(Luận văn) đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh tại đà nẵng bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TẤN PHÁT lu an ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG n va VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO tn to XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ p ie gh ad o nl w nf a nv a lu l ul KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP oi m at nh z z om l.c gm @ an Lu ĐÀ NẴNG, NĂM 2018 n va ac th si ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG lu an VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO n va XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ p ie gh tn to o nl w Ngành : Công nghệ sinh học ad a nv a lu nf KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP l ul oi m at nh z z Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN MINH LÝ om l.c gm @ an Lu ĐÀ NẴNG, NĂM 2018 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Tấn Phát an lu n va p ie gh tn to d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý thầy, cô khoa Sinh – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đại Học Đà Nẵng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý ngƣời thầy tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hƣớng cho em suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp động viên tinh an lu thần cho suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận n va p ie gh tn to d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU an lu Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài va n Ý nghĩa khoa học đề tài gh tn to CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn p ie 1.1.1 Phân loại vi khuẩn w 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum d oa nl a Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R solanacearum b Đặc tính sinh hóa vi khuẩn R solanacearum v an lu c Phương thức tồn tại, xâm nhập lan truyền vi khuẩn R solanacearum m ll fu an d Ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh đến phát sinh, phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc e Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn phân lập vi khuẩn gây bệnh oi nh 1.1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum 10 at a Biovar nòi vi khuẩn R solanacearum 10 z z b Chủng 11 @ gm c Loài phức 12 l.c d Kiểu gây bệnh 12 e Kiểu quan hệ phả hệ 12 om 1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh Việt Nam Thế giới 13 Lu an a Nghiên cứu bệnh héo xanh giới 13 n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an b Nghiên cứu bệnh héo xanh Việt Nam 13 1.2 Tổng quan kỹ thuật RAPD 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Địa điểm, thời gian phạm vi nghiên cứu 18 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 18 lu 2.3.2 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04/2017 đến 04/2018 18 an 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 va n 2.4.1 Phƣơng pháp thu mẫu 18 gh tn to 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập 18 a Mẫu đất 18 p ie b Mẫu bệnh 19 w 2.4.3 Phƣơng pháp xác định biovar dòng vi khuẩn phân lập 19 d oa nl 2.4.4 Phƣơng pháp phân tích DNA 21 a Phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 21 v an lu 2.4.5 Kỹ thuật PCR: 21 fu an 2.4.6 Phƣơng pháp điện di gel agarose 21 oi m ll 2.4.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 22 2.4.8 Phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật 22 nh at Bảo quản môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền 22 z CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 z @ 3.1 Phân lập vi khuẩn héo xanh địa bàn Đà Nẵng 24 gm 3.2 Xác định biovar chủng vi khuẩn R solanacearum 27 om l.c 3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 29 Lu 3.3.1 Kết tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum 29 an n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.3.2 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi RAPD 29 3.3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền chủng VKHX 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Tiếng việt 35 an lu Tiếng Anh 36 n va p ie gh tn to d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT an lu n va Food and Agriculture Organization of the United Nations HXVK Héo xanh vi khuẩn TZC Tetrazolium chloride SPA PCR Sucrose peptone agar Polymerase chain reaction bp DNA Base pair Deoxyribonucleic acid µg µL Microgram Microliter AP-PCR Arbitrary primed polymerase chain reaction DAF RAPD DNA amplification fingerprinting Randomly amplified polymorphic DNA TAE Kb mg mL Tris-Acetic acid-EDTA Kilobase Milligram Millilite p ie gh tn to FAO Millimol Cộng v an lu cetyltrimethyl-ammonium bromide ethylene diamine tetraacetic acid oi m ll fu an CTAB EDTA d oa nl w mM cs nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 2.1 Tọa độ địa điểm lấy mẫu 17 Bảng 2.2 Danh sách đoạn mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Phản ứng xác định Biovar vi khuẩn R.solanacearum 20 Bảng 3.1 Các chủngVKHX đƣợc phân lập 24 Bảng 3.2 Đƣờng kính khuẩn lạc môi trƣờng TZC sau 24h 48h nuôi cấy 25 Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh 27 bảng an lu n va p ie gh tn to Bảng 3.3 w Mức độ đa hình mồi RAPD ngẫu nhiên phân d oa nl Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng di truyền chủng vi khuẩn héo xanh v an lu Bảng 3.5 28 tích với chủng vi khuẩn R solanacearum 30 oi m ll fu an nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang Hình thái vi khuẩn Ralstonia Hình 1.1 solanacearum Smith dƣới kính hiển vi Hình thái loại kiểu hình vi khuẩn mơi trƣờng TZC đƣợc sử dụng nghiên cứu Hình 3.1 lu an Hình 3.2 25 Kết tách chiết DNA số chủng vi khuẩn R solanacearum 28 va n Kết điện di sản phẩm PCR xác định gh tn to Hình 3.3 tính đặc hiệu quy trình phát R solanacearum sử dụng DNA chiết tách 29 p ie từ loài vi khuẩn phân lập đƣợc d oa nl w Quan hệ di truyền chủng vi khuẩn héo xanh Hình 3.4 30 oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.2 Xác định biovar chủng vi khuẩn R solanacearum Từ 23 mẫu vi khuẩn héo xanh thu thập đƣợc tiến hành thử phản ứng ơxy hóa nguồn bon khác để xác định biovar theo phƣơng pháp mô tả Hayward (1964) Từ phƣơng pháp xác định Biovar thấy, vi khuẩn có phản ứng với loại đƣờng có phản ứng với hai loại đƣờng cịn lại ngƣợc lại Chính vậy, nghiên cứu chọn đại diện loại đƣờng thông dụng là: lactose, maltose an lu Tƣơng tự nhƣ vậy, phản ứng với rƣợu chọn đại diện loại rƣợu, nhƣng biovar vi khuẩn phản ứng với đƣờng loại rƣợu manitol, không phản ứng n va Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh cho thấy có 21 chủng phản ứng với nguồn bon (2 loại đƣờng gồm: lactose, maltose, loại rƣợu gồm: sorbitol, manitol) nên thuộc biovar (chiếm p ie gh tn to với loại rƣợu lại, nên ƣu tiên chọn rƣợu manitol loại đƣợc chọn là: manitol, dulcitol Kết phản ứng đƣợc thể bảng 3.3 w d oa nl 91.3% số mẫu) Có chủng phản ứng với đƣờng gồm (lactose, maltose) rƣợu sorbitol, chủng chƣa thể kết luận thuộc biovar nào, cần có thêm nghiên cứu v an lu chủng để đƣa kết luận xác Theo Buddenhagen Kelman (1964), He et al (1983) vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc vùng đất thấp vùng nhiệt đới cận oi m ll fu an nhiệt đới thuộc nịi Nịi có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm họ cà (Solanaceae) số họ đậu (Leguminoseae) Các tác giả Nguyễn Xuân Hồng cs (1997), Đỗ Tấn Dũng (1999), Nguyễn Thị Yến cs (2002) xác định vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar thuộc nòi Kết xác định nòi biovar nguồn vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo nh at z z @ xanh Đà Nẵng phổ biến biovar Vẫn chƣa phân lập đƣợc biovar 4, có mẫu chƣa xác định đƣợc biovar om l.c gm an Lu n va a th 27 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.3 Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh ĐƢỜNG KÝ HIỆU RƢỢU MALTOSE LACTOSE MANITOL DULCITOL BIOVAR + + + Rs2 + + + + Rs3 + + + + Rs4 + + + + Rs5 + + + + Rs6 + + + + Rs7 + + + + Rs8 + + + + Rs9 + + + + Rs10 + + + + Rs11 + + + + + + - + ? + + + + + + + + + + + + + + + + - + ? + + + + + + + + + + + + n va + m ll an lu Rs1 p ie gh tn to Rs13 + Rs18 + Rs19 + + Rs20 + + Rs21 + + Rs22 + + Rs23 + + at z z @ + l.c Rs17 gm + nh Rs16 oi fu an Rs15 v an lu Rs14 d oa nl w Rs12 om Ghi chú: + có phản ứng; - khơng có phản ứng an Lu n va a th 28 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 3.3.1 Kết tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum Từ nguồn vật liệu 23 chủng vi khuẩn tách chiết DNA thành công 23 mẫu đƣa vào nghiên cứu DNA tách chiết đƣợc có vạch b ng đậm, rõ nét, không bị tạp nhiễm hay gẫy đứt đoạn, đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm (hình 3.2) an lu n va p ie gh tn to d oa nl w Hình 3.2: Kết tách chiết DNA số chủng vi khuẩn R solanacearum 1-15: DNA tổng số chủng vi khuẩn Rs1- Rs15 M - DNA ladder 1000 bp (PhusaBiochem) bên dƣới, hình 3.6 m ll fu an v an lu 3.3.2 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi RAPD Sản phẩm PCR với mồi RAPD chủng vi khuẩn R solanacearum đại diện cho nhóm hình thái khuẩn lạc địa điểm khác nhau, đƣợc thể oi Bảng 3.4: Mức độ đa hình mồi RAPD ngẫu nhiên phân tích với chủng vi khuẩn R solanacearum nh OPA 16 OPA 17 13 OPB 10 OPB 14 19 OPF 11 65 31 Phần trăm at Tên mồi om Số ph n đoạn ADN Số ph n đoạn đƣợc nh n DNA đa hình STT z z @ 25% 46% 30% 15 78,9% 42,8% l.c gm 47.69% an Lu Tổng n va a th 29 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Sản phẩm PCR-RAPD phân tích với mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di gel agarose để phân tích đa hình DNA chủng vi khuẩn nghiên cứu Số phân đoạn DNA nhân dao động từ đến 19 phân đoạn, tổng số phân đoạn ADN nhân đƣợc 65 Trong số mồi phân tích, số phân đoạn ADN nhân đƣợc với mồi OPB14 nhiều (19 phân đoạn) mồi OPF 11 (7 phân đoạn) Kết ghi nhận đƣợc cho thấy tất mồi nghiên cứu cho đa hình Tính đa hình thể xuất hay không xuất phân đoạn ADN so sánh chủng với mồi an lu n va p ie gh tn to d oa nl w v an lu oi m ll fu an Hình 3.3 : Kết điện di sản phẩm RAPD chủng vi khuẩn R solanacearum với mồi Ghi chú: 11-mồi OPF 11; 14–mồi OPB 14; 17–mồi OPA 17; A1–mồi OPA 1; B1–mồi OPB 1; M–thang DNA chuẩn 2kb Nhƣ sản phẩm PCR-RAPD phân tích với mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di gel agarose để phân tích đa hình DNA chủng vi khuẩn có mức đa hình cao nh at z z @ om l.c gm 3.3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền chủng VKHX Số liệu sau đƣợc mã hóa thành ký tự 0, đƣợc xử lý phần mềm NTSYSpc-version 2.1 Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.5 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu nằm khoảng từ 0,19 -1,00 (tƣơng ứng với từ 19% -100%), nghĩa sai khác di truyền mẫu nằm khoảng từ 0-81% Điều này, cho thấy an Lu n va a th 30 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an chủng có khác về mặt di truyền, hay nói cách khác có đa dạng di truyền chủng với Bảng 3.5 Hệ số tương đồng di truyền chủng vi khuẩn héo xanh an lu n va gh tn to Để thuận lợi cho việc phân tích, đánh giá quan hệ di truyền chủng vi khuẩn, sử dụng phần mềm NTSYSpc chuyển hóa số liệu tƣơng quan di truyền mẫu bảng 3.5 thành dạng biểu đồ hình cây, mẫu có hệ số tƣơng đồng p ie tƣơng đƣơng đƣợc xếp vào nhóm Dựa vào biểu đồ hình đánh giá đƣợc mức độ đa dạng tƣơng quan di truyền mẫu nghiên d oa nl w cứu (hình 3.7) oi m ll fu an v an lu nh at z z @ gm om l.c Hình 3.4 Quan hệ di truyền chủng vi khuẩn héo xanh Dựa kết phân tích mồi nghiên cứu với chủng vi khuẩn, xây dựng đƣợc mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh (hình 3.7) Hệ số tƣơng đồng di truyền cao đƣợc ghi nhận chủng Rs2 chủng Rs8 đạt 0.69 Biểu đồ quan hệ di truyền cho thấy, hệ số tƣơng đồng an Lu n va a th 31 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an chủng vi khuẩn thấp dao động từ 0,05 đến 0,69 chủng vi khuẩn đƣợc chia thành nhóm Nhóm I gồm chủng: RS13 Hệ số tƣơng đồng di truyền 0,05 Nhóm II gồm chủng vi khuẩn lại đƣợc chia thành nhóm phụ: Nhóm II.1 gồm chủng: Rs2, Rs8, Rs19 Chủng Rs2 Rs8 có hệ số tƣơng đồng di truyền 0.69 gần chủng Rs19 phân thành nhánh riêng biệt Nhóm II.2 gồm chủng: Rs21 Hệ số tƣơng đồng di truyền đạt 0.19 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi ngẫu nhiên cho thấy tƣơng đồng an lu di truyền chúng thấp Xét mặt địa lý thấy chủng đƣợc phân lập từ vùng lân cận thƣờng nằm phân nhóm có mối quan hệ di n va có khác biệt rõ Xét mặt hình thái khuẩn lạc thấy chủng kiểu hình thái nhƣng lại khác khoảng cách di truyền Kết đánh giá đa dạng di truyền thí nghiệm phù hợp với kết p ie gh tn to truyền tƣơng đối gần, chí xuất xứ từ chủng (tƣơng đồng di truyền tới 100%) nhƣ chủng Rs2 Rs8 (Cẩm Lệ, Hòa Khánh), lại địa điểm khác w d oa nl công bố trƣớc Theo nghiên cứu Đinh Thị Phòng cs (2008) đánh giá đa dạng di truyền DNA chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc R v an lu solanacearum Smith đƣợc thu thập từ địa phƣơng: Hịa Bình, Hà Tây (cũ), Hải Dƣơng với 20 mồi RAPD độ tƣơng đồng di truyền chủng vi khuẩn từ 0,710 đến 0,980 Mức tƣơng đồng di truyền 44 chủng vi khuẩn R solanacearum oi m ll fu an thuộc nòi biovar đánh giá với 30 mồi RAPD 70% Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh địa phƣơng khác Việt Nam sở để đƣa biện pháp phịng chống thích hợp Mặt khác, phân tích đa dạng vi khuẩn R solanacearum, Gillings Fahy (1993) nhận thấy vi khuẩn R solanacearum đa dạng gợi ý vi khuẩn có lẽ loài phức (complex species) Theo Fegan Prior (2005) “loài phức” nh at z z @ tập hợp cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc loài khác Các nghiên cứu đa dạng vi khuẩn dựa lai DNA cho thấy vi khuẩn héo xanh đa dạng với mức độ tƣơng đồng DNA mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt vi khuẩn mức loài) Hiện nay, vi khuẩn R solanacearum thức đƣợc xem lồi phức (Meng, 2013) om l.c gm an Lu n va a th 32 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nhƣ thấy, vi khuẩn R solanacearum lồi phức nên việc giống hình thái nhƣng khác khoảng cách di truyền, có sở an lu n va p ie gh tn to d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th 33 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập thành công đƣợc 23 chủng vi khuẩn héo xanh vùng sản xuất nông nghiệp thành phố Đà Nẵng Phân loại đƣợc chủng vi khuẩn theo hình thái thành loại khác biệt kích thƣớc màu sắc khuẩn lạc môi trƣờng TZC 1.2 Đa số chủng vi khuẩn R solanacearum phân lập đƣợc thuộc biovar thuộc nòi an lu 1.3 Kết phân tích thị RAPD cho thấy tính đa dạng di truyền cao chủng vi khuẩn R solanacearum đƣợc phân lập (với hệ số tƣơng đồng dao động từ va n 0,05 đến 0,69) gh tn to Kiến nghị 2.1 Trong nghiên cứu 21 chủng số 23 chủng đƣợc phân lập thuộc p ie Biovar Tuy nhiên, chủng chƣa xác định đƣợc Vì vậy, cần nghiên cứu thêm chủng (Rs12, Rs17) 2.2 Trong nghiên cứu cần phân tích mối quan hệ di truyền thị RAPD chủng vi khuẩn khác đƣợc phân lập d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th 34 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Đinh Thị Phòng, Đỗ Tiến Phát Nguyễn Thị Yến (2008), "Đa dạng DNA genome chủng vi khuẩn (pseudomonas solanacearum) gây bệnh héo xanh lạc kĩ thuật RADP", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Tập 46, số 6,, tr 43-50 Egorov N X dịch Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực hành vi sinh vật, NXB an lu Mir Matcova, NXB KT-KH Hà Nội n va gh tn to Lê Thị Thanh Thủy (2014), "Nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trồng, luận án tiến sĩ sinh học " p ie Hồ Thanh Hồng (2013), "Sử dụng dịng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua" http://agriviet.com/threads/cay-ca-chua.180517/, d oa nl w Đỗ Tấn Dũng (1999), Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith hại số trồng ngoại thành Hà Nội vùng phụ cận, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 181 trang Nguyễn Lân Dũng (1962), Giáo trình vi sinh vật hoc, chủ biên, Đại học Tổng fu an hợp Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng Nguyễn V n Tuất (2011), "Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith hại khoai tây vùng Hà Nội- phụ cận, biện pháp phòng trừ” Tập 9, số 5,, tr 725 - 734 Trần Thị Ba Phạm Thanh Phong (2010), "Đánh giá khả n ng sống chống oi m ll v an lu nh at z z chịu bệnh héo tƣơi vi khuẩn Ralstonia solanacearum cà chua ghép nhà lƣới", Tạp chí Khoa học 2010 Trường Đại học Cần Thơ 16b, tr 272-279 Trần Vũ Phến cộng (2010), "Tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kích t ng trƣởng phòng trừ sinh học bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum cà chua ", Tạp chí khoa học 15a, tr 97-106 @ om l.c gm 10 an Lu n va a th 35 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 11 Nguyễn V n Tuất cộng (2007), “Nghiên cứu tính đa dạng quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh Rastonia solanacearum Smith hại vừng, lạc”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2007- Nghiên cứu khoa học sống, Đại học Quy Nhơn, NXB Khoa học kỹ thuật, tháng 10/2007, tr 611-615 [12] Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Huy Chung, Lê Tuấn Tỳ, Nguyễn Mạnh Hùng, Đinh Thị Phƣợng, Đỗ Tiến Phát (2008), “Phân tích đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc (Ralstonia solanacearum Smith) tuyển chọn giống kháng bệnh”, Tạp chí Khoa học an lu Công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 2: 44-49 [13] Ngọ V n Ngôn (2015), " Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia n va solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc xác định dòng, giống kháng bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam"; Luận án Tiến Sỹ nông nghiệp p ie gh tn to Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội, 200 trang [14] Trƣơng Thị Hồng Hải (2016), " Nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn R solanacearum số tỉnh miền Bắc thị RAPD (Study on w d oa nl genetic diversity of Ralstonia solanacearum in Norther Vietnam by RAPD)"; Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, kỳ tháng 09/2016 v an lu [15] Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn V n Liễu (1997), “Kết nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 6: 27-31 oi m ll fu an [16] Lê Lƣơng Tề (1997a), Giáo trình bệnh cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1997 [17] Lê Nhƣ Kiểu, Trần Quang Minh, Lê Thị Thanh Thủy, Nguyễn V n Huân (2010), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc vừng” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 48(3); 33-42 [18] http://jb.asm.org/content/183/12/3597/F3.expansion.html [19] Burgess L.V, Knight T.E, Tesorio L., Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chẩn nh at z z @ đoán bệnh Việt Nam, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210pp, ACIAR gm om l.c Tiếng Anh [20] Meng F (2013), “Ralstonia Solanacearum species complex and bacterial wilt disease”, Journal of Bacteriology and Parasitology, 4: e911 an Lu n va a th 36 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an [21] (Williams J G K., Kubelik A R., Livak K J et al., 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 ) [22] Sam Cox (2000), "I Say Tomayto, You Say Tomahto" (Williams J G K., Kubelik A R., Livak K J et al., 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 ) [23] Kawa P G., Devarumath R M., Nerka Y., 2009 Use of RAPD marker for an lu assessment of genetic diversity in sugarcane cultivars Indian J Biotechnol., 8: 67-81 n va 42(1): 71-77 [25] Hayward A.C (1994), “The hosts of Pseudomonas solanacearum”, CAB International, p 9-24 67 p ie gh tn to [24] Khan A., Awan S., Sadia B., Rana R M., Khan I A., 2010 Genetic diversity study among coloured cotton genotypes by using RAPD markers Pak J Bot., w d oa nl [26] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24663688 [27] Hayward A.C (1964), “Characteristics of Pseudomonas solanacerarum”, Journal fu an v an lu of Applied Bacteriology, 27: 265 - 277 [28].Nguyen Duc Thanh, Nguyen Hoang Tinh, 2009 Application of molecular markers for the study of genetic diversity of forest trees and sub-tropical fruit species oi m ll Adv in National Science, 3: 373-382 [29] Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, Nguyen Hoang Nghia, 2012 Genetic diversity of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib in Vietnam based on analyses of chloroplast markers and random amplified polymorphic DNA (RAPD) Afr J Biotechnol., 1(80): 14529-14535 [30] Martin C., Uberhuaga E., Pérez C., 2002 Application of RAPD markers in the nh at z z @ om l.c gm characterisation of Chrysanthemum varieties and the assessment of somaclonal variation Euphytica, 127(2): 247-253 [31] Tivang J., Skroch P W., Nienhuis J., 1996 Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) variation among and within Artichoke (Cynara scolymus L.) cultivars and breeding Populations J Amer Soc Hort Sci., 121(5): 783-78 [32] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24663688 an Lu n va a th 37 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an [33] https://www.eurofinsgenomics.eu/media/1610370/rapd_10mer_kits_sequences pdf [34] Mehan V.K and McDonald D (1995), “Techniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum, and for resistance screening against groundnut bacterial wilt”, Technical Report, International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics an lu n va p ie gh tn to d oa nl w oi m ll fu an v an lu nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th 38 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC Môi trƣờng phân lập TZC (Tetrazolium Chloride Agar): Bảng 2.3 Môi trường phân lập vi khuẩn TZC (Tetrazolium Chloride Agar) Môi trƣờng ph n ập vi khuẩn TZC (Tetrazo ium Ch oride Agar): 10,0 g Glucose 5g Casein hydrolysate 1g Agar 17g 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 0,05g Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml an lu Pepton n va p ie gh tn to pH môi trƣờng 28 ° C: 7,0 - 7,2 w d oa nl Môi trƣờng nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) Bảng 2.4 Môi trường nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) v an lu Môi trƣờng nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) Sacaroza (C12H 22O11) 20,0 g fu an 5,0 g Agar 15 g oi m ll Pepton nh 0,25 g at Dikali hydro phosphat (K2HPO4) z Magie sulphat ngậm bảy phân tử nƣớc (MgSO4.7H2O) z 0,25 g @ gm Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml l.c om pH môi trƣờng 28 ° C: 7,2-7,4 an Lu n va a th 39 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC an lu n va p ie gh tn to d oa nl w m ll fu an v an lu oi (C) Hình 3.2 Hình thái vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh (A)- môi trường TZC; (B) - môi trường SPA; (C) - bảo quản nguồn vi khuẩn nh at z z @ om l.c gm an Lu n va a th 40 c si Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn