Tiểu Luận Công nghệ sinh học thực vật

Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] Công nghệ sinh học thực vật I Mở đầu Nuôi cấy mô thực vật lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật Bằng kỹ thuật nuôi cấy điều kiện vô trùng phận tách rời thể thực vật, người ta nhân giống in vitro thành cơng nhiều lồi trồng có giá trị mà trước phương thức nhân giống truyền thống gặp nhiều khó khăn Bên cạnh đó, số kỹ thuật khác ứng dụng có kết như: nuôi cấy đơn bội (1n) để tạo dòng chủng phục tráng giống trồng, dung hợp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo nhiều loài thực vật mang tính trạng hữu ích, chọn dịng biến dị soma biến dị giao tử có khả chống chịu điều kiện bất lợi ngoại cảnh nóng-lạnh, phèn-mặn, khơ hạn, sâu-bệnh…, cuối sản xuất trồng bệnh virus từ cá thể nhiễm bệnh virus , thiết kế vector biểu cao xây dựng kỹ thuật chuyển gen đ 1980, đ Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] đ Hiện nay, nhiều hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm phụ gia thực phẩm sản xuất thành công phương thức nuôi cấy tế bào quy mô công nghiệp cho hiệu suất cao Đặc biệt, việc sản xuất protein ngoại lai để điều trị bệnh hệ thống tế bào thực vật ý chúng an toàn cho người protein có nguồn gốc từ tế bào động vật, chất nhiễm bẩn virus thực vật tác nhân gây bệnh người II Nuôi cấy mô nhân giống in vitro Thuật ngữ học (terminology) Nuôi cấy mô (tissue culture) thuật ngữ dùng để q trình ni cấy vơ trùng in vitro phận tách rời khác thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho hai mục đích nhân giống cải thiện di truyền (ví dụ: giống trồng), sản xuất sinh khối sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, trì bảo quản nguồn gen quý… Các hoạt động bao hàm thuật ngữ công nghệ sinh học Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay gọi vi nhân giống (micropropagation) sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu nhiều phận khác thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng điều kiện vô trùng ống nghiệm loại bình ni cấy khác Trong thực tế, nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro nuôi cấy mô thay đổi cho để phương thức nhân giống thực vật điều kiện vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa nuôi cấy in vitro (in vitro culture) Nhân giống in vitro nuôi cấy mô bắt đầu mảnh cắt nhỏ thực vật, vi sinh vật, nuôi cấy vô trùng Thuật ngữ Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] dùng trình nhân giống explant (mẫu vật) tương đương với phương thức nhân giống khác cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) seed (hạt) Năm thuật ngữ khác dùng để loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) nhân giống in vitro nuôi cấy mô: 1.1 Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture) Phương thức nhân giống cách dùng phần nhỏ đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) mầm non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) sau Kiểu ni cấy dùng lần để làm virus (virus-free) thực vật Nếu dùng đỉnh phân sinh khơng thể sống sót tạo rễ cách độc lập, thay phương thức vi ghép (micrografting) Thành công điển hình phương thức nhân giống mầm hoa lan, dứa, huệ chuối (protocorm cụm chồi) hai mầm khoai tây, cà chua cúc (kéo dài chồi) 1.2 Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) Kiểu nuôi cấy sử dụng chồi điểm sinh trưởng bên nơi mà kéo dài chồi tận (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm sinh sản chồi nách đẩy mạnh Sự điều khiển cho phép nhân nhanh chồi in vitro (microshoots), chồi tách tạo rễ in vitro để hình thành ống nghiệm (microplants), cắt riêng biệt tạo thành cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên in vitro Phương thức thường áp dụng cho đối tượng hai mầm cúc, cà chua, thuốc 1.3 Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction) Loại nuôi cấy cho phép hình thành chồi bất định trực tiếp mẫu vật gián tiếp từ mô callus, mà mơ callus hình thành bề mặt vết cắt mẫu vật Hệ thống ni cấy có yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, khác nguồn mẫu vật nguồn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] gốc bất định chồi Một số loại mẫu vật dùng đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải), mảnh (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao), cuống (thủy tiên), phận hoa (súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên), đoạn mầm (măng tây) 1.4 Phát sinh quan (organogenesis) Thuật ngữ dùng để mơ tả q trình tái sinh chồi hoặc/và rễ bất định từ khối tế bào callus Quá trình xảy sau thời điểm mà mẫu vật đặt vào môi trường nuôi cấy bắt đầu cảm ứng tạo callus Đối với mục đích nhân giống in vitro, tái sinh hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu khơng nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh mà phát triển thành khối callus Tế bào callus cấy chuyển nhiều lần không ổn định mặt di truyền Để tránh tình trạng thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức callus sơ cấp để tái sinh hy vọng thu tái sinh đồng 1.5 Phát sinh phơi vơ tính (somatic embryogenesis) Thuật ngữ dùng cho phát triển phơi hồn chỉnh từ tế bào sinh dưỡng sản xuất từ nguồn mẫu vật khác sinh trưởng nuôi cấy in vitro Thuật ngữ tương đương phát triển phôi thực vật sinh trưởng điều kiện tự nhiên phát sinh phơi hữu tính (zygotic embryogenesis) phát sinh phơi vơ tính (apomitic embryogenesis) Phơi vơ tính có cấu trúc tương tự phơi hữu tính thực vật sinh trưởng điều kiện tự nhiên Điểm khác phơi hữu tính phơi vơ tính phơi hữu tính ln ln kèm với nội nhũ quan dự trữ lượng chất dinh dưỡng phục vụ cho trình nảy mầm, cịn phơi vơ tính hồn tồn khơng có nội nhũ Phương thức tạo phơi vơ tính ứng dụng hiệu sản xuất hạt nhân tạo (synthetic seed) Nhân giống in vitro hệ thống nuôi cấy mô Phương pháp nhân giống in vitro thực chất tiến vượt bậc phương pháp nhân giống vơ tính cổ điển giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… Ở giá trị thực tiễn tiến khoa học kỹ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] thuật biến phương thức cổ điển thành phương thức hoàn toàn chất cho phép giải khó khăn mà phương pháp cổ điển khơng thể vượt qua Ví dụ: kỹ thuật giâm cành ứng dụng thành cơng số trồng định, với kích thước 5-20 cm khả tạo rễ phụ vùng mô tượng tầng gần vết cắt khả đánh thức chồi phụ bị vùng tế bào lân cận toàn phần lại đoạn giâm khống chế Nếu tiến hành ni cấy mẫu mơ với kích thước 53 10 mm, tức làm giảm thể tích khối mơ xuống 10 lần rõ ràng mối tương tác tế bào loại mô đơn giản nhiều, hiệu tác động biện pháp nuôi cấy phải cao Sau số phương thức nhân giống in vitro: 2.1 Tái sinh từ cấu trúc sinh dưỡng 2.1.1 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh Phương thức sử dụng phận nhỏ đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật ni cấy Nó bao gồm mơ phân sinh đỉnh mầm non Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) mẫu vật tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước vịng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng Trong thực tế mẫu vật tách với kích thước người ta tiến hành ni cấy với mục đích làm virus cho trồng Thường gặp khó khăn lớn việc nuôi thành công mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ Do đó, khn khổ nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi đỉnh sinh trưởng Phổ biến đối tượng phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng tách với kích thước từ 5-10 mm, nghĩa tồn mơ phân sinh đỉnh phần mô xung quanh Tương quan độ lớn chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống mức độ ổn định mặt di truyền chồi biểu sau: Nếu độ lớn tăng tỷ lệ sống tính ổn định tăng, độ lớn giảm tỷ lệ sống tính ổn định giảm Nhưng xét hiệu kinh tế nuôi cấy (thể tích bình ni, lượng dung dịch mơi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng hiệu kinh tế giảm, độ lớn giảm hiệu kinh tế tăng Do đó, phải kết hợp hài hịa yếu tố để tìm phương thức lấy mẫu tối ưu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 97 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] Một đỉnh sinh trưởng ni cấy điều kiện thích hợp tạo hay nhiều chồi chồi phát triển thành hoàn chỉnh Xét nguồn gốc có ba khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn) - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ - Cây phát triển từ chồi phát sinh, ví dụ ni cấy đoạn trụ mầm (hypocotyl) mãng cầu (Annona squamosa) cho xuất nhiều mầm (buds) mô nuôi cấy, số mầm sau phát triển thành chồi (shoots) trở thành in vitro hoàn chỉnh (plantlet) Tuy nhiên, thường khó phân biệt chồi phá ngủ chồi phát sinh Các phương thức phát triển hồn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng ni cấy sau: - Phát triển trực tiếp Chủ yếu đối tượng hai mầm (dicotyledon) khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… ví dụ khoai tây (Solanum tuberosum): Mầm (đỉnh sinh trưởng) Chồi nách Cây (Hình 4.1) mầm A B Hình 4.1 Sự phát triển trực tiếp A: mầm khoai tây B: kéo dài mầm khoai tây nuôi cấy phát sinh chồi nách, đoạn thân mang chồi nách tách cấy chuyển môi trường để nhân nhanh - Phát triển thông qua giai đoạn protocorm Chủ yếu gặp đối tượng mầm (monocotyledon) phong lan, dứa, huệ… Cùng lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo) protocorm tiếp tục phân chia thành protocorm phát triển thành hoàn chỉnh Bằng phương thức thời gian ngắn người ta thu hàng triệu cá thể, ví dụ Hoa lan (Orchidaceae): Đỉnh sinh trưởng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Protocorm Cây (Hình 4.2) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 98 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] Mô phân sinh đỉnh Mầm Đỉnh phân sinh tách để ni cấy A B Hình 4.2 Phát triển qua giai đoạn protocorm A: đỉnh sinh trưởng B: Protocorm hình thành từ ni cấy đỉnh sinh trưởng Các đối tượng hoa lan mang lại hiệu kinh tế đặc biệt cao Sau kết chi Cymbidium Morel (1966), đến người ta thu kết tốt khoảng 30 chi khác họ Sở dĩ nhân giống vơ tính hoa lan đạt thành công lớn ứng dụng rộng rãi hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm Nhờ có phương thức nhân giống nhanh rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giá phải nhiều người ưa chuộng Những thành công họ lan chứng mà mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật loài khác Lĩnh vực ứng dụng bắt đầu có kết ăn lâm nghiệp, có quý cà phê, táo, lê, thơng, bồ đề… Tổng số có 30 chi khác nuôi cấy thành công Do trồng rừng ăn trồng lâu năm phí ban đầu nhân giống in vitro chấp nhận - Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép Về nguyên tắc, vi ghép nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, thông qua dinh dưỡng tự nhiên gốc ghép Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích thước khoảng từ 0,2-0,5 mm tách từ búp non sinh trưởng mạnh mẹ trưởng thành, gốc ghép mầm giá nảy mầm từ hạt giống hoang dại, tồn ghép ni dưỡng điều kiện ống nghiệm vô trùng Phương thức thường dùng để tạo giống ăn bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép cành chiết đầu dòng làm nguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà Phương thức cho phép thu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 99 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] hồn tồn bệnh mang đặc điểm di truyền mẹ cho mắt ghép Có nhiều cách ghép khác nhau, chẳng hạn: (1) Ghép lên mặt cắt: đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt lát cắt, vùng tượng tầng (2) Ghép chữ Tngược: dùng đầu nhọn lưỡi dao cắt lỗ ghép hình chữ T-ngược, chân chữ T mặt cắt để dễ bộc lộ vùng tượng tầng (3) Ghép hàm ếch: khoét thân mầm cách mặt cắt mm vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm chiều dày lớp vỏ Đặt mắt ghép vào đáy hàm ếch (Hình 4.3) Ghép lên mặt cắt Vỏ Tượng tầng Lõi Ghép vào vết T-ngược Ghép vào lỗ thân Hình 4.3 Vị trí mắt ghép ba kiểu vi ghép khác 2.1.2 Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot culture) Hệ thống nuôi cấy có u cầu tương tự với ni cấy mơ phân sinh đỉnh, khác nguồn mẫu vật nguồn gốc bất định chồi Đỉnh chồi bất định phát triển trực tiếp mẫu vật gián tiếp từ mơ callus, mà mơ callus hình thành bề mặt vết cắt mẫu vật (Hình 4.4) Một số loại mẫu vật dùng sau: - Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải… - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao… - Cuống lá: thủy tiên… - Các phận hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn - Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 100 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] - Đoạn mầm: măng tây… A B Hình 4.4 Tái sinh chồi bất định nhân giống in vitro Hylotelephium sieboldii A: Chồi bất định B: Cây in vitro hoàn chỉnh Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu tế bào nhu mô (parenchyma cells) nằm biểu bì phía bề mặt thân; số tế bào trở thành mô phân sinh túi nhỏ gọi thể phân sinh (meristemoids) phát triển Các thể phân sinh rõ ràng có nguồn gốc từ tế bào đơn Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng thực vật tùy thuộc vào nồng độ phytohormone Nghiên cứu tạo chồi mô nuôi cấy linh sam Douglas cho thấy cytokinin (BAP μM) cần thiết cho phát sinh chồi bất định, có ba kiểu phản ứng khác có kết tùy thuộc vào nồng độ auxin cung cấp Nồng độ auxin thấp (NAA μM) có chồi phát triển Khi nồng độ auxin cao (NAA μM) mầm tạo callus nhiều chồi Khi cung cấp riêng auxin (NAA = μM) có callus tạo thành Sự phát triển chồi bất định gián tiếp qua giai đoạn hình thành callus sở (basal callus) từ chồi tách ni cấy Các chồi sau phát triển từ ngoại vi mơ callus khơng có quan hệ ban đầu với mơ có mạch dẫn (vascular tissue) mẫu vật 2.2 Nhân giống thông qua giai đoạn callus Trong khn khổ mục đích nhân giống in vitro tái sinh hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ni cấy ban đầu khơng nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 101 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh mà phát triển thành khối callus (Hình 4.5) A B Hình 4.5 Callus (A) tái sinh chồi từ callus (B) chi Lilium Tế bào callus cấy chuyển nhiều lần không ổn định mặt di truyền Để tránh tình trạng thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức callus sơ cấp để tái sinh hy vọng thu tái sinh đồng Thông qua giai đoạn callus cịn thu cá thể virus trường hợp Kehr Sehaffer (1976) thu tỏi 2.3 Nhân giống thông qua phát sinh phơi vơ tính-cơng nghệ hạt nhân tạo 2.3.1 Phơi vơ tính Một phương thức nhân giống vơ tính tạo phơi vơ tính từ tế bào callus Năm 1958, Street Reinert hai tác giả mơ tả hình thành phơi vơ tính từ tế bào đơn cà rốt (Daucus carota) Đến năm 1977, Murashige cho phơi vơ tính trở thành biện pháp nhân giống in vitro Ở số lồi, phát sinh phơi vơ tính hình thành trực tiếp từ phôi bất định (adventitious embryos) nằm phôi tâm (nucellar embryos) Đến nay, công nghệ phơi vơ tính coi cơng nghệ có triển vọng cho nông nghiệp kỷ 21 Phôi vơ tính cá thể nhân giống (propagules) có cực tính bắt nguồn từ tế bào soma (Hình 4.6 4.7) Chúng giống phơi hữu tính (zygotic embryo) hình thái, trình phát triển sinh lý, sản phẩm thụ tinh giao tử đực giao tử cái, khơng có q trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination), Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 102 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] đ Công nghệ di truyền kháng chất diệt cỏ Ước tính khoảng 10% tổng sản lượng lương thực hàng năm giới bị mát cỏ dại, tiêu tốn khoảng 10 tỷ USD sử dụng 100 loại hóa chất khác để diệt trừ Hơn nữa, dùng thuốc diệt cỏ dại bị hạn chế nhiều loại thuốc khơng phân biệt cỏ dại trồng Glyphosate (phosphonomethyl glycine) loại thuốc diệt nhiều loại cỏ dại chúng làm chết trồng Vì vậy, tạo giống chuyển gen chống chịu glyphosate dùng phổ biến để diệt cỏ Một hướng nghiên cứu chuyển gen sản xuất dư thừa 5-enolopyruvyl-shikimate-3-phosphatase (EPSP), enzyme bị ức chế thuốc diệt cỏ glyphosate Nghĩa sản xuất nhiều enzyme EPSP chúng chống chịu glyphosate Chất diệt cỏ phương pháp chọn lựa để kiểm soát cỏ dại hầu hết hệ thống nông nghiệp quy mô lớn Chúng đóng vai trị quan trọng việc tăng sản lượng trồng cách giảm thiểu cạnh tranh trồng với cỏ dại không gian, ánh sáng, nước chất dinh dưỡng Cỏ dại hoạt động nguồn cung cấp tác nhân gây bệnh cho trồng Do gen kháng chất diệt cỏ gen thị chọn lọc hiệu trồng trọt, nên tính trạng chuyển gen sản xuất thương mại hóa, thứ (variety) chống chịu chất diệt cỏ trồng chuyển gen sinh trưởng rộng rãi Dựa sở biểu gen không mẫn cảm chất diệt cỏ, thoái biến chất diệt cỏ biểu mạnh sản phẩm gen đích chất diệt cỏ, mà tính kháng chuyển gen thích hợp phạm vi rộng chất diệt cỏ 2,4-D, glyphosate, glufosinate, Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] protoporphyrinogen oxidase inhibitors, imidazalonones, chlorsulfuron/ sulfonylureas, bromoxynil, triazines isoxazoles Hiện nay, có chứng tốt cho thấy không tăng sử dụng chất diệt cỏ, mà điều chỉnh trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ cung cấp cho nông dân cho kết giảm sử dụng glyphosate tới 33% giống đậu tương Roundup Ready, giảm sử dụng glufosinate khoảng 20% giống canola Liberty Link 6.Công nghệ di truyền kháng sâu-bệnh 6.1 Kháng côn trùng Sử dụng hóa chất để phịng trừ sâu bọ trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường Các trồng bông, ngô khoai tây chuyển gen sinh trưởng thương mại biểu độc tố Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo tính kháng trùng nhóm nhainghiền (chewing insects) B thuringiensis tổng hợp protein -endotoxin tinh thể mã hóa gen Cry Khi trùng ăn vào bụng, prototoxins bị đứt gãy dày kiềm côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động Các liên kết tạo receptor đặc trưng tế bào biểu mô ruột làm thành lỗ chân lông cuối gây chết côn trùng Một số ưu điểm độc tố Bt sau : - Tính đặc hiệu, protein Cry hoạt động chống lại một vài lồi trùng - Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhận biết - Các ảnh hưởng không bất lợi bị giảm xác nhận trùng khơng phải đích địch thủ tự nhiên trùng - Độc tính với động vật có vú thấp - Có thể thối biến dễ dàng Kết nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein tinh thể trừ sâu vi khuẩn B thuringiensis chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu rõ trồng Để nâng cao hiệu độc tố, nhà nghiên cứu cắt bớt gen để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà khơng cần phần gen phụ khác Gen Cry cắt bớt biểu tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen tự nhiên Hiện nay, 40 gen khác mang tính kháng trùng hợp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] trồng chuyển gen với vài giống thương mại hóa nước khác Mỹ Úc Đưa lợi ích độc tố Bt kiểm sốt trùng, phương thức quản lý khác phải chấp nhận để làm chậm phát triển tính kháng trùng Bt Những bao gồm : - Bố trí vùng bên cạnh trồng không chuyển gen Bt làm nơi trú ẩn để giảm áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng - Triển khai gen kháng trùng khác (ví dụ: protease inhibitors) - Dùng loại độc tố Bt cho receptors đích khác - Dùng promoter khác để điều chỉnh biểu gen Bt - Dùng promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter) trùng ăn mà khơng tổn hại đến kinh tế phận quan trọng thực vật Có hướng khác để phát triển tính kháng trùng cho chuyển gen dựa sở: protease inhibitors, -amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, virus trùng tạo dịng, tryptophan decarboxylase, anti-chymotrypsin, anti-elastace, nhân tố ức chế trypsin tuyến tụy bò nhân tố ức chế lách 6.2 Kháng virus thực vật Các virus gây thiệt hại đáng kể hầu hết trồng lương thực cho sợi phạm vi giới Nhiều phương thức sử dụng để kiểm soát xâm nhiễm virus bao gồm xử lý hóa học để giết vector virus, chuyển vào trồng gen kháng tự nhiên từ loài liên quan, sử dụng chẩn đoán dẫn để đảm bảo nhân giống vật liệu khởi đầu virus (ví dụ: hạt, củ…) Tuy nhiên, phát triển khai thác tính kháng xuất phát từ tác nhân gây bệnh, ví dụ sử dụng trình tự xuất phát từ virus biểu chuyển gen để cung cấp tính kháng virus thực vật Hướng dựa sở nghiên cứu gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) thực vật khởi đầu với chủng virus nhẹ cung cấp bảo vệ chống lại gây nhiễm với loại chủng virus virus liên quan gần gũi Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh đòi hỏi chuyển nạp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 127 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] gen thực vật với trình tự xuất phát từ virus; tính kháng vật chủ xuất cho kết từ hai chế khác nhau: (1) bảo vệ dàn xếp biểu protein virus tự nhiên biến đổi (ví dụ protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết), (2) bảo vệ dàn xếp mức độ phiên mã (“RNA-mediated resistance”), đòi hỏi phiên mã RNA từ chuỗi hoàn chỉnh phần xuất phát từ virus đích (bao gồm gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease, protein vận động…) Trường hợp phân tử làm tảng cho tính kháng xuất phát từ virus đối tượng nghiên cứu chuyên sâu Cơ sở tính kháng virus đặt RNA (RNA-mediated) im lặng gen hậu dịch mã có khả tương tự, phản ánh hoạt động trong tế bào thực vật để phát hiện, bất hoạt đào thải DNA RNA ngoại lai Ví dụ: gen nội sinh thực vật chèn vào virus PVX biểu im lặng gen nội sinh thực vật Để tạo giống trồng chống chịu virus, có hướng: - Bảo vệ chéo - Sử dụng RNA vệ tinh - Sử dụng enzyme replicase 6.2.1 Bảo vệ chéo Là biện pháp lợi dụng tượng lớp vỏ protein virus thứ cản trở xâm nhập virus thứ hai, nghĩa cho nhiễm loại virus có độc lực vừa phải chống xâm nhiễm virus có độc lực cao Để tăng cường khả biểu gen protein vỏ người ta gắn thêm vào đuôi phần promoter 35S từ virus khảm súp lơ (CaMV) đưa vào genome trồng nhờ hệ thống Ti-plasmid Agrobacterium Thành công theo hướng kháng bệnh virus khảm thuốc (TMV) thuốc lá, nhờ biểu gen cp Thí nghiệm đồng ruộng cà chua biểu gen cp kháng bệnh TMV tiến hành năm 1987 Mỹ cho kết kháng bệnh cao Sau hàng loạt kết chứng tỏ gen cp có hiệu lực tất loại virus gây bệnh 20 loài khác kể loại trồng cà chua (1987), dưa hấu (1987), lúa (1990), khoai tây (1989, 1990), củ cải đường… Qua hàng loạt thí nghiệm đồng ruộng, Bộ Nơng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập mơn Công nghệ sinh học 128 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] nghiệp Mỹ cơng nhận giống quốc gia cho giống bí xanh (Freedom II) kháng virus (1995) Các giống khoai tây, dưa chuột, cà chua chống bệnh virus tiếp tục công nhận 6.2.2 Sử dụng RNA vệ tinh Trong số quần thể virus có thực thể giống virus chứa phân tử RNA nhỏ gọi RNA vệ tinh (sattelite RNA) RNA vệ tinh dường khơng mã hóa cho protein nhân lên nhờ enzyme RNA từ virus bình thường hợp thành tiểu phần giống virus có vỏ protein Một số RNA vệ tinh ức chế mạnh nhân virus bình thường cDNA từ RNA vệ tinh tổng hợp với tham gia promoter 35S CaMV đưa vào thông qua hệ thống Ti-plasmid Agrobacterium Các chuyển gen kiểu thể tính kháng virus thuốc virus khảm dưa chuột tốt Tuy nhiên, so với tính kháng theo phương pháp bảo vệ chéo, tính kháng khó đạt phải cần nồng độ virus cao Bên cạnh đó, người ta lo ngại dễ xảy tượng đột biến từ phân tử RNA vệ tinh thành loại gây độc cho chủ 6.2.3 Sử dụng enzyme replicase Replicase enzyme tham gia trình tổng hợp nucleic acid virus, hoạt hóa cho nhân lên DNA RNA theo chế bổ sung Cây trồng chống virus tạo chuyển gen replicase với nhiều đoạn bị biến đổi bị cắt bớt, kết cho thấy kháng virus cao Ví dụ, thuốc theo phương pháp chuyển gen biểu gen replicase bị cắt bớt cho khả kháng virus khảm thuốc tốt (1990) Hiện nay, chưa thành công với enzyme replicase virus khảm từ cỏ alfalfa bệnh virus khảm thuốc Protoplast đại mạch chuyển gen replicase từ virus khảm brome chưa kháng bệnh đại mạch Tuy thế, từ tìm thấy hướng ứng dụng gen replicase, người ta hy vọng vào hướng 6.3 Kháng bệnh nấm Nấm bệnh gây hại trồng nặng, nước nhiệt đới có độ ẩm cao Cải tạo giống chống nấm hại dựa nguyên lý đưa gen mã hóa Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Nhập môn Công nghệ sinh học 129 Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] loại enzyme có tác dụng ức chế trực tiếp gián tiếp đến phát triển nấm hại Enzyme làm thối hóa thành phần vỏ tế bào nấm chitin β-1,3 glucan loại ý Khi có gen chitinase chuyển vào, thuốc chuyển gen tăng cường hoạt tính chống nấm hại Sự biểu đồng thời hai gen chitinase glucanase thuốc làm cho có tính kháng nấm hại cao có gen độc lập Cũng tương tự, cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hẳn, sau chuyển giao hai gen nói Protein ức chế ribosome (ribosome inhibitive protein, RIP) biểu tính kháng nấm khả quan Cây thuốc cho tính kháng nấm tốt, chuyển giao đồng thời gen RIP chitinase 6.4 Kháng bệnh vi khuẩn Đối với vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống công nghệ sinh học bắt đầu Về có ba hướng : - Dùng gen mã hóa enzyme làm thối hóa thành tế bào vi khuẩn, ví dụ gen lysozyme từ nguồn tế bào động vật gen lysozyme từ thực khuẩn thể T4 đưa vào thuốc khoai tây Các gen biểu cao hoạt tính lysozyme tế bào có khả phịng trừ vi khuẩn Erwina carotovora tốt - Gen mã hóa -thionin-cystein chuyển giao sang thuốc phòng ngừa vi khuẩn Pseudomonas syringae - Cấy gen sản xuất protein làm giảm độc tố vi khuẩn, hướng có nhiều hứa hẹn Các gen chủ yếu sản xuất loại enzyme phân hủy độc tố vi khuẩn, vô hiệu hóa tác hại chúng IV Sản xuất dược liệu sinh học Các hợp chất tự nhiên Thực vật nguồn cung cấp hợp chất hóa học dùng làm dược liệu có giá trị Những sản phẩm này, biết chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường sản xuất với lượng nhỏ (dạng vết) thực vật khơng có chức trao đổi chất rõ ràng Chúng dường sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] mơi trường chung quanh, thích nghi với stress mơi trường bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật Để sản xuất sản phẩm thứ cấp từ thực vật, mơ thực vật ngoại sinh từ hồn chỉnh nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) điều kiện vơ trùng (Hình 4.14) Cơ sở kỹ thuật ni cấy mơ thực vật dựa tính tồn thể hóa sinh (biochemical totipotency) tế bào thực vật Nhiều sản phẩm trao đổi chất sản xuất từ ni cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hồn chỉnh Có nhiều chứng cho thấy có mối quan hệ ngược (feedback) tốc độ sinh trưởng sản xuất chất thứ cấp Khi tốc độ sinh trưởng cao, trình sơ cấp tế bào phân chia tế bào sản xuất sinh khối tế bào Trong pha tĩnh, sinh trưởng giảm đến mức tối thiểu, sản xuất tích lũy chất thứ cấp tăng lên Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Hình 4.14 Ni cấy tế bào dịch huyền phù thực vật hệ lên men 100 L Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ôn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] Các chất trao đổi thứ cấp hay cịn gọi chất thứ cấp xếp ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu glycoside Các alkaloid có dạng tinh thể hợp chất chứa nitrogen, tách chiết cách dùng dung dịch acid Alkaloid có hoạt tính sinh lý tất động vật sử dụng công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine morphine Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid sử dụng chất mùi, chất thơm dung môi Glycoside bao gồm phenolic, tanin flavonoid, saponin cyanogenic glycoside, số chúng sử dụng làm chất nhuộm, chất mùi thực phẩm dược phẩm 1.1 Các alkaloid Người ta thu chất caffein từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica, betalain callus củ cải đường, berberin từ tế bào Coptis japonica (loài phải trồng từ 4-6 năm thu hàm lượng đáng kể berberin rễ, so với hàm lượng thu sau tuần phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất sử dụng rộng rãi công nghiệp hương liệu y học Chất reserpine có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp bệnh rối loạn tuần hoàn sản xuất phương pháp nuôi cấy tế bào Rauwolfia serpentina Nuôi cấy tế bào 30 ngày hệ lên men quy mô lớn sản xuất 3.500 kg reserpine, tương đương với lượng hàng năm giới thu từ rễ Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) sản xuất loại alkaloid scopolamine từ tế bào Hyoscyanus aegypticus ni cấy hệ lên men khơng có cánh khuấy Bằng cách chọn lọc dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng kỹ thuật gen, người ta tăng sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus tế bào Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với dược liệu bình thường Một số nghiên cứu phân lập dòng tế bào Cantharanthus sản xuất serpentin ajmalacine từ nuôi cấy in vitro Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt người ta đưa sản lượng alkaloid Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hỗ trợ ơn tập [ĐỀ CƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH ĐẠI HỌC] tạo 162 mg/L serpentin, dòng tạo 72 mg/L serpentin với 264 mg/L ajmalacine Mới người ta hồn thiện cơng nghệ ni cấy tế bào Catharanthus roseus để sản xuất viblastine vincristine hai chất kháng ung thư mạnh, có nhu cầu cao chúng sử dụng để chữa ung thư máu Sikuli cs (1997) sau gây nhiễm Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes nhận thấy hàm lượng hyoscyamine rễ đạt cực đại sau tuần nuôi cấy