QUI TRÌNH NUÔI CẤY PHÔI SOMA CÂY CÀ PHÊ VỐI PHỤ LỤC 3 QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY HỒ TIÊU BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Phần 1 NHỮNG QUI ĐỊNH CHUNG 1 Phạm vi và đối tượng áp dụng Quy trình này[.]
PHỤ LỤC QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY HỒ TIÊU BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Phần NHỮNG QUI ĐỊNH CHUNG Phạm vi đối tượng áp dụng - Quy trình hướng dẫn bước thực để nhân giống hồ tiêu Vĩnh Linh kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trưởng - Quy trình áp dụng cho sở nuôi cấy mô đủ điều kiện thực Xuất xứ quy trình Quy trình kết nghiên cứu đề tài “Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất giống hồ tiêu (Piper nigrum L) bệnh” thuộc đề tài cấp tỉnh Đắk Nông thực năm 2017 - 2020 Mục tiêu yêu cầu kỹ thuật Mục tiêu: Tạo giống hồ tiêu Vĩnh Linh bệnh cung cấp cho sản xuất Yêu cầu kỹ thuật: Tạo giống hồ tiêu Vĩnh Linh kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trưởng có đặc điểm: đồng kiểu hình, bệnh vườn ươm Thuật ngữ chữ viết tắt Nuôi cấy mơ thực vật: Là q trình trì ni dưỡng tế bào, mơ, quan, hay hồn chỉnh thực vật điều kiện in vitro Đỉnh sinh trưởng: Là đỉnh tròn gồm tế bào phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1 - 0,2 mm dài khoảng 0,25 mm, nằm Cây giống bệnh: Cây sinh trưởng phát triển tốt, không bị nhiễm virus nấm bệnh MS : Murashige & Skoog, 1962 BA : 6-benzyladenin IAA: Indolle-3acetic acid IBA: Indolle-3butyric acid HgCl2 : Clorua thủy ngân Phần QUI ĐỊNH VỀ KỸ THUẬT 2.1 Yêu cầu sở vật chất nguồn nhân lực 2.1.1 Yêu cầu sở vật chất Cơ sở nuôi cấy mô hồ tiêu cần đảm bảo yêu cầu sở vật chất sau: - Có nguồn giống mẹ giống không bị bệnh, nhân phương pháp giâm hom (hom lươn hom thân) - Có hệ thống phịng chuẩn bị mơi trường, phịng cấy mẫu phịng ni - Có đủ diện tích nhà xưởng để sản xuất để trang thiết bị, hóa chất - Có đủ trang thiết bị như: Tủ cấy, nồi hấp, máy cất nước, máy đo pH, máy khuấy từ - Có nhà kính, vườn ươm đủ tiêu chuẩn đủ diện tích theo suất nuôi cấy 2.1.2 Yêu cầu nguồn nhân lực Nguồn nhân lực để thực trực tiếp quy trình phải có trình độ từ trung cấp trở lên, đào tạo tập huấn chuyên sâu công nghệ sinh học, công nghệ nhân giống hồ tiêu kỹ thuật ni cấy mơ tế bào 2.2 Sơ đồ quy trình nhân giống hồ tiêu công nghệ nuôi cấy mô tế bào tháng tháng Chuẩn bị vật liệu Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo chồi Tạo mẫu Xuất vườn tháng tháng Tạo hoàn chỉnh vườn ươm Tái sinh tháng Nhân chồi tháng 2.3 Các quy định công nghệ 2.3.1 Vật liệu khởi đầu + Cây mẹ: Là hồ tiêu giống Vĩnh Linh, thu thập chọn lọc vườn hồ tiêu trồng thuần, - năm tuổi, suất cao, chất lượng tốt Cây mẹ nhân giống phương pháp giâm hom, trồng vùng cách ly nguồn sâu, bệnh (được trồng nhà kính nhà lưới) + Chồi ngọn: Chồi khỏe, khơng bị sâu bệnh, đường kính khoảng 2,5 - mm 2.3.2 Các bước thực quy trình * Bước 1: Chuẩn bị nguồn vật liệu + Chuẩn bị - Cây lấy mẫu chồi: Là mẹ đủ tiêu chuẩn [theo mục 2.3.1] - Thuốc phòng nấm bệnh: Benomyl nồng độ 0,1% - Dụng cụ: Đồ bảo hộ lao động, bình phun sương, dụng cụ đong thuốc + Phương pháp thực - Sử dụng bình phun sương, phun ướt dung dịch thuốc Benomyl nồng độ 0,1% toàn mẹ; liều dùng định kỳ tháng/lần - Bón phân: Hịa kg Ure + Acid Humic (pha theo khuyến cáo) 250 lít nước, khuấy cho tan hết, tưới định kỳ 14 ngày/lần; liều lượng tưới 2,5 lít/m2/lần Khi đạt tiêu chuẩn lấy mẫu (cây có chiều cao ≥ 60 cm, chồi có đường kính khoảng 2,5 - mm), dừng bón phân trước lấy mẫu tuần * Bước 2: Tạo mẫu phòng + Chuẩn bị - Mẫu: Chồi lấy từ hồ tiêu khỏe, không bị sâu bệnh, đường kính khoảng 2,5 - mm [mục 2.3.1] - Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường tạo mẫu gồm: agar (10 g/l), đường saccharose (30 g/l), đa vi lượng vitamin môi trường MS (1962) Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy MS Đa lượng MS (1962) Vi lượng MS (1962) NH4NO3 1,650 g/l MnSO4.4H2O 22,300 mg/l Vitamin MS (1962) Glycin mg/l KNO3 1,900 g/l ZnSO4.7H2O 8,600 mg/l Thiamin HCl CaCl2.2H2O 0,440 g/l H3BO3 6,200 mg/l Pyridoxine HCl 0,5 mg/l MgSO4 4H2O 0,370 g/l KI 0,830 mg/l Nicotinicacid 0,5 mg/l KH2PO4 Na2MoO4.2H2O 0,350 mg/l myo-Inositol 100 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CaCl2.6H2O 0,025 mg/l FeNaEDTA 36,700 mg/l 0,170 g/l 0,1 mg/l - Chất khử trùng: Nano bạc 1.000 ppm, nồng độ 0,3% Clorua thủy ngân, nồng độ 0,2% - Dụng cụ: Hộp đựng mẫu chồi, dao mổ, kéo, bút ghi, xà phịng, bơng thấm nước, tủ cấy + Các bước thực - Rửa chồi bụi bẩn, rửa dung dịch xà phòng 1%, rửa lại nhiều lần vòi nước - Cắt loại bỏ cuống lá, để nước - Ngâm mẫu chồi vào dung dịch thuốc nấm Fosetyl Aluminium 0,04% (Aliette 800WG) 30 phút, rửa sạch, để nước Các bước thực tủ cấy vô trùng: - Ngâm mẫu dung dịch cồn 70% 30 giây, rửa lại mẫu nước cất vô trùng (3 lần) - Ngâm mẫu chồi vào dung dịch chất khử trùng Nano bạc 0,3% 30 phút, rửa lại mẫu chồi nước cất vô trùng (3 - lần) - Ngâm mẫu chồi vào dung dịch chất khử trùng Clorua thủy ngân 0,2% 10 phút, rửa lại mẫu chồi nước cất vô trùng (3 - lần) - Dùng mũi dao mổ tách bỏ phần bên ngồi, thấy đỉnh sinh trưởng (kích thước khoảng 0,1 - 0,2 mm) - Cắt đỉnh sinh trưởng cấy lên môi trường tạo mẫu bình tam giác chuẩn bị sẵn - Đặt bình ni cấy chứa đỉnh sinh trưởng phịng ni cây, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux/m2/s, nhiệt độ 25 ± 2oC - Thời gian tạo mẫu sạch: tháng - Tiêu chuẩn đỉnh sinh trưởng sạch: Đỉnh sinh trưởng không bị nhiễm nấm, nhiễm khuẩn, mẫu sống * Bước 3: Tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng + Chuẩn bị - Mẫu: Là đỉnh sinh trưởng [bước 2] - Môi trường tạo chồi : Môi trường MS (1962) đầy đủ khoáng đa vi lượng vitamin, chất kích thích sinh trưởng BA mg/l IBA 0,2 mg/l, đường saccharose 30 g/l, agar 10 g/l - Môi trường điều chỉnh pH 5,8 - Dụng cụ, thiết bị: Bộ dụng cụ cấy (kẹp, kéo ), đèn cồn, tủ cấy + Các bước thực - Cấy chuyển mẫu sang môi trường tạo chồi - Mẫu cấy chuyển tháng lần cách cấy chuyển mẫu đỉnh sinh trưởng sang mơi trường có thành phần giống mơi trường tạo chồi ban đầu - Đặt bình ni cấy chứa mẫu vật ni cấy phịng ni cây, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux/m2/s, nhiệt độ 25 ± 2oC - Thời gian mẫu tạo chồi: tháng - Tiêu chuẩn chồi hình thành sau tháng: Chồi khỏe, có xanh, có chiều dài - cm * Bước 4: Nhân chồi + Chuẩn bị - Chồi: Là chồi in vitro khỏe, có xanh [bước 3] - Môi trường nhân chồi: Môi trường MS (1962) đầy đủ khoáng đa vi lượng vitamin, chất kích thích sinh trưởng BA 0,5 mg/l nước dừa non 150 ml/l, đường saccharose 30 g/l, agar 10 g/l - Môi trường điều chỉnh pH 5,8 - Dụng cụ, thiết bị: Bộ dụng cụ cấy (kẹp, kéo ), đèn cồn, tủ cấy + Các bước thực hiện: - Cắt chồi [bước 3] thành đoạn, đoạn gồm - đốt, tương đương cấy vào môi trường nhân chồi chuẩn bị sẳn - Đặt bình ni cấy chứa mẫu vật ni cấy phịng ni cây, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux/m2/s, nhiệt độ 25 ± 2oC - Thời gian nhân chồi: tháng - Tiêu chuẩn cụm chồi hình thành sau tháng: Chồi khỏe, xanh, có - chồi/ cụm * Bước 5: Tái sinh + Chuẩn bị - Chồi: Là chồi khỏe, có xanh, có ≥ đốt [bước 4] - Môi trường tái sinh cây: Môi trường MS (1962) đầy đủ khống đa vi lượng vitamin, chất kích thích sinh trưởng IAA 0,4 mg/l than hoạt tính g/l , đường saccharose 15 g/l, agar 10 g/l - Môi trường điều chỉnh pH 5,8 - Dụng cụ, thiết bị: Bộ dụng cụ cấy (kẹp, kéo ), đèn cồn, tủ cấy + Các bước thực - Cắt chồi [bước 4] có chiều cao từ - cm, có - lá, tương đương - đốt cấy vào môi trường tái sinh (môi trường tạo rễ) bình tam giác chuẩn bị sẵn - Đặt bình ni cấy chứa mẫu vật ni cấy phịng ni cây, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux/m2/s, nhiệt độ 25 ± 2oC - Thời gian tái sinh cây: tháng - Tiêu chuẩn hình thành sau tháng: Cây khỏe, xanh, rễ phát triển, chiều cao ≥ cm, có thật * Chú ý: Trong thời gian ni cấy phịng, cần thường xun kiểm tra bình ni cấy để loại bỏ bình bị tạp nhiễm, bình chết * Bước 6: Tạo hoàn chỉnh vườn ươm + Chuẩn bị - Tiêu chuẩn tiêu nuôi cấy mô trước trồng vào bầu đất: Chiều cao ≥ - 5,5 cm, có - thật, có rễ - Tiêu chuẩn giá thể ươm: Đất mặt (80%), chất độn (20%) gồm phân chuồng, phân lân, xơ dừa, trấu hun, phân vi sinh Đất làm giá thể cần xử lý nhiệt chế phẩm sinh học/hóa học để diệt mầm bệnh trước phối trộn, đóng bầu Tỷ lệ phối trộn giá thể bầu ươm: đất: phần bò hoai mục: xơ dừa: trấu hun (5:2:2:1) - Tiêu chuẩn bầu ươm: Sử dụng túi PE, có - 10 lỗ nước, kích thước 12 -13 cm x 21 - 22 cm + Các bước thực - Cây tiêu nuôi cấy mơ có rễ, có - thật lấy từ bình ni qua huấn luyện nhà lưới 14 ngày, khối lượng tươi 0,7 - 1,2g/cây; rửa agar, đem cấy vào giá thể đất: xơ dừa: trấu hun (1:1:1) để huấn luyện giúp thích nghi với mơi trường bên ngồi Thời gian huấn luyện tuần Sau đó, lấy khỏi giá thể, thao tác nhẹ nhàng, không làm gãy rễ cấy vào bầu đất - Chăm sóc cây: + Phun phân bón Nupe 0,2% định kỳ tuần/lần, liều lượng lít/m2/lần + Phun phân N-P-K (16-16-8) 0,2% định kỳ tháng lần, liều lượng lít/m2/lần + Tưới nước: Cây vườn ươm phải tưới nước đầy đủ theo nguyên tắc: Cây nhỏ tưới lượng nước nhiều lần, lớn tưới lượng nước nhiều lần Việc định lượng chu kỳ tưới nước cịn tùy thuộc vào tình hình thời tiết, độ ẩm đất bầu Bảng Chu kỳ lượng nước tưới theo giai đoạn sinh trưởng Sau Tháng thứ Tháng thứ Tháng thứ - Tháng thứ - Giai đoạn sinh trưởng Cây ổn định, bắt đầu nhú cặp Cây có từ - Cây có từ - Cây có từ - Chu kỳ (ngày) 2-3 Lượng nước (lít/m2) 3-4 3-4 4-5 10 - 12 18 - 20 + Phòng bệnh cho tiêu: Phun thuốc nấm Fosetyl Aluminium 0,04% (Aliette 800WG) định kỳ tháng/ lần - Thời gian tạo hoàn chỉnh vừn ươm: - tháng - Tiêu chuẩn hồn chỉnh: Chiều cao ≥ 20 cm, có - thật, sinh trưởng bình thường, bệnh