80 bp Hộp phổ biến hộp TATA, có chức tăng hiệu phiên mã Một số gen “quản gia” mã hóa cho enzyme diện tất tế bào thường thiếu hai hộp promoter giàu GC Ngoài ra, cịn có thành phần đặc hiệu khác - Vị trí gắn vùng đặc hiệu mơ: Là trình tự DNA tương tác với protein đặc hiệu mô để huy gen cấu trúc sản xuất protein đặc hiệu mơ - Vị trí gắn với vùng tăng cường phiên mã (enhancer): Còn gọi gen tăng cường, trình tự DNA gắn với tác nhân hoạt hóa để kích thích phiên mã gen kề bên , chúng tác động qua khoảng cách xa tác động theo hai phía (từ 5’ 3’) 1.2 Vùng phiên mã Bao gồm exon intron nằm xen kẽ Đây đặc điểm để phân biệt với gen prokaryote Các exon intron phiên mã có exon dịch mã Các intron bắt đầu GT kết thúc AG Các intron chiếm phần lớn gen chúng loại bỏ khỏi RNA tổng hợp, exon nối với để tạo nên mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA) Ở hai đầu vùng phiên mã (coding region) cịn có vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslation region) vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation region) Vùng 5’ không dịch mã tính từ vị trí bắt đầu phiên mã codon khởi đầu ATG Vùng 3’ không dịch mã codon kết thúc đến vị trí gắn đuôi poly(A) 1.3 Vùng 3’ không dịch mã Chức chưa rõ, số gen vùng mang trình tự điều hịa chun biệt  Giáo trình di truyền học chương 11 Sinh học phân tử_Nhóm 11 V Các giai đoạn trình phiên mã Eukaryote: RNA polymerase II phức hợp đa protein giúp phiên mã DNA thành tiền chất mRNA Promoter (vùng khởi động lõi gen ) dài khoảng 40 nucleotide , Promoter trình tự định vị đầu 5’ khơng dịch mã gen có chức xác định vị trí bắt đầu phiên mã, kiểm sốt số lượng mRNA đơi tính đặc hiệu mơ (tissue-specific) Promoter dài đến vài nghìn bp TATA chuỗi DNA tìm thấy vùng khởi động lõi gene, hộp TATA nằm cách vị trí phiên mã khoảng 25-30 bp Hộp giúp xác định xác vị trí bắt đầu phiên mã TBP (TATA Binding Protein) tiểu đơn vị nhân tố phiên mã sinh vật nhân thực TFIID Transcription factor (TF) yếu tố phiên mã protein tham gia vào trình chuyển đổi phiên mã DNA thành RNA Các yếu tố phiên mã bao gồm số lượng lớn protein, ngoại trừ RNA polymerase, khởi tạo điều hịa q trình phiên mã gen Elongation factor TF tham gia vào trình kéo dài DSIF, ELL, Elongin (SIII) TF II S Các giai đọan trình phiên mã: Sinh học phân tử_Nhóm 11 - Khởi đầu (initiation): Có protein tham gia Basal transcription factor : TF II A, TF II B, TF II D, TF II E, TF II F, TF II H RNA Polymerase II , RNA polymerase có cấu trúc CTD ( carboxy-terminal domain) • RNA pol II bắt đầu hoạt động phiên mã nhờ nhiều nhân tố phiên mã (transcription factor, TF) có chất protein • TBP bám vào TATA, TFIID nhận biết gắn vào trình tự TATA (nếu khơng có hộp TATA TF II D bám vào vùng core promotor) • Sau nhân tố TFIIA gắn vào TFIID (nó cung cấp tính ổn định cho liên kết TATA box TF II D) • TFIIB gắn với phức hợp TFIID-TFIIA • RNA pol II liên kết với TF II F, TF II F mang RNA polymerase II đến vùng core promoter để gắn với phức hợp • Sau TF II E đến gắn vào để tăng tính ổn định cho chế phiên mã Nhân tố TFIIE cho phép khởi động phiên mã • TF II H đến gắn vào sau (TF II H có tác dụng tháo xoắn DNA sợi đơi photphoryl hóa axit amin serine có CTD RNA polymerase II) • Một phân tử ATP cung cấp lượng đến tách mạch DNA, phức hợp “mở” Sinh học phân tử_Nhóm 11 - Kéo dài (elongation): RNA Polymerase II sau photphoryl hóa để di chuyển sợi DNA khuôn mẫu để tiến hành phiên mã, hầu hết TF (nhân tố phiên mã) tự loại bỏ q trình có TF II F bám vào RNA Pol II trình RNA Polymerase II di chuyển sợi khuôn gặp checkpoints phải tạm dừng từ vài giây vài phút Các Transcription elongation factor giúp chúng di chuyển DSIF giúp khóa RNA Polymerase II để phức hợp không bị phân tách ELL, elongin (SIII), TF II S loại bỏ trạng thái đừng tạm thời checkpoints Phân tử RNA tổng hợp từ mạch khuôn DNA nhờ nhân tố TF II S theo chiều 5’ đến 3’ (tốc độ phiên mã đoạn DNA khác TF II S giúp tăng tốc độ vùng chậm) - Kết thúc (termination) Sự phiên mã kết thúc trước điểm gắn polyA xa, có liên quan đến cấu trúc “kẹp tóc” theo sau trình tự giàu GC - Quá trình trưởng thành tiền mRNA: • Gắn mũ chụp (capping) bước 7-methyl guanin gắn vào đầu 5’ mRNA qua liên kết 5’-5’ triphosphate • Gắn polyA: mRNA bị cắt bỏ khoảng 20 nu nằm trước trình tự AAUAAA PolyA polymerase gắn lượng adenin định vào đầu 3’ mRNA Protein PABP gắn vào đuôi polyA giúp ổn định mRNA liên quan đến việc khởi đầu dịch mã Sinh học phân tử_Nhóm 11 Sinh học phân tử_Nhóm 11 • Quá trình ghép nối (splicing) Quá trình loại bỏ intron nối exon lại với Quá trình ghép nối RNA (RNA splicing) • Được điều khiển trình tự đặc biệt (vị trí cắt) vùng nối intron – exon • Ba trình tự vùng intron có vai trị quan trọng: trình tự GU đầu 5’ intron, trình tự “tẻ nhánh” giàu base pyrimidine bao quanh A gần đầu 3’, trình tự nhận AG đầu 3’ • lớp intron chủ yếu nhận biết dựa vào chế cắt: nhóm intron tự xúc tác (autocatalytic) I II, tRNA và/hoặc archael intron, spliceosomal intron • mRNA cắt exon đầu 5’ intron • Một liên kết 5’-3’ hình thành guanylate đầu 5’ intron với adenylate nằm gần đầu 3’ intron tạo cấu trúc thòng lọng • Điểm nối exon đầu 3’ intron cắt rời, intron bi loại exon nối lại hình thành mRNA trưởng thành • mRNA trưởng thành (hoạt động) tế bào chất thông qua lỗ màng nhân để tham gia trình dịch mã Sinh học phân tử_Nhóm 11 VI Q trình ghép nối RNA: Sự ghép nối RNA có liên quan đến việc sản xuất protein khác thông qua tái hợp exon theo kiểu khác Ghép RNA: - Ghép RNA đề cập đến giai đoạn ban đầu sửa đổi sau phiên mã biểu gen sinh vật nhân chuẩn, điều khiển trình tự đặc biệt (vị trí cắt) vùng nối intron – exon - Bản ban đầu tạo phiên mã gen gọi pre-mRNA Nó bao gồm exon intron Các intron loại bỏ khỏi pre-mRNA cách ghép exon trước dịch Sự ghép nối exon xúc tác phức hợp phân tử gọi spliceosome - Ba trình tự vùng intron có vai trị quan trọng: trình tự GU đầu 5’ intron, trình tự “tẻ nhánh” giàu base pyrimidine bao quanh A gần đầu 3’, trình tự nhận AG đầu 3’ - lớp intron chủ yếu nhận biết dựa vào chế cắt: nhóm intron tự xúc tác (autocatalytic) I II, tRNA và/hoặc archael intron, spliceosomal intron Quá trình ghép nối RNA gồm bước: - mRNA cắt exon đầu 5’ intron - Một liên kết 5’-3’ hình thành guanylate đầu 5’ intron với adenylate nằm gần đầu 3’ intron tạo cấu trúc thòng lọng - Điểm nối exon đầu 3’ intron cắt rời, intron bi loại exon nối lại hình thành mRNA trưởng thành - mRNA trưởng thành (hoạt động) tế bào chất thông qua lỗ màng nhân để tham gia trình dịch mã Intron nhóm I có gen nhân, ty thể rRNA lục lạp Intron nhóm II có gen ty thể, mRNA lục lạp Sinh học phân tử_Nhóm 11 http://www.sinhhocphantu.org/2018/06/phien-ma.html https://www.sinhhocphantu.org/2018/06/phien-ma.html#:~:text=Qu%C3%A1%20tr %C3%ACnh%20phi%C3%AAn%20m%C3%A3%20%E1%BB%9F%20eukaryote&text= %2D%20Promoter.,d%C3%A0i%20%C4%91%E1%BA%BFn%20v%C3%A0i%20ngh %C3%ACn%20bp https://www2.hcmuaf.edu.vn/data/nhtri/Chuong%204%20Su%20phien%20ma%20o %20Prokaryote.pdf? fbclid=IwAR3NyBSN3DXGjEArk3V5rAhEO04norNP4ZgmQWFfBmMRlWYQTotEOr4n3 Ss https://www.sinhhocphantu.org/2018/06/phien-ma.html? fbclid=IwAR20HMutaJjjFWj5UAaEX8syr1zdWgrxXfUS71Tsk7iiHwJYG3fT6UjzNeg#:~:te xt=Qu%C3%A1%20tr%C3%ACnh%20phi%C3%AAn%20m%C3%A3%20%E1%BB%9F %20eukaryote&text=%2D%20Promoter.,d%C3%A0i%20%C4%91%E1%BA%BFn%20v %C3%A0i%20ngh%C3%ACn%20bp https://www.nature.com/scitable/definition/transcription-factor-167/#:~:text=Transcription %20factors%20are%20proteins%20involved,regulate%20the%20transcription%20of %20genes https://www.youtube.com/watch?v=EMDuf_kBJcs&t=197s https://www.youtube.com/watch?v=oZZMXv19PEU