Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua da

Trang 1

DOAN THI YEN

NGHIEN CUU KHA NANG HAP THU

VA GIAI PHONG THUOC NEOMYCIN CUA MANG

BACTERIAL CELLULOSE DE PHUC VU VIEC SU DUNG QUA DA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Thành

Trang 2

LOI CAM ON

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tơi trong

suốt thời gian làm luận văn vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tơi trong quả trình làm thực nghiệm hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 2 năm học tại đây

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng, người thân, bạn bè, những người luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những lúc gặp nhiều khó khăn nhất

Hà Nội, thang 11 nam 2016 Hoc vién

Trang 3

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là

kết quả nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực

nghiệm, qua xử lí thống kê, khơng có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã cơng bó Trong tài liệu này tơi có sử dụng một số tài liệu của một

số tác giả, tôi xin phép các tác giả này đề bồ sung cho luận văn của mình Nêu sai tơi hồn tồn chịu trách nhiệm

Ha Noi, thang 11 nam 2016 Hoc vién

Trang 4

MUC LUC 0962710005 1 1 Li do chon dé tai c.cccccccccssscsssescscsceseccsssesceseccessescescsescscsscsacssaceccecacacaceavacaees 1 “0 (án i04 i80 = 3 SN j1 ¡0408:1402 02: 00 — 3 “SÀ/ 8 0/00 ¿6 (( cố nn e 3

5 Phương pháp nghiÊn CỨU - 2c c2 1111151 111811 111811 511181111 8xx, 4

6ó Ý nghĩa khoa học và thực tiỄn - - + - SE 4t St E1 E11 4

7 DONG bn 0i 0a nh 434 4

NỘI DỮƯNG G31 21 1 116111121011 1101 1H 0 HT H100 0 0n g0 cv 5

CHUONG 1 TONG QUAN TÀI LIỆU - 5¿-55c2cxcczscsrxeerrrrre 5

1.1 Tổng quan về BC «ket E3 cưng gàng cư 5

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC 5-5 TS TT TH 3

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc của BC . ca Set St 1111185121 1511151115111515s1e xe 6

1.1.3 Tỉnh chất li hóa của BCoicccceccccccsccscsssssssvscssssvssesvsvsassusacsvssarssacsvsneevsneaes 7 1.1.4 Các yễu tổ ảnh hướng đến quá trình tạo màng BC -e-s©5e: 9 1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua đáa - c6 SE kEE SE E3 SE chEEEcvgErrtcrcrgrkceở 11

1.2.1 Tr@n thé giGi occ ccccccsccsescsesscsssecsececsescssesessssesusscstsacavsusacsesacavseeaceeees 11

1.2.2 Tat Vidt Nam 14 1.3 Tổng quan vỀ neormyCI :- - <6 2k SE kg v.v cư 15 “A2 j.ảẢ, aa ốỀỀ 15

1.3.2 Tỉnh chất lí hóaa - c5+-25t SE SE 2H 2 HE tErrrre 16

1.3.3 Dược lí và dược động hỌC cv ngu l6 1.3.4 Chỉ định và chống ChỉỈ đ|HI Q Q n0 1 11 11K vu ng ri 17

Trang 5

1.5.1.Cấu trúc và chức năng sinh Ìý Của đa - «5< ccckccercrkckrrsrerkceee 18 1.5.2 Cơ chế hấp thu các chất quA đA .- các Set ctkekEEEkeErerrrererkrkee 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

“À8: i64 0 25

2.2 Phương pháp nghiên CỨU (c1 1911190 11 ng ng ca 25

2.2.1 Chuẩn bị màng BC - -c-cctS SE TH E111 1111111111 Tsrred 25

VN NNNI.1 10,.1, 4600 n a 25

2.2.1.2 Tạo màng BC tỉnh Chế - - tt T1 E111 1111111111111 cv, 26

2.2.1.3 Kiểm tra độ tỉnh khiết màng BC tỉnh chế -c- «sec 27

2.2.1.4 Xác định các tiêu chuẩn của mang BC tinh chế sử dụng chế tạo

màng hấp thu fÏHMỐC cá St HE TT HT TH HH TT HH nggg 28 2.2.2 Chế tạo màng BC hấp tu H€OIVCÏH - - SctéE SE Ekekrrkrkekersred 30

2.2.2.1 Chuẩn bị bộ đệm . sung iu 30

2.2.2.2 Xây dựng đường chuẩn H€OTHCÏH cà Set cEterererrkerereced 30 2.2.2.3 Chuẩn bị môi trường cho BC hấp thu thUỐC c- Sex re 31 2.2.2.4 Xác định lượng neomycin hấp thu vào màng BC .-. c-‹- 31 2.2.3 Xác định tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin thông qua hệ thông được

£hiiẾt ÑỂ, 5t SE 22221 E2 2111 T 1 1 EErrie 32

2.2.4 Phương pháp xử lí thống ÄÊ - St SE TA EEEETErrrrkerrkerred 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN -.:c5ccccccccccsrrree 36

3.1 Thu màng BC và tinh chế màng .- - 5 SE £kEeEE£ESE£veEererere 36 3.1.1 Thu mang BC từ các môi trường ÏÊH TH€H c5 sex xx+a 36

3.1.2 Tỉnh ChE MGNg BC vicccccccccccccccssscsssssesssssessserssssvcussssvessscevscssussrsesesavavsvens 37

Trang 6

3.2.2 Kết quả đo pH của màng BC tinh Che vevcicccccccssssscssssssssssestsssesssessssen 39 3.2.3 Kết quả khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC 40 3.3 Phương trình đường chuân neomycin trong dung dich dém PBS 43 3.4 Ti 18 neomycin hấp thu vào màng BC - 6 cv ersreeree 44 3.5 Tỉ lệ neomycin giải phóng từ các hệ thống màng BC mang thuốc đã thiết

_ 48

3.6 Đánh giá động học giải phóng neomycin từ màng BC mang thuốc 54

.450800897.9101/.0.4058 6 20007 57 ca 57

2 Kiến nghị Ghi 57

Trang 7

A-BC BC CNM CS ĐHSP Dk KTNN PBS NCKH&CGCN Nxb Mant MT1 MT2 MT3 S—BC

Agitade — Bacterial cellulose Bacterial celullose

Cao nam men

Cong su

Dai hoc Su pham

Duong kinh

Kỹ thuật nông nghiệp Phosphate buffered saline

Nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Nhà xuất bản

Khối lượng thuốc hấp thu

Môi trường | Môi trường 2 Môi trường 3

Trang 8

DANH MUC BANG

Bảng 2.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng BC 26 Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS - - G1 HH HH ng ng nu 30 Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm cho màng BC hấp thu thuốc 31

Bảng 3.1 Kết quả thu màng BC tươii - St tk re, 37

Bảng 3.2 Kết quả đo pH ở các lô màng thí nghiệm 575655 40 Bảng 3.3 Tốc độ mất nước của màng BC - -ccc << csị, 38

Bảng 3.4 Tỉ lệ hap thu thuéc neomycin vao màng BC dày 0,5cm 44

Bảng 3.5 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vao màng BC dày 0,3cm 44

Bảng 3.6 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ

môi trường cao nẫm men (màng CNM|) ¿- - < ctStceEtEckceErkrkererrred 49

Bảng 3.7 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ

môi trường nước dừa (màng dừa) 5c ĂĂSSScSSsSssresee 50

Bang 3.8 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ

0010806)/0/0118110(6/v6:1986007)4150.102 0P — 51 Bang 3.9 Tỉ lệ giải phóng thuốc từ dung dịch neomycin đối chứng nồng 9201511010777 51 Bảng 3.10 Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM (trong môi trường pH = 7,4) theo mơ hình động học ‹- - 54 Bảng 3.11 Các tham số của q trình giải phóng thuốc từ màng đừa (trong

môi trường pH = 7,4) theo mơ hình động học .-cc (c2 <4 50

Bảng 3.12 Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng gạo (trong

Trang 9

Hinh 1.2 Cellulose thực vật QC nu vu 6

Hình 1.3 Câu trúc A — BC (a) và S — BC (Đ) -c-cc sec ckekeesrereeed 7

Hình 1.4 Thí nghiệm cây BC dưới da động vật thí nghiệm 8

Hình 1.5 Ung dung BC bọc vết thương cho vùng đa bị bỏng 12

Hình 1.6 Mang BC — lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da 13

Hình 1.7 Sử dụng màng BC hấp thu thuốc điều trị nhiễm khuẩn 13

Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo của neormycin - - - + 5s kszxcsezseesrxee 15 Hình 1.9 Cau trúc siêu hiển vi của đa - .- << s+++++ re 20 Hình 1.10 Cẫu tạo của biểu bì đa người -‹ c< << eens 20 Hình 2.1 Quy trình tỉnh chế màng BC ¿56621 kEeEcEeerersee, 27 Hình 2.2 Mơ hình thí nghiệm khuếch tán thuốc qua da Franz 33

Hình 3.1 Ni cấy màng BC tại phịng thí nghiệm Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 - 2c cScSĂSSSesesseees 36 Hình 3.2 Mơi trường dinh dưỡng lên men thu màng - - - 36

Hình 3.3 Màng BC tạo ra từ vi khuẩn 4 xyÏi7n cá cccceccrercec 38 Hình 3.4 Kết quả tìm sự hiện diện của glucose trong dịch chiết màng 0 39

Hình 3.5 Kết quả tìm sự hiện điện của protein trong dịch chiết màng BC 39

Hình 3.6 Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm l 40

Hình 3.7 Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 2 41

Hình 3.8 Khả năng cản khuẩn của vải gạc vô trùng c 6c cccscccc: 42 Hình 3.9 Phương trình đường chuẩn của neomycin trong môi trường 9()0: %4 44 Hình 3.10 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày

Trang 10

MO DAU

1 Lido chon dé tai

Trong những năm gần đây, khoa học đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng

tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose Vật liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [32] Trong đó, Bacterial Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của

các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài Đây là một loại vật liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm

Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, đễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mơ cơng nghiệp Về mặt

tính chất, BC có độ tỉnh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác

BC có thé phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngồi ra, BC cịn có độ bèn tỉnh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ơn định về kích thước BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn,

giải phóng nước kéo dài Đơng thời BC cịn có tính xp, độ âm cao, có lực

bền cơ học cao Vì vậy, BC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ

thong giải phóng thuốc qua da, qua đường miệng và mô — kĩ thuật, và một số

ứng dụng y sinh học khác [6], [9], [14], [19], [20], [22], [24]

Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngồi những đặc

điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các vi sinh vật khác,

ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của tia cực

tím Đồng thời BC cũng là vật liệu khơng gây kích ứng da (do có bản chất là

saccharide) [24]

Trang 11

[53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45], benzalconium chloride [19] va sulfadiazine bac [37] cho két quả tích cực Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh răng các tính chất cơ học của BC có độ bên và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và đi chuyên của tế bào da người [14], [18], [19]

Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thu thuốc là khả năng

chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, khơng dị ứng với da và khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan Hầu hết

các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau Do đó,

một hệ thông hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chi một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chỉ phí

[11], [53]

Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da khơng có triệu chứng toàn thân, được

y học khuyến cáo tránh sử dụng các chế phâm kháng sinh thường được dùng rộng rai toan than nhu penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin, do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn khang

thuốc Đề giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm

chứa các loại kháng sinh bôi trên da

Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích đề điều trị vết thương do tụ cầu và liên cầu gây ra Tuy nhiên, neomycin cũng như một số chế phẩm kháng sinh khác được khuyến cáo tránh sử dụng toàn thân do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc Để giảm thiểu

phát triển vi khuân kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng

Trang 12

thu vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ 85,01% ở vùng da tốn thương) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn

cảm khi điều trị lâu đài [17] Điều này khơng thích hợp với việc điều trị một

số bệnh viêm da mủ trên da cần điều trị kéo dài Bên cạnh đó, chế phẩm dạng

dung dịch thường nhanh khô và khơng có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài

xâm nhập Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vẫn đề này là dùng một loại vật

liệu có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ âm vết thương và

cản khuẩn

Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của neomycin trong điều trị kháng khuẩn trên da, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển vọng Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua da”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng qua da

- Thiết kế, chế tạo màng BC hấp thu thuốc neomycin nhiều nhất Đánh giá khả năng giải phóng neomycin kéo dài từ hệ thông màng BC mang thuốc 3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo màng và xử lí màng BC có kích thước và tính chất phù

hợp với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da

- Đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng BC in vitro

4 Vật liệu và phạm vỉ nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ sự lên men của vi khuẩn 4

xylinum; thuốc neomycin tỉnh khiết 98% và một số chất khác

Trang 13

- Lên men thu màng BC từ một số môi trường - Tinh chế màng BC thô

- Đánh giá độ tinh khiết của màng BC

- Chế tạo màng BC hấp thu thuốc, xác định lượng thuốc hấp thu vào màng - Xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC mang thuốc

- Xử lí thơng kê

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học:

Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng trên da Từ kết quả nghiên cứu của để tài là cơ sở

để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng hấp thu cũng như kiểm soát

thuốc của màng BC trên nhiều loại thuốc khác nhau nhằm tăng hiệu quả điều

trị của các loại thuốc đó

Ý nghĩa thực tiễn:

Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giải phóng thuốc kéo

đài này có thé làm tăng sinh khả dụng của thuốc và khắc phục được nhược

điểm của thuốc ở dạng thơng thường 7 Đóng góp mới của luận văn

Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc neomycin trong điều trị nhiễm khuẩn trên da

Kết quả nghiên cứu của đề tài có thê định hướng tạo hệ thống giải phóng

Trang 14

NOI DUNG

CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tổng quan về BC

Cellulose là đại phân tử tồn tại phô biến nhất trên trái đất, là thành phan

chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của

vi sinh vật Cellulose vi khuẩn (becterial cellulose — BC) là sản phẩm trao đôi

chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [55]

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC

BC là một polysaccharide được tổng hợp bởi các loài vi khuân khác nhau,

chăng hạn như Aerobacter, Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium,

Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium va Sarcina [39] Cho dén nay, A xylinum duoc danh gia là lồi vi khuẩn có khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên 4 xyijmwm là loài vi khuẩn Gram âm sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những lồi tiễn hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía Mỗi tế bào 4 xyiinưm có thể chuyên hóa tới 108 phân tử glucose va phan ttr cellulose trong 1 gid nén kha nang tong hop cellulose 1a rất lớn [3], [6], [8], [10], [27]

A xylinum có dạng hình que, thắng hay hơi cong, có thê di động hoặc không và khơng sinh bào tử (hình 1.1) Chúng là vi khuẩn Gram âm nhưng

trọng lượng của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường nuôi cấy 4 xyiimm thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế

chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [11] Trên môi trường rắn sau khoảng 3 — 7 ngày nuôi cẫy, khuẩn lạc 4 xyÏimum có đạng nhỏ,

nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau Ì tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà

Trang 15

không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cầu trúc hóa học cơ bản

của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cẫu trúc đại thể [14], [18]

Theo Brown (1999) [21], BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ cellulose, đường

kính 1,5nm, kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều

bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 — §nm Hình 1.2 cho thấy rõ cầu trúc này

i

:

Hình 1.1 Cellulose vi khuẩn

(x 20 000 lần) [18] (x200 lân) [18]

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cây Khi nuôi

Trang 16

(b) Hình 1.3 Cấu trie A — BC (a) va S — BC (b) [36]

BC được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy tĩnh (S — B) có các bó xellulose

chuỗi xếp song song quanh trục Các sợi cellulose liên tục được tạo ra từ những lỗ được xếp đọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi

sợi và bị đây xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các đải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song, sợi S — BC kéo dai va chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quân thể tế bào 4 xylinum

Khi nuôi cây động, một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng huyền phù phân tán trong đó chuỗi B — 1,4 glucan xép một cách ngẫu nhiên BC được tạo ra bằng phương pháp động (A — BC) dưới đạng các hạt nhỏ, các soi roi ram, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cây, hoặc các hạt bơng hình sao phân tán trong môi trường, tuy nhiên bề mặt cắt

ngang của sợi A — BC nhỏ hơn sợi SŠ — BC Có các nghiên cứu cho rang, su

khác nhau giữa hai loại này ở mức độ kết tinh của nó và kích cỡ kết tinh của A — BC nho hon S —- BC

1.1.3 Tính chất lí hóa của BC

Khả năng tương thích sinh học cao

Trang 17

collagen ở đặc điểm không gây dị ứng với hệ miễn dịch Vì collagen có bản

chất protein nên dễ bị nhận biết với hệ thống miễn dịch và dễ bị kích hoạt phản ứng miễn dịch, trong khi đó BC có lợi thế riêng biệt như một

polysaccharide là ít miễn dịch kích thích

Khả năng tương thích sinh học của BC đã được nghiên cứu và chứng minh thành công trong các nghiên cứu trước đây [39] Khả năng tương thích sinh học của BC được nghiên cứu cho đến nay vẫn cho kết quả tương tự Helenius và cộng sự (cs) (2006) [28] trong mét nghién ctu in vivo cay

cellulose vi khuân đưới đa ở chuột Kết quả cho thấy sau 12 tuần, phát hiện

bằng kính hiên vi cho thấy khơng có viên nang hoặc các tế bào xơ cho thây cơ thé không phản ứng với BC (Hình 1.4) Hơn nữa, quanh vết cấy không có hiện tượng bị đỏ, sưng, hoặc tiết dịch

a Một tuần sau khi cấy, BC cho thấy không có dấu hiệu phản ứng tại vị trí cấy

b Độ phóng đại cấu trúc xốp của BC cho thấy xâm nhập của nguyên bào sợi thành các mạng lưới BC sau 12 tuần cấy Đầu mũi tên là dấu hiệu của collagen được tổng hợp bởi các nguyên bào sợi

Hình 1.4 Thí nghiệm cay BC dưới da động vật thí nghiệm [28]

Độ bẩn cơ học lớn: BC có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng

Trang 18

Độ tỉnh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tông hợp

không có chứa lignin hay hemicellulose Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [49], [55]

Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: BC có cẫu trúc dạng xốp nên có khả năng giữ nước đáng kể Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó Bên cạnh đó BC cịn có khả năng giải phóng nước kéo dài Đây cũng là đặc tính của BC mà các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng BC trong lĩnh vực giải phóng thuốc [10], [14], [19], [55]

Tính chất của BC có thê thay đổi ở mỗi quá trình tổng hợp trong những môi trường khác nhau [38] Các nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là

một nỗ lực đề tìm kiễm các ứng dụng sáng tạo BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc điều trị nhiễm khuẩn trên da

1.1.4 Các yêu tổ ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC

Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic, và các sản phẩm trao đôi chất Chính vì vậy, các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật Anh hưởng của nguôn cacbon đên năng suât sản xuât BC được thê hiện ở

bang 1.1

Trang 19

Nguôn nữơ: ý nghĩa chủ yêu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu cho cơ thê sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH; và -NH-) trong các phân

tử aminoaxiIt, nucleotit, các bazơ dị vịng [4ó] Nguồn nito dé hap thu nhất với

vi sinh vat 1a NH; va NH¿” Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa

trong các thức ăn hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ là (NH¿);S5O¿, NH¿NO:, nguồn

nitơ hữu cơ là pepton, cao nắm men [46]

Nguồn dinh dưỡng khoáng: Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các ngun tơ khống của tế bào vi sinh vật Photpho có mặt trong hâu hết các thành phần của tế bào Đề đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng photpho vô cơ như K;HPO¿, KH;PO/, KNO;¿, Ngồi ra cịn nhiều nguyên tô vi lượng cũng ảnh hưởng

đến qua trinh tao mang BC nhu Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl, Mot trong số

nguyên liệu chủ yếu ngày nay được sử dụng để tạo màng BC là nước đừa giả, nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường, nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tô vi lượng nữa [46]

Trang 20

11

nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi

lượng như Fe, Zn, và axit amin

Ngoài ra các điều kiện nuôi cây như độ pH, nhiệt độ, độ thơng khí, thời

gian nuôi cấy, cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC

Vi khuẩn 4 xyiinum phát triển thuận lợi trên mơi trường có pH thấp Do đó mơi trường nuôi cây thu màng BC cần được bô sung thêm axit acetic nhằm

axit hóa mơi trường, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [6], [46]

Nhiệt độ thích hợp để nuôi cây vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng

25C đến 30C Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm Nếu nhiệt

độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của

tễ bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [3], [6], [8], [10]

Vi khuẩn 4 xyiimum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thơng khí

Tùy vào thời gian nuôi cấy để người ta thu được màng với độ dày mong muốn Thường 24 giờ sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bê mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36 — 48 giờ sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và

giải phóng thuốc qua da 1.2.1 Trên thế giới

BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng BC làm vật liệu hấp thu và giải

phóng thuốc qua đa

Trang 21

có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược điểm của thuốc ở dạng

thông thường

Một trong những ứng dụng y sinh học nỗi tiếng nhất của BC là như một màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng Các nghiên cứu của một số tác giả như Fontana và cs (1990) [26]; Czaja và cs (2006) [24], Czaja và cs (2007) [25] đã chỉ ra BC có khả năng băng kín vết thương, duy trì địch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỉ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiêm tra Bên cạnh đó, với vết

thương mất da, nhiễm trùng trên da, BC đáp ứng được nhu cầu giữ am cho da,

tránh da bị khơ (hình 1.7)

2004/ 8/ & 3:24PH

Hình 1.5 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng [25] Đề tăng khả năng giữ âm cho da của BC, một số tác giả nghiên cứu về lidocaine [53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45], benzalconium chloride [19] va sulfadiazine bạc [37] cho thấy việc bố sung glycerol vao mang BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ âm cho bề mặt da Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm 7z vitro cho thầm thâu qua da và so sánh với cách thức thông thường Kết quả cho thấy lidocaine hydrochloride (là chất tan trong nước tương tự như neomycin) giải phóng từ BC qua màng da nhân tạo chậm hơn ibuprofen (một chất ưu lipit) Kết quả này cho thay mang BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức

Trang 22

13

phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế

cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà khơng gây tình trạng qua man [54]

Bên cạnh đó, Luan J và cs (2012) [37] đã nghiên cứu màng BC cho băng vết

thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phô biến được sử dụng trong điều

trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng BC ngâm tâm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động kháng khuẩn đôi với P aeruginosa, E coli va S aureus dat higu qua tốt hơn dạng kem bôi hay dung dịch thông thường

—_— |

a b

Hinh 1.6 Mang BC- lidocaine hydrochloride tng dung trén da [42]

Hình 1.7 Sử dụng màng BC nạp thuốc điều trị nhiễm khuẩn [33] Nghiên cứu của Bhavana V va cs (2016) [19] cho thấy màng khô BC thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng

khuẩn) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được

Trang 23

99,99% hoat tinh khang khuẩn chống lai E coli và S aureus Đồng thời trong

các thí nghiệm trên vết thương hở bị nhiễm khuẩn, BC cũng có vai trị như màng cản khuẩn, giảm sự xâm nhập của vi khuẩn mới, giúp vết thương nhanh hồi phục [19] Các S — enantiomer của propranolol, một loại thuốc chỗng cao huyết áp, có được giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử nghiệm in vivo cho kết quả tốt [15], [22] Một miếng dán có thể giải phóng thuốc enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bề chứa gel và polyme in dau phan tir (MIP) mang Nghiên cứu về gel miếng dán gồm cua chitosan va poloxamer chimg minh rang sau 8 gid, Cmax cua S — propranolol đã đạt được (8,0 + 1,0 microgam/ml) từ bể chita 1,5mg propranolol racemic [39] Almeida I.F va cs (2014) [14] cũng đã nghiên cứu tiềm năng hấp thu và giải phóng thuốc của màng BC qua da thông qua việc

tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ

BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC khơng chỉ có khả năng hấp thu mà còn đề xuất một mơ hình cho giải phóng thuốc qua màng

Các nghiên cứu thành công của các tác giả nêu trên cho thấy màng BC có tiềm năng lớn trong việc làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da hiệu quả

1.2.2 Tụi Việt Nam

Tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [6], [11] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu mang BC ti A xylinum đạt hiệu qua

cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo

trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng đa với 2 loại màng BC gồm cho thêm

Trang 24

15

Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [8], [9] đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm màng BC trị bỏng có tâm dung dịch berberin clorid

0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc

kích ứng da, khơng gây rối loạn toàn thân

Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh BC có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thu và giải phóng một số loại thuốc

qua da Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển

ứng dụng màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc neomycin mục đích giải phóng kéo đài thuốc sử dụng trên da

1.3 Tổng quan về neomycin

Neomycin là loại kháng sinh nhóm aminoglycosid được phát hiện vào năm 1949 từ phịng thí nghiệm của Waksman Neomycin được sản xuất từ môi trường nuôi cây nam Streptomyces fradiae [49]

1.3.1 Công thức

Tên thông thường: NeomycIn

Tén IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) — 5 — amino — 2 — (aminomethyl) — 6 — [(1R,2R,3S,4R,6S) — 4,6 — diamino — 2 — [(2S,3R,4S,5R) — 4—

[(2R,3R,4R,5S,6S) — 3 — amino — 6 — (aminomethyl) — 4,5 — dihydroxyoxan —2 — yl] oxy — 3 — hydroxy — 5 — (hydroxymethyl) oxolan — 2 — yljoxy — 3 —

hydroxycyclohexyl] oxyoxane — 3,4 — diol [17]

Công thức phân tử: C›;:;Ha¿N¿Oa Khối lượng phân tử: 614,65g/mol

Trang 25

1.3.2 Tinh chat li hóa

Ở đạng tỉnh khiết, neomycin có màu trắng hoặc trắng ngà, dé tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [1], [39] Quang phô hấp thu của neomycin ở bước sóng 277nm Định tính neomycin trong các

chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt, ) SỬ dụng

phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [L7] 1.3.3 Dược lí và dược động học

Neomycin có tác dụng với phần lớn các vi khuân Gram âm và Gram

đương gây nên các nhiễm khuẩn ngoài da Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin nhu: S aureus, E coli, H influenzae

Cơ chế hoạt động của neomycin là ức chế sự tổng hop protein cua vi khuẩn: bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm doc sai thong tin cua ARN, lam hình thành các protein khơng có hoạt tính, ngồi ra cịn làm tách các protein ở trạng thái polyme thành monome Kết quả là vi khuân để bị chết do thiếu protein chức năng

Cơ chế này gâm 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Thuộc gắn vào protein là thụ thể chuyên biệt ở trên tiểu

đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn

Giai đoạn 2: Thuộc phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên của quá trình thành lập chuỗi peptit (mARN + formylmethiomine + tARN)

Giai đoạn 3: Thông tin mARN bị đọc sai ở vùng nhận diện của

ribosome, kết quả là một axit amin không phù hợp được đưa vào chuỗi peptide, tạo một protein khơng có chức năng

Trang 26

17

1.3.4 Chi dinh va chéng chi dinh

Neomycin được dùng tại chỗ đề điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và

mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1] Neomycin hầu như không hấp thụ qua đường tiêu hóa (sinh khả dụng đạt 3 — 10% do bị gan phá hủy)

Neomycin không được dùng đường tiêm hoặc tồn thân vì độc tính của thuốc

Neomycin cũng được khuyến cáo tránh dùng tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây mãn cảm trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [17]

Tuy nhiên neomycin ở dạng chế phẩm dung dịch có bán trên thị trường thì khả năng hấp thụ vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ

85,01%) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn cảm

khi điều trị lâu dài Điều này khơng thích hợp với việc điều trị một số bệnh

viêm đa mủ trên đa [1], [17] Bên cạnh đó, chế phẩm dạng dung dịch thường nhanh khô và khơng có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài xâm nhập vào vết

thương Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vẫn đề này là dùng một loại vật liệu

có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ âm vết thương và cản

khuẩn Chúng tôi chọn màng BC hấp thu neomycin để thực hiện khắc phục

các vấn đề trên

1.4 Tình hình nghiên cứu về neomycin

1.4.1 Trên thế giới

Năm 1949 Selman A., Waksman phát hiện neomycin được sản xuất từ môi trường nuôi cây nắm Streptomyces fradiae [48] Các nhà khoa học trên đã tìm ra q trình sinh tơng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của neomycin Pedersoli W M và cs (1994) [43] nghiên cứu về sự hấp thụ của neomycin trén bé con Hà Lan qua đường tiêm Kết quả cho thây neomycin

Trang 27

Tiếp đó, năm 2015 Jong S C và cs [30] đã tiến hành nghiên cứu neomycin sulfate nạp hydrogel với khả năng cản khuẩn và giải phóng thuốc trong việc điều trị vết thương mô ở chuột nhắt mắc bệnh tiểu đường Kết quả cho thấy khả năng chữa lành vết thương của neomycin sulfate bọc hydrogel cải thiện hơn so với hiệu quả sản phẩm thương mại Tuy nhiên chỉ phí sản xuất để đưa sản phẩm này ra thị trường khá cao

Ngồi ra nhóm nghiên cứu của Blanchard C (2015) [20] cũng chỉ ra rằng neomycin sulfate cải thiện hoạt động kháng khuẩn của neomycin don thuần, do neomycin sulfate 6 dang muéi ít gây dị ứng với cơ thể hơn Alguacil J và cs (2015) [13] cũng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các dạng thế hệ của neomycin Amita H va cs (2015) [13] nghiên cứu và tìm ra công thức chế tạo gel chứa neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt Điều đó giúp tăng cường sinh khả dạng tại chỗ cũng như hiệu quả giải phóng kéo đài tại chỗ của neomycin trong mắt

1.4.2 Tại Việt Nam

Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4 năm 1999 [1] Neomycin được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một số hoạt chất khác Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng BC đề vận tải và phân phối thuốc neomycin thì chưa có cơng trình nào nghiên cứu

1.5 Sinh lý hấp thu các chất qua da

1.5.1 Cầu trúc và chức năng sinh lý của da

Da là hàng rào ngăn cách giữa môi trường bên trong cơ thể và môi trường ngồi Da có diện tích khoảng 2m”, cân nặng bằng 1/6 trọng lượng cơ thé (tinh trung bình ở người trưởng thành) Da hoạt động như một rào cản đầu

Trang 28

19

ngoài khắc nghiệt và ngăn ngừa sự mất mát các thành phần cơ thể quan trọng,

đặc biệt là nước

Cấu trúc da gồm 3 lớp chính: biểu bì, hạ bì và mơ dưới da, mỗi lớp lại bao gồm nhiều lớp thay thế (hình 1.9) Các phần phụ của da như các nang và các tuyến mô hôi, tuyến bã nhờn cũng đóng những vai trò khác nhau trong chức năng tổng thể của da [21]

Thân lông Các mao mạch

Tế bào hắc tố Thuthe Thu thé nhận cảm nhận cảm Nang lũng Tuyến nhờn Hạ bì Cơ dựng lơng

Tuyến mồ hôi Chân lông

Dây thần kinh

Động mạch

Tinh mach

Thu thé

nhan cam

Hình 1.9 Câu trúc siêu hiến vỉ của da Biểu bì:

Biểu bì là lớp ngoài cùng của đa, có độ dày khoảng 0,1mm, vùng biểu bì xung quanh mắt mỏng hơn (0,05mm) và đưới bàn chân thì dày hơn (1 — 3mm) Da ở các phần khác nhau của cơ thể và da của nam và nữ thì khác

Trang 29

lớp sửng (tế bào tróc vây}

lớp té bao hat

lớp tế bào gai

lớp té bao day

Hình 1.10 Câu tạo của biếu bì da người

Biểu bì có vai trị bảo vệ cơ thể tránh khỏi các độc tố, vi khuẩn là tránh

mất các chất lỏng cân thiết Biểu bì bao gồm 4 — 5 lớp tế bào (hình 1.10) Các tế bào được sản sinh ở lớp trong cùng (lớp tế bào đáy), đi chuyển đến bề mặt đa Từ đó, chúng phát triển và trải qua nhiều sự thay đổi Đây chính là q trình được biết như là quá trình sừng hóa (hay sự hình thành sừng ở biểu bì),

khiến mỗi lớp của tầng biểu bì trở nên khác biệt

Lớp tế bào đáy là lớp trong cùng của biểu bì, nơi các tế bào keratin được sản sinh Lớp tế bào này nằm sát hạ bì Tiếp đến là lớp tế bào gai Các tế bào keratin sản sinh chất sừng (các sợi protein), chúng gắn chặt với nhau trông như những cái gai nhô lên bề mặt Lớp tế bào hạt nằm trên lớp tế bào gai Ở đây các tế bào bắt đầu q trình sừng hóa: các tế bào sản sinh ra các hạt nhỏ và các hạt này di chuyển lên trên, biến đổi thành chất sừng và các lipit

biểu bì Ở bàn tay, chân có thêm lớp tế bào trong suốt, lớp tế bào này khá

mỏng nằm dưới lớp sừng Lớp sừng là lớp ngồi cùng của biểu bì gồm các tế bào chết đã được đát mỏng Độ dày của lớp sừng phụ thuộc vào vùng đa của cơ thể Những tế bào chết này bong ra thường xuyên trong q trình tróc vảy

Trang 30

21

rất quan trọng để tạo nên một làn da khỏe mạnh: chúng tạo nên hàng rào bảo vệ và giữ được độ âm cho da Khi các lipit bị mất đi, da trở nên khô hơn và cảm giác bị căng và sẵn sùi

Biểu bì được bao phủ bởi chất nhũ tương gồm nước và lipit (chất béo) được biết như các màng hydrolipit Lớp màng này giúp duy trì sự tiết mồ hơi và bã nhờn, giúp làn đa được mềm hơn và hoạt động giống như hàng rào

chống lại vi khuẩn và nắm Phần nước của màng này, như là các axit bảo vệ

bao gồm: axit lactic, một số các amino axit từ mô hôi, các axit tự do từ dầu, các amino axit, axit cacboxilic và các nhân tô tạo độ ẩm tự nhiên khác Các axit bảo vệ giúp da khỏe mạnh là các loại axit nhẹ và có độ pH nằm trong

khoảng từ 5,4 đến 5,9 Đây là môi trường lý tưởng cho các vi sinh vật có ích cho đa có thể phát triên mạnh và các vi sinh vật có hại sẽ bị tiêu diệt, bên cạnh

đó giúp cho sự hình thành các lipit biểu bì tốt hơn, đồng thời lớp sừng dễ

dàng tự phục hồi khi nó bị tơn thương Ha bi:

Lớp hạ bì năm bên dưới lớp biểu bì bao gồm 2 lớp Phần câu trúc chính

của lớp hạ bì là sợi collagen, sợi đàn hồi và các mô liên kết Các cấu trúc này

thì gắn chặt với một chất như gel (có chứa axit hyaluronic), có khả năng cao trong việc liên kết với phân tử nước giúp duy trì được thể tích của da

Lớp hạ bì đóng vai trị quan trọng trong việc bảo vệ cơ thê khỏi ảnh

hưởng của các nhân tơ bên ngồi cũng như ni đưỡng lớp ngồi cùng Lớp hạ bì đày, có cầu trúc giúp làm nhẹ đi các tác động từ bên ngoài và khi tốn thương xảy ra, chúng có chứa các mô liên kết giúp làm lành vết thương như

nguyên bảo sợi và dưỡng bào Lớp này có chứa nhiều mao mạch máu giúp

Trang 31

Mô dưới da:

Lớp da ở phía trong cùng là nơi tạo ra năng lượng của cơ thể, đồng thời hoạt động như một tắm đệm và cách nhiệt cho cơ thể Chúng bao gồm các tế

bào mỡ, các sợi collagen đặc biệt và mạch máu

Số lượng các tế bào chất béo ở mơ dưới da thì khác nhau ở các vùng trên cơ thể Hơn nữa, sự tạo thành các tế bào này cũng khác nhau giữa nam

và nữ, cũng như cấu trúc của các bộ phận khác của da

Chức năng của đa:

Một làn da khỏe hoạt động như một rào cản giữa môi trường bên ngoài

và bên trong cơ thể, và là hàng rào miễn dịch không đặc hiệu bảo vệ cơ thê

đầu tiên Da có vai trị ngăn cản vi khuẩn, vi rút và các chất lạ từ mơi trường ngồi cơ thể (trong trường hợp da không bị tốn thương); hấp thụ một số chất, điều tiết mồ hôi, thân nhiệt và ngăn cản tác động của tia bức xạ với cơ thé

Vùng da bi tôn thương dễ bị vi khuẩn, vi rút xâm nhập làm tăng tổn

thương da Vì vậy, vẫn đề đặt ra với việc điều trị các vết thương nhiễm khuẩn

trên đa là làm sao tạo được màng chắn vừa mang thuốc giải phóng kéo dài vừa có khả năng ngăn vi khuẩn và các chất lạ xâm nhập từ môi trường

1.5.2 Cơ chế hấp thu các chất qua da

Da có khả năng hấp thu một số chất Tuy nhiên trong phạm vi đề tài

luận văn, chúng tôi đề cập ở đây một số chất hấp thu vào da là thuốc

Hấp thu là sự vận chuyển thuốc từ nơi dùng thuốc (uống, tiêm, đắp trên đa) vào máu để rồi đi khắp cơ thể, tới nơi tác dụng Như vậy sự hấp thu sẽ phụ thuộc vào:

- Độ hòa tan của thuốc (thuốc dùng dưới dạng dung dịch nước dé hap

thu hơn dạng dầu, dịch treo hoặc dạng cứng)

Trang 32

23

- Nông độ của thuốc (nồng độ càng cao càng hấp thu nhanh)

- Tuần hoàn tại vùng hấp thu (càng nhiều mạch, càng hấp thu nhanh) - Diện tích vùng hấp thu

Từ những yếu tố đó cho thấy đường đưa thuốc vào cơ thể sẽ có ảnh hưởng lớn đến sự hấp thu

Hấp thu thuốc qua đa có lợi hơn con đường hấp thu thuốc qua đường uống do không bị gan và các dịch tiêu hóa phá hủy Mặt khác việc tác dụng của thuốc qua đa được coi là một trong những con đường hiệu quả nhằm chữa

một số bệnh đặc trưng mà các con đường khác có nhiều khó khăn, đặc biệt là

với những người bệnh có yếu tô tâm lý nhạy cảm với việc dùng thuốc qua

đường uỗng hoặc sợ đau qua đường tiêm hay truyền dịch

Trên thực tế có rất ít thuốc hấp thu qua da lành tính Do da lành tính có

lớp sừng bảo vệ tránh sự xâm nhập của các vi sinh vật và chất lạ vào cơ thể

nếu chưa được sự cho phép Lớp sừng khá dày chứa các lipit (giống như lớp

sắp) ngăn cản sự thắm của các chất lỏng trên bề mặt da Vì vậy, các nhà khoa

học chế tạo một số loại thuốc dán, thuốc bôi trên đa thường cho thêm chất

tăng thấm giúp cho việc thâm thấu một số hoạt chất khác vào da đạt hiệu quả

hơn [2]

Tuy nhiên, khi da bị tôn thương trong một số trường hợp như viêm nhiễm, bỏng, làm mắt đi lớp biểu bì của da, hoặc trường hợp sâu hơn có thể mất đi cả lớp hạ bì của đa thì việc một số thuốc có thể thấm vào da dễ đàng hơn

Một số hoạt chất/ thuốc có thể thấm vào các lớp tế bào của da thuộc

phân hạ bì hay phần mơ mỡ dưới da theo 2 cơ chế chính:

Cơ chế vận chuyển thụ động: thuốc đi vào tế bào, mô theo cơ chế

Trang 33

(bén trong tế bào) cho tới khi đạt một nồng độ nhất định Các thuốc này

thường đi qua lớp photpholipit trên màng tế bào Các loại thuốc có thê đi theo

con đường trên thường có bản chất là khơng phân cực, kích thước nhỏ

Cơ chế vận chuyển chủ động: Các hóa chất đi vào tế bào (có thể đi từ nơi có nồng độ thấp đến nơi có nồng độ cao) theo nhu cầu của tế bào Các loại thuốc này thường đi qua kênh protein trên màng tế bào Các kênh protein này

có tính chọn lọc — có nghĩa là màng tế bào chỉ cho một số chất nhất định đi

Trang 34

25

CHUONG 2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Neomycin (98%) và glycerol (99,5%) được mua từ Trung Quốc - Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất băng cách sử dụng vi khuẩn 4 xyiimum (Phịng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh — KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên men trong môi trường dinh dưỡng

- Máy đo quang phố UV - 2450 (Shimadzu — Nhật Bản); Cân phân tích

(Sartorius — Thụy sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Kính hiển vi

điện tử quét; Buồng cấy vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);

Máy ép màng: Khuấy từ gia nhiệt (IKA — Đức) kính hiến vi quang học (Carl

Zeiss — Đức); Kính lúp soi nỗi STEMI 2000 — C; Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); Tu lanh Daewoo, tu lạnh sâu và nhiéu dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC: Đường

glucose, cao nắm men, nước dừa, nước vo gao, axit acetic, axit citric,

peptone, diamoni photphat, HCl, NaOH, dat tigu chuan phn tích 2.2 Phuong phap nghién ciru

2.2.1 Chuẩn bị màng BC

2.2.1.1 Lên men thu màng BC thơ

Q trình lên men thu màng BC thô được thực hiện theo các bước sau [6]:

-_ Bước 1: Chuẩn bị môi truong theo bang 2.1 [5]

-_ Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 113C trong 15 phút - Bước 3: Lẫy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15

phút rồi để nguội môi trường

- Bước 4: Bồ sung 10% dịch giỗng và 2% axit acetic, lắc đều tay cho

Trang 35

- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tính trong khoảng 6 — 8 ngày ở 26°C

-_ Bước 6: Thu màng BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước

Bang 2.1 Thành phần của các môi trường lên men tạo màng BC

Môi trường Thành phần MTI MT2 MT3 Glucose 20g 30g 30g Pepton Sg 10g 10g Diamoni photphat 2,/¢g 0,32 0,3g Amoni sulfat 0,52 0,5¢

Cao nam men 38

Acid citric 15g

Nước cất 2 lần 1000ml

Nước dừa già 1000ml

Nước vo gạo 1000ml

Theo một số kết quả nghiên cứu của một số tác giả [3], [6], [9], [19], [24], [54] thì màng BC có độ dày từ 0,3 — 0,5cm phù hợp làm hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng qua da Vì vậy để thu màng BC

có độ dày 0,3 — 0,5cm, chúng tôi tiễn hành thu màng từ địch nuôi cấy tĩnh 4

xylinum sau 6 — 8 ngày

2.2.1.2 Tao mang BC tinh ché

Trang 36

27

Tach mang BC thô

Ép loại nước

Ngâm trong NaOH 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong HCI 3%

| 48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong nước

| 48 giờ, kiểm tra tạp chất

Thu BC tinh chế Hình 2.1 Quy trình tỉnh chế màng BC 2.2.1.3 Kiểm tra độ tỉnh khiết màng BC tinh chế

Kiểm tra độ tinh khiết của màng nhằm đảm bảo màng BC sau khi xử lí

đã được loại các tạp chất Các tạp chất được khảo sát là glucose, protein cua

vi khuẩn và dư lượng pepton trong môi trường ni cấy

Tìm sự hiện điện của giucose trong màng BC sau khi tinh chế

Định tính glucose trong màng BC bằng thuốc thử Fehling Màng BC

tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ

Dùng thuốc thử Fehling mới pha đề phát hiện glucose trong dịch chiết màng

Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng đương là dung dich D — glucose

Trang 37

Tìm sự hiện điện của protein trong màng BC tỉnh chế

Định tính protein cịn lại trong màng bằng phản ứng tạo tủa của protein

voi acid triclor acetic Mang BC tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước

cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng dung địch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để

nuôi cấy vi khuẩn) và màng BC thô Phản ứng dương tính khi cho tủa đục So

sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [6] Xác định pH của màng BC tỉnh chế

Sau khi tinh chế pH của màng phải năm trong khoảng pH trung tính Đo pH dịch chiết mang bang may do pH Cân và cho mang BC vào 1 bình nón chứa nước khử khoáng theo tỉ lệ màng và nước là 1:100 (khối lượng/thê tích) Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Lẫy dịch chiết và đo pH dung dịch ở mỗi bình bằng pH kế, chỉnh pH điện cực ở 2 khoảng pH là pH = 4 và pH= 7 [6]

2.2.1.4 Xác định các tiêu chuẩn của màng BC tỉnh chế sử dụng chế tạo màng hấp thu thuốc

Mang BC tinh ché dùng dé tao mang nap thuốc neomycIn phải đạt được

những tính chất sau:

- Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính

che phủ tốt do có khả năng cản khuẩn

- Độ âm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô

Đề đạt các tiêu chuẩn này cần khảo sát:

- Độ dày thích hợp của lớp màng BC thô: chúng tôi chọn màng BC có độ dày 0,3cm và 0,5cm dé tiến hành thực nghiệm

- Khả năng cản vi khuẩn của màng BC tỉnh chế

Trang 38

29

Tất cả các thông số này sẽ được khảo sát đồng thời để xác định thông số thích hợp nhất, [6], [9]

Khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC tỉnh chế

Khảo sát khả năng cản khuẩn của màng BC và so sánh với vải gạc vô trùng Sử dụng các bản thạch dinh dưỡng là môi trường thuận lợi cho các vi khuẩn và nắm mốc phát triển Chia các hộp petri chứa môi trường thạch đinh

dưỡng tiêu chuẩn (môi trường Soybean — casein) thành 3 lô Chọn màng BC

tinh chế ngẫu nhiên từ các lơ thí nghiệm khác nhau Dùng các loại màng thử nghiệm che phủ bề mặt các bản thạch:

Lô 1: Sử dụng gạc vô trùng Lô 2: Sử dụng màng BC

Lô 3: Lô đối chứng, khơng phủ màng

Sau đó, các bản thạch đã phủ màng này được dùng thử nghiệm trong 2 điều kiện [6], [9]:

Thử nghiệm I: Sử dụng Iml dung dịch huyền phù các vi khuẩn S

hemolyticus, E coli trải lên bề mặt của mỗi loại màng ở các lô trên và giữ trong tủ âm 37C trong 24 giờ Sau đó màng được lẫy ra và quan sát lượng vi khuẩn mọc bên đưới màng

Thử nghiệm 2: Đề hở các hộp thạch có phủ màng ngồi khơng khí trong 24 giờ, nơi có nhiều người qua lại, sau đó một nửa số hộp được đưa vào tủ âm 37°C ủ trong 48 giờ Quan sát kết quả bằng cách lật màng và quan sát sự

phát triển của vi khuẩn trên bản thạch Một nửa số bản thạch còn lại để ở

nhiệt độ phòng trong 7 ngày để quan sát khả năng phát triển của nằm mốc Khả năng cho thoát hơi nước của màng BC tỉnh chế (tính thơng thoảng của màng BC)

Điều kiện thử nghiệm: đề các mang thử nghiệm lên bề mặt bản thạch bán

Trang 39

mỗi màng đặt trong một hộp), cân hộp và đặt hộp ở nhiệt độ 37°C Sau những

khoảng thời gian cân lại hộp đã đặt màng đề tính lượng nước đã mất theo thời gian Thử nghiệm trên 3 màng mỗi lô

Khả năng cho thoát hơi nước của màng được đánh giá bằng số mg nước trong lcm’ mang mat đi theo thời gian [6], [9]

2.2.2 Chế tạo màng BC hấp thu neomycin

2.2.2.1 Chuẩn bị bộ đệm

Môi trường đệm Photphat buffered saline (PBS) [7] được chuẩn bị với

các thành phân và cách pha được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS với pH = 7,4

Hóa chất Cách pha

Thanh phan Khối lượng

Cho hóa chất vào cốc đong

NaCl 0,8 Thêm đên mức 800ml băng nước cat nak , è A

KCl 0,2g Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCI

Na;HPO,.12H2O 1,44g Bô sung nước tới 1000ml Khử trùng

Na;HPO¿ 0,22g

2.2.2.2 Xây dựng đường chuẩn neomycin

Sử dụng hệ thống quang phố tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc neomycin

Trang 40

3l

2.2.2.3 Chuẩn bị môi trường cho BC hấp thu thuốc

Một số cơng trình nghiên cứu cho thấy glycerol được khuyến cáo sử dụng ở nồng độ tôi đa là 1% trên da [14], [50], [54] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về neomycin chỉ ra rằng nồng độ neomycin thích hợp sử đụng cho da không quá 5mg/ml [1], [17], do ở nồng độ này thuốc không gây tình trạng quá mẫn cho da mà cịn có khả năng ức chế các vi khuẩn thử nghiệm Gram âm và Gram dương Để tìm ra công thức phối hợp thuốc neomycin với glycerol đưa vào màng phù hợp nhất, chúng tôi tiến hành pha các môi trường thử nghiệm thuốc như sau:

Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm cho màng BC hấp thu thuốc

Tên môi trường Thành phân thuốc/ tá dược

hấp thu thuốc Nong d6 neomycin (mg/ml) | Nong d6 glycerol (%)

XI X2 2,0 2,0 0,5 0 X3 2,0 1,0

Mang BC wot sau khi tinh chế được loại bỏ 50% bởi áp lực, ngâm ngập

tràn trong 100ml dung dịch đệm PBS (pH = 7,4) chứa thuốc neomycin và tá dược theo các môi trường đã bố trí tại bảng 2.3 và rung động ở 100 vòng và

30°C trong 4 gid, dam bảo cho màng hấp thụ tôi đa [45], [53], [54] Sau đó lấy màng BC đã hấp thu thuốc ra (gọi tắt là màng BC — XI, BC _- X2, BC —

X3) cho vào bao nilon, hấp tiệt trùng ở 120C trong 20 phút, hàn bao bì và đặt trong ngăn mát tủ lạnh

2.2.2.4 Xác định lượng neomycin hấp thu vào màng BC