Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (ha) tái tổ hợp của virus cúm ah5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Vũ Huyền Trang GS TS Lê Thanh Hoà Hà Nội – 2021 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo, TS Vũ Huyền Trang và GS.TS Lê Thanh Hoà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực và hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, PGS TS Phạm Bích Ngọc, Ths Hồ Thị Thương, ThS Nguyễn Thu Giang, KTV Trần Thị Loan cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, hỗ trợ kinh phí, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi suốt thời gian thực và hoàn thành luận án Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Udo Conrad, TS Phan Trọng Hoàng, Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật (IPK) CHLB Đức đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi suốt thời gian thực tập tại Viện IPK như thời gian tôi học tập tại Việt Nam Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Xuân Hạnh Công ty CP thuốc thú y Ttrung ương NAVETCO đã giúp đỡ tôi thực thành công các thí nghiệm công cường độc gà Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài Nghị định thư mã số NĐT.07.GER.15 và Bộ giáo dục và nghiên cứu CHLB Đức với đề tài “Plantfluvac” mã số 031A283 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực nghiên cứu luận án này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi quá trình học tập và bảo vệ luận án Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi suốt quá trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân năm 2021 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày luận án là trung thực, đã được công bố các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh năm 2021 iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG .vii DANH MỤC CÁC HÌNH .viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án .1 Mục tiêu nghiên cứu luận án Các nội dung nghiên cứu luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Virus cúm A/H5N1 1.1.1 Phân loại đặc tính của virus cúm A/H5N1 1.1.2 Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A .6 1.1.3 Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin 1.1.4 Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1 .13 1.2 Bệnh cúm gia cầm 16 1.2.1 Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 thế giới .16 1.2.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 Việt Nam .17 1.3 Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm 22 1.3.1 Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm thế giới .23 1.3.2 Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam 24 1.3.3 Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng 27 1.3.4 Nghiên cứu vaccine từ thực vật 29 1.3.5 Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá .33 1.3.6 Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá .34 1.4 Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration) 36 1.4.1 Nguyên lý 36 1.4.2 Ứng dụng agroinfiltration nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thế giới 37 1.4.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration Việt Nam .40 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .44 2.1 Vật liệu 44 2.1.1 Nguồn vật liệu thực vật 44 iv 2.1.2 Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen 44 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng 45 2.1.4 Nguồn vật liệu động vật 45 2.1.5 Hóa chất 45 2.1.6 Thiết bị .45 2.1.7 Môi trường và đệm 46 2.2 Phương pháp 46 2.2.1 Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1 46 2.2.2 Phương pháp sử dụng thiết kế cấu trúc vector biểu thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 cây thuốc lá 48 2.2.3 Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp 55 2.2.4 Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp động vật thí nghiệm 57 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 62 3.1 Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA chủng virus cúm A/H5N1 62 3.1.1 Thu thập và phân loại trình tự HA theo năm 62 3.1.2 Phân tích đởi mã gen và tởng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 cơ sở trình tự đã biến đổi .63 3.1.3 Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm 67 3.1.4 Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide .71 3.1.5 Phân tích so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn nghiên cứu 72 3.2 Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA đánh giá biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1 trên thuốc 74 3.2.1 Thiết kế vector biểu kháng nguyên HA trimer 76 3.2.2 Thiết kế vector biểu kháng nguyên HA oligomer ELP 79 3.2.3 Thiết kế vector biểu kháng nguyên HA oligomer TP 82 3.2.4 Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu kháng nguyên HA cây thuốc lá .84 3.2.5 Đánh giá sự biểu các kháng nguyên HA tái tổ hợp dịch chiết thô thuốc lá .91 3.2.6 Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA dịch chiết thô lá thuốc 92 3.3 Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hố hoạt tính ngưng kết hồng v cầu kháng nguyên HA tái tổ hợp 94 3.3.1 Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá mITC 94 3.3.2 Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP IMAC 98 3.3.3 Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch .100 3.4 Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 103 3.4.1 Miễn dịch chuột thí nghiệm 103 3.4.2 Miễn dịch gà thí nghiệm 110 Chương THẢO LUẬN .122 4.1 Lựa chọn gen HA yếu tố quan trọng nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 Việt Nam .122 4.2 HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường biểu hiện protein thực vật, đơn giản hoá tinh khơng làm tăng cường hoạt tính sinh học HA trimer .125 4.3 HA COBRA kích thích tạo kháng thể trung hồ phổ rộng trên động vật thí nghiệm .127 4.4 HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật 128 4.5 Dịch chiết thô thuốc chứa kháng nguyên HA oligomer TP sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 132 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC P1 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp base pair BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA ethylene diamine tetra-acetate acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELP elastin-like polypeptides EtBr ethidium bromide FAO The Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin HI hemagglutinin inhibition IMAC Immobilized metal ion chromatography kb kilobase kDa kilodalton LB Luria and Bertani mITC membrane-based inverse transition cycling OD optical density OIE The World Organisation for Animal Health PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC size exclusion chromatography TAE tris acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase v/p vòng/phút WHO World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các gốc amino acid các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác 11 Bảng 1.2 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine 23 Bảng 1.3 Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất từ thực vật thử nghiệm lâm sàng có mặt thị trường 30 Bảng 2.1 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu 45 Bảng 3.1 Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh gia cầm Việt Nam 63 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 1.1; 1.1.1 1.1.2 68 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 2.3.2.1, 2.3.2.1a, b c 69 Bảng 3.4 Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo 75 Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP 98 Bảng 3.6 Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu và đánh giá hoạt tính của các kháng nguyên HA tái tổ hợp 120 Bảng 4.1 Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA 124 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8] Hình 1.2 Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép 10 Hình 1.3 Dòng thời gian xuất các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của gen HA Việt Nam [1] 18 Hình 1.4 Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy các năm 2006 đến 2014 dựa vào số liệu được báo cáo OIE 19 Hình 1.5 Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy các năm 2015 đến 2017 dựa vào số liệu được báo cáo OIE 20 Hình 1.6 Bản đồ các ổ dịch cúm gia cầm xảy các năm 2018 đến 11/09/2020 dựa vào số liệu được báo cáo OIE 21 Hình 1.7 Sơ đồ dạng lục thể IgM (A) và dạng đơn tiểu đơn vị (B) .35 Hình 1.8 Quy mô thương mại N benthamiana tăng trưởng (A) và khử trùng (B) 39 Hình 1.9 Quy trình sản xuất virus cúm mùa tại công ty Medicago, Canada 40 Hình 2.1 Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm cơ bản nghiên cứu 46 Hình 2.2 Hình ảnh cây thuốc lá thuỷ canh tuần tuổi (A) được loại bỏ bớt lá già, lá non và lá bánh tẻ trước biến nạp (B) 52 Hình 2.3 Biến nạp dịch khuẩn vào lá thuốc lá máy hút chân không .52 Hình 3.1 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5TG chủng A/duck/Vietnam/TG24-O1/05 đã được tối ưu biểu thuốc lá so với trình tự gốc 66 Hình 3.2 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5HT chủng A/duck/Vietnam/HT-O2/2014 đã được tối ưu biểu thuốc lá so với trình tự gốc 67 Hình 3.3 Mô hình thiết kế các trình tự HA COBRA (A) và hình ảnh xây dựng cây phân loại dựa vào các trình tự của kháng nguyên HA tự nhiên và nhân tạo 71 Hình 3.4 Hình ảnh biểu diễn và so sánh trình tự amino acid của kháng nguyên HA tự nhiên và HA nhân tạo 73 Hình 3.5 Các loại cassette biểu kháng nguyên HA thực vật 75 Hình 3.6 Mô hình thiết kế vector biểu protein H5TG trimer thực vật 76 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen H5TG (A) và sản phẩm cắt vector tách dòng pRTRA_H5TG trimer enzyme BamHI PspOMI (B) 77 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu kháng nguyên HA trimer .78