(Luận văn) xây dựng phương pháp elisa gián tiếp xác định dư lượng fluoroquinolone trong sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= HẮC BÁ THÀNH lu an n va to p ie gh tn XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA d oa nl w LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ Hà Nội – 2015 an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= lu an n va XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA ie gh tn to p LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC d oa nl w Chun ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã sớ: 60 42 01 14 oi lm ul nf va an lu z at nh Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: TS NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Học viên: HẮC BÁ THÀNH z m co l gm @ an Lu Hà Nội - 2015 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN lu an n va p ie gh tn to MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU……………………………………… 1.1 Kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………………………………………… 1.1.1 Nguồn gốc phát triển kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………9 1.1.2 Phân loại chế tác dụng………………………………………………… 1.1.3 Cấu trúc, đặc điểm số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone………… 12 1.1.4 Ngƣỡng giới ̣n cho phép ở mô ̣t số thƣ̣c phẩ m…………………………… 18 1.2 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone…… 22 1.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sắc ký khối phổ (LC-MS)… 22 1.2.2 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay)………… 23 1.2.2.1 Nguyên lý phƣơng pháp ELISA………………………………………… 24 1.2.2.2 Các phản ứng ELISA…………………………………………………… 25 b ELISA gián tiếp (indirect ELISA)…………………………………………… 26 c ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)……………………………………… 28 1.2.3 Ứng dụng phƣơng pháp ELISA…………………………………………… 29 1.4 Tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni……………………………… 29 1.5 Tác hại Fluoroquinolone tồn dƣ thực phẩm……………………… 30 1.6 Tác hại Fluoroquinolone đến môi trƣờng……………………………… 31 1.5 Các nghiên cứu nƣớc sử dụng ELISA phát dƣ lƣợ ng Fluoroquilone…………………………………………………………………… 32 1.5.1 Các nghiên cứu nƣớc………………………………………………… 32 1.5.2 Các nghiên cứu nƣớc………………………………………………… 34 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………………… 36 2.1 Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………… 36 2.1.1 Dụng cụ, thiết bị…………………………………………………………… 36 2.1.2 Hoá chất…………………………………………………………………… 36 2.1.3 Các dung dịch đệm………………………………………………………… 37 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.1 Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.2 Địa điểm đối tƣợng nghiên cứu………………………………………… 38 d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN lu an n va p ie gh tn to 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.3.1 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 38 a Phƣơng pháp tổ ng hơ ̣p hapten gắ n LEV với OVA/BSA……………………… 38 b Phƣơng pháp ta ̣o kháng thể đa dòng kháng LEV thỏ…………………… 40 c Phƣơng pháp ELISA gián tiế p xác đinh ̣ dƣ lƣơ ̣ng LEV……………………… 41 2.2.3.2 Giới hạn phát nồng độ độ đặc hiệu nghiên cứu…………… 44 2.2.3.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi LEV gây nhiễm nhân tạo…………… 44 2.2.3.3 Chuẩn bị mẫu sữa………………………………………………………… 45 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………… 47 3.1 Các thông số phản ứng ELISA gián tiếp…………………………………… 48 3.2 Kết phản ứng ELISA gián tiếp………………………………………… 48 3.5 Đánh giá độ ổn định phƣơng pháp……………………………………… 55 3.6 Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV sữa……………………… 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 59 d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Giới hạn tồn dƣ tối đa các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC Ủy ban Châu Âu [16] 19 Bảng 3.1 Kết đo OD450 phiến ELISA 47 Bảng 3.2 Kết đo OD450 phiến ELISA 48 Bảng 3.3 Bảng kết hiệu suất thu hồi 53 Bảng 3.4 Kết xác định hàm lƣợng LEV các mẫu sữa……………………54 lu an DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ n va to Hình Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone gh tn Hình Cấu trúc phân tử Danofloxacin 11 ie Hình Cấu trúc phân tử Difloxacin 11 p Hình Cấu trúc phân tử Enrofloxacin 12 nl w Hình Cấu trúc phân tử Ibafloxacin 13 d oa Hình Cấu trúc phân tử Marbofloxacin 13 an lu Hình Cấu trúc phân tử Orbifloxacin 14 va Hình Cấu trúc phân tử Sarafloxacin 14 ul nf Hình Cấu trúc phân tử Levofloxacin 15 oi lm Hình 10 Sơ đồ các phản ứng ILISA…………………………………………… 23 Hình 11 Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp 25 z at nh Hình 12 Tổng hợp liên hợp LEV với OVA (LEV - OVA) 38 z Hình 13 Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh ………………………….……… 41 gm @ Hình 14 Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn 51 l Hình 15 Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn…………………………………49 m co Hình 16 Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn gốc 50 an Lu Hình 17 Cấu trúc phân tử Fluoroquinolone……………………………… 51 n va Hình 18 Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo Fluoroquinolone………………… 52 http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ELISA HPLC Enzym - Link Immuno sorbent Assay High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) Gas Chromatography/Mass Spetrometry (Sắc ký khí - khối phổ) Optical Density (Mật độ quang học) 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine Liên minh Châu Âu Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc Tổ chức y tế giới Maximum Residual Limit Food and Drug Administration Phosphate buffer saline Tween Phosphate buffer saline Standard deviation (độ lệch chuẩn) Horseradish peroxidase Quyết định Thông tƣ - Bộ nông nghiệp GC-MS lu an n va p ie gh tn to OD TMB EU FAO WHO MRLs FDA PBST PBS SD HPRO QĐ TT - BNN d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN MỞ ĐẦU Fluoroquilone là mô ̣t nhƣ̃ng nhóm kháng sinh tổ ng hơ ̣p hoá ho ̣c , có tác dụng diệt khuẩn rộng hiệu quả, có khả ức chế tiêu diệt vi khuẩn cách nhanh chóng nên kháng sinh nhóm Fluoroquilone ngày càng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhiề u phòng điều trị bệnh chăn nuôi thuỷ sản Trƣớc thực trạng nguy kiểm soát dịch bệnh chƣa thật nghiêm ngặt, dƣ lƣợng loại kháng sinh thƣờng tìm thấy nhiều sản phẩm nơng nghiệp nhƣ thịt, cá, trứng, sữa, Trong quá trình ni dƣỡng, không tuân thủ thời gian dùng thuốc thời gian sản lu an xuất chế biến dẫn đến lƣợng Fluoroquilone lại thịt, sữa, gia n va cầm thủy sản Việc lạm dụng kháng sinh Fluoroquilone phịng bệnh, tn to điều trị, kích thích sinh trƣởng hay bảo quản đối với ngành chăn nuôi dẫn đến gh tồn dƣ kháng sinh chăn ni, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến mơi p ie trƣờng sức khoẻ ngƣời tiêu dùng nl w Điều gây nhiều mối nguy hiểm, tƣợng kháng thuốc số vi d oa khuẩn nhƣ: Salmonella, Campylobaccer spp, Escherichia coli,…hậu giảm an lu hiệu kháng sinh nói chung, kháng sinh dịng Fluoroquilone nói riêng đối va với các chủng vi khuẩn Để bảo vệ ngƣời tiêu dùng châu Âu, tổ chức EU thiết ul nf lập giới hạn lớn (MRLs) đối với dƣ lƣợng thuốc kháng sinh nguồn thực oi lm phẩm cung cấp cho ngƣời vào năm 1990 Theo kiểm tra định lƣợng z at nh các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU cơng bố “Council directive 96/23/EU in 1996” [12], quy định rõ hàm lƣợng kháng sinh theo loại thực phẩm z loại thuốc, ví dụ nhƣ với Enrofloxacin cơ, gan, thận bò, lợn, gia @ gm cầm (gà, vịt) 30 µg/kg; sữa bị 100 µg/kg; Ở châu Âu, Hoa kỳ các m co l nƣớc Bắc Mỹ cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon Tồ n dƣ kháng sinh thƣ̣c phẩ m ảnh hƣởng xấ u đế n sƣ́c khoẻ cô ̣ng đồ ng an Lu môi trƣờng Đây là mô ̣t nhƣ̃ng nguyên nhân gây nên các bê ̣nh nan y , tăng n va nguy di ̣ƣ́ng, tăng khả xuấ t hiê ̣n cá c nguồ n gen kháng thuố c ở các chủng vi http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN sinh vâ ̣t gây bê ̣nh Viê ̣c tồ n dƣ kháng sinh thƣ̣c phẩ m (thịt, thuỷ hải sản , trƣ́ng, sƣ̃a,…) phổ biến nƣớc ta Tình trạng khơng chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà quan trọng ảnh hƣởng đến uy tín các sản phẩ m nông nghiê ̣p nƣớc ta, ảnh hƣởng nghiêm trọng đế n sƣ́c khoẻ ngƣời môi trƣờng Đã nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc nghiên cứu nhằm phát dƣ lƣợng kháng sinh Fluoroquilone thực phẩm nhƣ HPLC, LC-MS, GC-MS, … với độ xác cao, bên cạnh các đặc điểm ƣu việt, phƣơng pháp u cầu cao thiết bị, hóa chất, trình độ sử dụng ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) lu an phƣơng pháp miễn dịch dựa phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể n va có ứng dụng nhiều xác định dƣ lƣợng kháng sinh thực phẩm, mơi Mục đích nghiên cứu dựa các kết nghiên cứu có chúng ie gh tn to trƣờng, y học… lƣơ ̣ng kháng sinh p xây dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiế p xác đinh ̣ dƣ d oa nl w Levofloxacin sƣ̃a điề u kiê ̣n phòng thí nghiê ̣m oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh nhóm Fluoroquilone 1.1.1 Nguồn gớc và phát triển kháng sinh nhóm Fluoroquilone Quinolone (Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Difloxacin, Marbofloxacin, Ofloxacin ) nhóm kháng sinh nhân tạo gồm dẫn xuất quinolein Quinolone (acid nalidixic) có phổ kháng khuẩn hẹp (tác dụng vi khuẩn Gram âm) Kháng sinh nhóm acid lu nalidixic đƣợc phát vào năm 1962, đƣợc phân lập nhƣ tạp chất sản an xuất quinine sau loạt các quinolon hệ I đƣợc tổng hợp nhƣ cinoxacin, n va oxolinic, pipermidic…Trong cấu trúc khơng gian khơng có nhân piperidin to tn khơng có ngun tử Flour Quinolon hệ I có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng ie gh vi khuẩn gram âm (trừ Pseudomonas aeruginosa) [1,10] Hiện quinolon hệ p I nhanh chóng bị kháng thuốc nên hạn chế đƣợc sử dụng [11] oa nl w Quinolone đƣợc fluor hóa gọi Fluoroquinolone đƣợc đƣa vào sử dụng lâm sàng vào năm 1970 Fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng, d an lu tác dụng vi khuẩn Gram âm Gram dƣơng Kháng sinh nhóm phân bố nf va đồng dịch nội ngoại bào, phân bố hầu hết các quan: Phổi, gan, oi lm ul mật, xƣơng, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy qua đƣợc hàng rào thai Fluoroquinolone thải chủ yếu qua đƣờng tiết niệu dạng nguyên hoạt chất z at nh tái hấp thu thụ động thận.[1,2,10] nhóm Fluoroquilone đƣợc sử dụng y học, chăn nuôi thú y, thủy sản…[10,11] z l gm @ 1.1.2 Phân loại và chế tác dụng Fluoroquilone gốc thuốc kháng sinh hiệu quả, phổ rộng đƣợc sử dụng m co nhiều phổ biến ngƣời động vật (trong chăn nuôi gia súc, gia cầm thủy an Lu sản…) Tuy nhiên tác dụng phụ chúng đƣợc xác nhận Sử dụng quá liều n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN tồn dƣ các gốc thuốc thực phẩm vấn đề không chỉ nƣớc ta mà nhiều nƣớc giới Fluroquinolone nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có khả khuếch tán tốt mơ bào, nhanh chóng ức chế tiêu diệt vi khuẩn thông qua ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) đƣợc sử dụng phổ biến hiệu thú y Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm kháng sinh chăn ni thú y thuỷ sản có tác dụng xấu đến mơi trƣờng sức khoẻ cộng đồng (WHO, 1998) Nhóm Fluroquinolones đƣợc sử dụng thú ý gồm các loại sau: lu an Danofloxacin (Advocin, Advocid), Difloxacin (Dicural,Vetequinon), n va Enrofloxacin (Baytril), Ibafloxacin (Ibaflin), Marbofloxacin (Marbocyl, Zenequin), p ie gh tn to Orbifloxacin (Orbax, Victas), Sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin) d oa nl w an lu ul nf va Hình Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone oi lm Công thức cấu tạo chung nhóm quinolone hợp chất vịng thơm có chứa N, vị trí thứ có gắn nhóm ketone, vị trí thứ có gắn nhóm carboxylic Các dẫn xuất z at nh quinolone gồm hợp chất mà: Vị trí: Có gắn thêm nhóm alkyl aryl; Vị z trí 6: Có thể gắn thêm F; vị trí 2,6,8 gắn thêm ngun tử N [15] @ gm Cơ chế tác động Fluoroquinolone ức chế tổng hợp acid nucleic Gốc m co l quinolone (acid nalidixic các Fluoroquinolone) ức chế mạnh tổng hợp DNA giai đoạn nhân đôi ức chế enzyme DNA gyrase Cơ chế tác động hiệu an Lu vi khuẩn gram dƣơng gram âm Các quinolon ức chế tổng hợp AND - gyrase, enzym mở vòng xoắn AND, giúp cho chép phiên mã, n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 chuẩn, tiến hành pha loãng LEV gốc với các nồng độ từ 0,1 ng/l đến 1.000 ng/l Các bƣớc thí nghiệm đƣợc thực nhƣ mô tả phần vật liệu phƣơng pháp (trang 39) Kết OD450 phiến ELISA trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết đo OD450 phiến ELISA Nồng đợ LEV (ng/µl) 1000 Tín hiệu ELISA (OD450) 0,286 ± 0,03 0,306 100 0,307 ± 0,08 0,329 10 0,418 ± 0,04 0,448 0,849 ± 0,03 0,911 0,1 0,921 ± 0,06 0,988 ĐC (-) 0,932 ± 0,03 1,0 Giếng ELISA A/Ao lu an n va p ie gh tn to Đồ thị LEV chuẩn cho thấy khoảng phát LEV từ 0,2 - 50 ng/ml, oa nl w khoảng đồ thị có độ dốc lớn, tức có biến thiên giá trị OD 450 có d biến thiên nồng độ LEV Khi nồng độ LEV mẫu thấp, có nghĩa kháng an lu nguyên LEV gắn bề mặt giếng có nhiều hội cạnh tranh với kháng nguyên nf va LEV tự mẫu liên kết với kháng thể đa dòng kháng LEV, tƣơng ứng với oi lm ul lƣợng cộng hợp kháng thể thứ gắn HRP cao, tỷ lệ với cƣờng độ màu phản ứng cao Ngƣợc lại, nồng độ LEV mẫu cao, có nghĩa kháng nguyên LEV z at nh cố định hội cạnh tranh với kháng thể đa dịng kháng LEV, tƣơng ứng với cƣờng độ màu phản ứng ELISA thấp (bảng 3.2) z gm @ Giới hạn phát phƣơng pháp nồng độ 0,2 ng/ml Cũng sử dụng l phƣơng pháp này, Shanin cs (2014) phát đƣợc LEV khoảng từ giới m co hạn thấp 0,03-0,41 ng/ml Shanin cs (2015) sử dụng phƣơng pháp miễn dịch an Lu phân cực huỳnh quang (Fluorescene Polarization Immunoassay - FPIA) cho kết phát LEV từ 2,5 – 50 ng/ml Tuy kết nghiên cứu so với va n nƣớc ngồi có thấp nhƣng đảm bảo phát tốt LEV ngƣỡng cho http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 49 phép thực phẩm Đƣờng chuẩn đƣợc sử dụng song song các phép xác định hàm lƣợng LEV mẫu sữa gây nhiễm mẫu sữa thu thị trƣờng [33,34] lu an n va gh tn to p ie Hình 14 Biểu đồ đƣờng chuẩn LEV w Từ kết đƣờng chuẩn cho thấy khoảng xác định phƣơng pháp, chúng oa nl tơi tiến hành xây dựng đƣờng tuyến tính với khoảng nồng độ LEV thu hẹp d khoảng từ 0,2-10 ng/ml Trong khoảng biến thiên này, hàm lƣợng LEV tỷ lệ nghịch lu va an với cƣờng độ màu OD450, xác tỷ lệ nghịch với mức độ cạnh tranh Kết ul nf giá trị OD450 thu đƣợc trình bày bảng 3.2 oi lm Bảng 3.2 Kết đo OD450 phiến ELISA Nồng độ LEV đƣa vào OD1 0,856 0,2 0,748 0,718 0,5 0,695 0,667 1,0 0,552 2,0 OD trung bình A/A0 0,898 0,877 0,733 0,835803877 0,681 0,776510832 0,558 0,555 0,632839225 0,481 0,481 0,481 0,548460661 4,0 0,373 0,379 0,376 10,0 0,309 0,331 0,320 z at nh OD2 z m co l gm @ an Lu 0,428734322 n va 0,364880274 http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 50 lu an n va Kết phân tích phần mềm OriginPro 8.5.1 cho kết sau: ie gh tn to Hình 15 Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn y = a + b*x p Equation No Weighting nl w Weight 0.00388 Pearson's r -0.98885 d oa Residual Sum of Squares lu 0.97228 Value A/A0 Slope Standard Error 0.6431 0.01317 -0.30046 0.02263 oi lm A/A0 Intercept ul nf va an Adj R-Square LEV đƣợc viết nhƣ sau: z at nh Dựa vào kết phân tích trên, phƣơng trình tuyến tính xác định hàm lƣợng z m co x tỷ số A/A0 l y hàm lƣợng LEV (ng/ml) gm Trong đó: @ y = (-0,30046 ± 0,02263)x + (0,6431 ± 0,01317) với hệ số R2 = 0,97228 an Lu Đƣờng cong tuyến tính đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn thực (dạng điểm) nhờ n va chức fitting phần mềm OriginPro 8.5.1 Bƣớc đƣợc thực dựa http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 51 nguyên tắc: đƣờng tuyến tính chuẩn đƣờng gần so với đƣờng chuẩn thực Mức độ fitting thể hệ số R2 (R-square) R2 biến thiên từ 0-1, giá trị R2 gần tới thể mức đồng đƣờng cong thực đƣờng chuẩn tuyến tính cao Giá trị R2 thấp (gần giá trị 0) thể mức độ đồng đƣờng cong thực tế đƣờng cong chuẩn thấp (đƣờng chuẩn tuyến tính khác xa so với đƣờng chuẩn thực) Kết phân tích thu đƣợc giá trị R2 0,97228, điều có nghĩa mức độ phù hợp giá trị thực tế thí nghiệm đƣờng tuyến tính cao lu an va A/A0 Linear Fit of Sheet1 A/A0 n 0.9 tn to gh 0.8 Equation y = a + b*x Weight No Weighting 0.00388 ie Residual Sum of Squares p 0.7 0.97228 Adj R-Square Value w A/A0 Intercept A/A0 Slope Standard Error 0.6431 0.01317 -0.30046 0.02263 0.6 d oa nl A/A0 -0.98885 Pearson's r 0.5 an lu 0.3 0.1 oi lm ul nf va 0.4 10 LEV Con z at nh z Hình 16 Đồ thị tuyến tính nồng đợ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn gốc (Màu đen: Đƣờng chuẩn gốc; Màu đỏ: Đƣờng cong tuyến tính) m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 52 3.3 Độ đặc hiệu phƣơng pháp ELISA Một các tiêu chí quan trọng phản ứng ELISA tính đặc hiệu Hơn nữa, nghiên cứu sử dụng kháng thể đa dòng kháng LEV đƣợc tạo thỏ Do tính chất tƣơng tự cấu trúc hoá học các kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, phản ứng chéo kháng thể kháng loại kháng sinh với kháng sinh khác họ xảy Các kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone có chung cấu trúc vịng (hình 17) lu an n va p ie gh tn to oa nl w Hình 17 Cấu trúc phân tử Fluoroquinolone d Để đánh giá tính đặc hiệu phƣơng pháp, chúng tơi tiến hành xác định lu va an các phản ứng chéo với các kháng sinh khác nhóm Fluoroquinolone, cụ thể ul nf phản ứng ELISA xác định LEV đƣợc thay xác định các kháng sinh họ oi lm Kết phản ứng chéo đƣợc trình bày hình 18 z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 53 lu an n va tn to ie gh Hình 18 Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo Fluoroquinolone p Trong số các Fluoroquinolone kiểm tra, phản ứng ELISA gián tiếp cạnh nl w tranh sử dụng kháng thể đa dòng kháng LEV-BSA cho kết phản ứng chéo với d oa các kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone lần lƣợt nhƣ sau: Ofloxacin (145%), oi lm ul nf va cho phản ứng chéo an lu Marbofloxacin (82%), Ofloxacin (68%), Rufloxacin (67%) Garenoxacin (24%) z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 54 3.4 Đánh giá độ ổn định phƣơng pháp Chúng tiến hành kiểm tra độ ổn định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng LEV thông qua kết hiệu suất thu hồi phép thử Phép kiểm tra ʻʻđƣa vào - tìm thấyʼʼ đƣợc tiến hành cách chủ động đƣa vào mẫu sữa lƣợng xác định LEV Hàm lƣợng LEV đƣa vào sữa lần lƣợt từ 0,5; 1,0; 1,5 3,0 ng/ml Kết đƣợc trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Bảng kết hiệu suất thu hồi lu an n va LEV xác định (ng/mL) 0,46 ± 0,01 1,03 ± 0,01 Thu hồi (%) 85 - 100 100 - 105 1,5 3,0 1,40 ± 0,10 2,78 ± 0,06 82 - 107 91 - 95 p ie gh tn to LEV đƣa vào (ng/mL) 0,0 0,5 1,0 w oa nl Kết ELISA cho thấy hiệu suất thu hồi LEV các mẫu thí nghiệm d dao động khoảng 82 - 107% Hiệu suất thu hồi đƣợc cho thích hợp lu va an khoảng từ 60 - 160% Kết thí nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi đạt đƣợc oi lm ul nf nằm khoảng giới hạn 3.5 Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV sƣ̃a z at nh Chúng tiến hành khảo sát hàm lƣợng LEV các mẫu sữa phƣơng pháp ELISA gián tiếp cạnh tranh Các mẫu sữa tƣơi thƣơng phẩm thu địa bàn z @ quanh Hà Nội dạng trùng Mẫu sữa sau xử lý amonium sulphat l gm bão hồ theo mơ tả phần phƣơng pháp nghiên cứu (trang 39), đƣợc đƣa vào phân tích So sánh kết các mẫu thí nghiệm với mẫu đối chứng âm đối chứng m co dƣơng cho thấy, số 12 mẫu thí nghiệm đƣa vào khảo sát, hàm lƣợng LEV có an Lu tổng số 12 mẫu sữa hỗn hợp sữa từ các nhà sản xuất khác đƣợc mua để n va phân tích kỹ thuật phát triển Dựa vào nồng độ LEV chuẩn để tính hàm lƣợng LEV http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 55 các mẫu dƣơng tính Trong số các mẫu kiểm tra, mẫu xác định đƣa kết dƣơng tính (5,36; 4,25 2,82 ng/m) Kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết xác định hàm lƣợng LEV các mẫu sữa Địa điểm thu mẫu Tản Lĩnh, Ba Vì Mẫu 1* 4** 7** Yên Bài, Ba Vì Kết ELISA 0,489 0,318 0,611 Hàm lƣợng LEV (ng/ml) 2,82 5,36 4,25 *) pha loãng mẫu lần; **) pha loãng mẫu 10 lần lu an n va Fluroquinolone nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có tn to khả khuyếch tán tốt mơ bào, nhanh chóng ức chế tiêu diệt vi khuẩn gh thông qua ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) đƣợc sử dụng phổ biến p ie hiệu nhân y thú y Tuy nhiên việc sử dụng nhóm kháng sinh w chăn ni thú y thuỷ sản có tác dụng xấu đến mơi trƣờng sức khoẻ cộng danofloxacin (Advocin, Advocid), d sau: oa nl đồng (WHO, 1998) Nhóm Fluroquinolone đƣợc sử dụng thú ý gồm các loại difloxacin (Dicural, Vetequinon), lu va an enrofloxacin (Baytril), ibafloxacin (Ibaflin), marbofloxacin (Marbocyl,Zenequin), oi lm ul nf orbifloxacin (Orbax,Victas), sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin) Nghiên cứu Jason et al (2009) cừu non cho thấy kháng sinh z at nh nhóm fluoroquinolone gây tác động lớn, làm cho hệ xƣơng, sụn hầu nhƣ không phát triển thời gian sử dụng kháng sinh nhóm Trƣớc đây, có các z gm @ nghiên cứu việc ảnh hƣởng đến phát triển xƣơng, sụn thú non (chó, cừu) sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolone nhƣng hiệu điều trị mức l m co độ cần thiết các kháng sinh nhóm kháng sinh mà ngƣời ta bỏ qua tác hại Bên cạnh đó, tồn lƣu thời gian dài sau sử dụng thuốc kháng sinh an Lu nhóm fluoroquinolone nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế cấm sử dụng n va kháng sinh thuộc nhóm Ở Mỹ, quan quản lý thực phẩm dƣợc http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 56 phẩm Mỹ (FDA: Food and Drug Administration) khơng chấp nhận tồn lƣu kháng sinh nhóm fluoroquinolone sản phẩm thủy sản nhập Ở châu Âu, EU thiết lập giới hạn lớn (MRLs- Maximum Residual Limit) đối với dƣ lƣợng thuốc thực phẩm cung cấp cho ngƣời vào năm 1990 Trong “Council directive 96/23/EC in 1996” quy định rõ Enrofloxacin cơ, gan, thận bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) 30 µg/kg; sữa bị 100 µg/kg Ủy ban thực phẩm CODEX thành lập FAO WHO quy định MRL đối với Danofloxacin Sarafloxacin dùng thú y các loại thịt, gan lợn, bò gà lu tƣơng ứng khoảng 50-400 10-80 µg/kg an n va Sữa thực phẩm ngày đƣợc tiêu dùng với số lƣợng lớn, không chỉ to các nƣớc phát triển, mà các nƣớc phát triển có Việt Nam gh tn Đối tƣợng chủ yếu tiêu thụ sản phẩm sữa trẻ em Việc lakm dụng kháng sinh p ie chăn nuôi, dẫn đến dƣ lƣợng chúng thực phẩm các sản phẩm từ động vật cao, đặc biệt sữa Kết thí nghiệm cho thấy, hàm lƣợng LEV nl w phát đƣợc 25% số mẫu phân tích, nhiên hàm lƣợng LEV sữa d oa thấp, tất các mẫu đƣợc kiểm tra đáp ứng các nồng độ tối đa cho phép oi lm ul nf va an lu Fluoroquinolone sữa (100 µg/L) z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng đƣờng chuẩn hàm lƣợng LEV sữa phƣơng pháp ELISA gián tiếp cạnh tranh (với các điều kiện sau: Nồng độ phức hợp kháng nguyên (LEV - OVA) phủ lên bề mặt giếng 0,5 µg/ml; Độ pha lỗng kháng thể đa dòng kháng LEV cộng hợp kháng thể thứ (rAnti-IgG-HRP)lần lƣợt là: 5.000 lần 10.000 lần) Khoảng phát LEV sữa 0,2 ng/ml - 50 ng/ml, giới hạn nồng độ phát 0,2 ng/ml lu an kháng sinh thuộc Fluoroquinolone dao động khoảng 24-145% n va Tỷ lệ phản ứng chéo phản ứng ELISA gián tiếp cạnh tranh với các nhóm tn to ie gh Đã xác định đƣợc mẫu sữa dƣơng tính LEV số 12 mẫu sữa phân tích, p hàm lƣợng LEV nằm giới hạn cho phép kháng sinh d Kiến nghị oa nl w nhóm Fluoroquilone thực phẩm an lu va Tiếp tục tối ƣu các điều kiện phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp để nâng oi lm ul nf cao độ nhạy, giới hạn khoảng phát phƣơng pháp Phát triển phƣơng pháp dựa nguyên lý ELISA thành các dạng tiện lợi thực phẩm z at nh (que nhúng) nhằm đƣa ứng dụng thực tế phát hiện/định tính LEV z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lƣơng Quốc Chính, Nguyễn Văn Chi, Nguyễn Hồng Hà (2010) Các thang điểm thiết yếu sử dụng thực hành lâm sang Nhà xuất y học, chƣơng 6, tr 36-38 Đào Thị Vui (2007) Dược lý học Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, tập 2, tr 130-183 Phạm Thị Thu Lan cộng (2008) “Đánh giá mức độ đề kháng vi khuẩn thường gặp với kháng sinh” Thông tin dƣợc lâm sàng, nhà xuất lu y học số 10/2008, tr 3-7 an Bộ y tế (2007) Dược thư Quốc Gia Việt Nam Nhà xuất y hoc tr 324- va n 327;720-723; 812-813 to Nguồn từ UV-Việt Nam Thông tƣ số 03/2012/TT-BNNPTNT ngày 16/01/2012 sửa đổi Thông tƣ số gh tn ie p 15/2009/TT-BNN ngày 17/03/2009 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn nl w ban hành danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng Bộ Y tế (2009) Hóa phân tích, Nhà xuất Y học Thái Phan Quỳnh Nhƣ (2005) “Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu d oa lu Phạm Kim Đăng cộng (2008) “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân nf va an cao” Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế oi lm ul tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone tơm số tỉnh ven biển khu vực Bắc Bộ” Tạp chí khoa học phát triển, tập VI, số 3, trƣờng ĐH Nông Tiếng Anh z at nh nghiệp Hà Nôi z @ 10 T.S Jacoby, R.S Kuchenbecker, R.P.dos Santos, L.Magedanz, P.Guzatto, l gm L.B, (2010) “Moreira Impact of hospital-wide infection tate, invasive procedure use and antimicrobial consumption on bacterial resisstance inside m co an intensive care unit” Journal of Hospital Infection (75) pp 23-27 an Lu 11 Lorenzo Drago, Lucia Nicola, Roberto Mattina and Elena De Vecchi (2010), va “In vitro selection of resistance in Escherichia coli and Klebsiella spp at in n vivo fluoroquinolone concentrations” BMC Microbiology 2010, pp10-119 http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 59 12 European Commission (1996) “Council directive 96/23/EC” 13 George G Zhanel, Daryl J Hoban, Kris Schurek, James A Karlowsky (2004) “Role of efflux mechanisms on fluoroquinolone resistance in Streptococus pneumonia and Pseudomonas aeruginosa” International Journal of Antimicrobial Agents 2004 (24), pp529-535 14 Joel G Hardman, ph.D and Lee E Limbird, ph.D (2001) “Pharmacological Basis of Therapeutics II” New York, pp 1179-1182 15 European Commission (2002) “Commission decision 2377/90/EC” lu 16 R.H Burdon, P.H van Knippenberg (1985) Laboratory Techniques In an Biochemistry And Biology, volume 15, P Tijssen, Practice And Theory Of va Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, Netherlands n Crowther, The ELISAGuide Book, 2nd edition, Humana Press, Springer, New gh tn to 17 John M Walker (2008) Methods In Molecular Biology, volume 516, John A p ie York, USA w 18 John M Walker (1995) Methods In Molecular Biology, volume 42, John A d USA oa nl Crowther, ELISA: Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York, lu an 19 IDEXX Laboratories, Inc (2007) ELISA Technical Guide nf va 20 Ghislain Follet (1997) Antibiotic resistance in the EU Science, Politics and oi lm ul Policy Number 3.2000, p.148-155 21 STOLKER, AA and UA Brinkman (2005) Strategy analysis to analyze z at nh residues veterinary medicines and growth promoting agents in animal food production conclusion Journal of Chromatography A 1067: 15-53 z 22 Sundlof, SF, JB Kaneene and R Miller (1995) National Survey veterianrian @ gm initiated drug use in lactating dairy cows JA Vety Med Assoc 207: 347-352 l 23 Jiang (2011)“Development and Optimization of an Indirect Competitive m co ELISA for Detection of Norfloxacin Residue in Chicken Liver” International © (2011) IACSIT Press, Singapore an Lu Conference on Environmental Science and Technology IPCBEE vol.6 (2011) n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 60 24 Jiang (2010) “Development of an Immunoassay for Determination of Fluoroquinolones Pollutantin Environmental Water Samples” International Conference on Nanotechnology and Biosensors IPCBEE vol.2 (2011) © (2011) IACSIT Press, Singapore 25 Huang (2014), International Food Research Journal 21(4): 1419-1424 “Development of an indirect competitive ELISA for detection of danofloxacin residue in milk” 26 Hai-tang ZHANG (2011), Zhang et al/JZhejiang Univ-Sci B (Biomed & lu Biotechnol)12(11):884-891 “Development of an indirect competitive ELISA an for simultaneous detection of enrofloxacin and ciprofloxacin” va 27 Lu S., Zhang Y., Liu J., Zhao C., Liu W., and Xi R J.Agric Food Chem n tn to 2006 vol 54, p 6995 gh 28 Chen, J.-J and Jiang, J.-Q., Food Agric Immunol.,2012, vol.24 no.3,p.331 p ie 29 Cao, Z., Lu, S., Liu, J., Zhan, J., Meng, M., and Xi, R., Anal Lett., 2011, vol w 44 No.6, p 1100 oa nl 30 Cao, Z., Meng, M., Lu, S., and Xi, R., Anal Lett., 2011, vol.44, no 6, p.1077 d 31 Van Coillie E, de Block J, and Reybroeck W, J Agric Food Chem., 2004 32 https://en.wikipedia.org oi lm ul nf va Trích dẫn trang Web: an lu vol.52, p4975 z at nh 33 Shanin, A R Shaimardanov, Nguyen Thi Dieu Thuy, and S A Eremin 2015 Determination of Fluoroquinolone Antibiotic Levofloxacin in Urine by Fluorescence Polarization Immunoassay Journal of Analytical Chemistry, 70(6): 712-717 34 A Shanin, N.T.D Thuy, and S A Eremin 2014 Determination of Levofloxacin (the Levorotatory Stereoisomer of Ofloxacin) in Milk by an Indirect Enzyme_Linked Immunosorbent Assay Moscow University Chemistry Bulletin, 69(3): 136–141 z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 61 Kết phân tích phần mềm OriginPro 8.5.1 A/A0 Linear Fit of Sheet1 A/A0 0.9 0.8 Equation y = a + b*x Weight No Weighting 0.00388 Residual Sum of Squares 0.7 -0.98885 Pearson's r 0.97228 Adj R-Square lu A/A0 Value A/A0 Intercept A/A0 Slope Standard Error 0.6431 0.01317 -0.30046 0.02263 0.6 an va n 0.5 tn to p ie gh 0.4 0.3 w nl 0.1 10 d oa LEV Con oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 62 Bài báo khoa học Hắc Bá Thành1, Nguyễn Thị Thu2, S.A Eremin3, I.A Shanin3, Nguyễn Văn Cường2, Nguyễn Thị Diệu Thúy2(2014) 1) Sở Tài ngun Mơi trường Thanh Hóa; 2)Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; 3)Trường ĐHTH Lô mô nô xốp “Xây dựng phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzyme trực tiếp phát dƣ lƣợng Chloramphenocol sản phẩm sữa”, Tạp chí khoa học, Trƣờng Đại học Hồng Đức (đã nhận bài) lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN 63