Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 62.42.01.20 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp HCM, năm 2017 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Bảo Tàng Sinh Học Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Bùi Văn Lai PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn PGS.TS Bùi Văn Lai Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm khu vực Đông Nam Á, nơi có mức độ đa dạng sinh học heo rừng cao giới Hai loài heo rừng xác định tồn Việt Nam Sus bucculentus Sus scrofa Tuy nhiên, loài Sus bucculentus tuyệt chủng, cịn lồi heo rừng Sus scrofa nuôi phổ biến Việt Nam, đặc biệt khu vực Tây Nguyên Đến nay, nghiên cứu quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên hạn chế, đặc biệt đặc điểm hình thái di truyền Một lý việc thu nhận hóa heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun cịn gặp nhiều khó khăn Ở khu vực Tây Nguyên, giống heo rừng mà người dân địa phương nuôi hầu hết heo lai nhập từ nước Thái Lan, Malaysia… Các dịng heo lai có đặc điểm di truyền không đồng nhất, không chủng Việc phát triển chăn nuôi tự phát giống heo rừng lai làm tăng khả xâm lấn heo rừng lai (sinh vật ngoại lai), làm tăng nguy đe dọa tới quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Do đó, nghiên cứu việc thu nhận, hóa nhân rộng quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun có vai trị quan trọng việc bảo tồn loài heo rừng đặc chủng Việt Nam Việc bảo tồn dựa phân biệt nét đặc trưng heo rừng Việt Nam mặt kiểu hình kiểu gen Việc phân biệt loài heo rừng dựa trình tự đặc trưng vùng bảo tồn ADN nhân ADN ty thể Các loài heo rừng khác có vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo nên haplotype đặc trưng cho lồi heo Trên sở xây dựng phát sinh lồi, từ biết nguồn gốc khác biệt heo rừng Việt Nam với giống heo rừng nhập nội Xuất phát từ tình hình trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài: " “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học di truyền heo rừng Tây Nguyên"Sus scrofa” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng phát sinh loài đánh giá số đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên - Góp phần bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên mức tế bào tự nhiên Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài có ý nghĩa thực tiễn quan trọng việc xác định nguồn gốc di truyền heo rừng khu vực Tây Nguyên Các kết đạt giúp bảo tồn nguồn gen quý heo rừng khu vục Tây Nguyên Hơn nữa, kết đề tài ứng dụng sản xuất heo rừng phương pháp thụ tinh nhân tạo với nguồn tinh heo thu từ heo rừng đực khu vực Tây Nguyên TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Xác định vị trí phân loại heo rừng địa khu vực Tây Nguyên mối quan hệ phát sinh loài heo rừng giới - Xác định vị trí SNP vùng D-loop vị trí SNP gen cytochrome b heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt heo rừng Tây Nguyên nhóm heo rừng khác - Đánh giá số đặc điểm sinh học (sinh học sinh sản) heo rừng khu vực Tây Nguyên - Đánh giá đặc điểm sinh học tinh heo rừng khu vực Tây Nguyên KẾT CẤU CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 91 trang (kể Tài liệu tham khảo) chia thành phần: Phần mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 29 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kết thảo luận, 32 trang; Chương 4: Kết luận đề nghị, trang; Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án, trang; Tài liệu tham khảo, 10 trang với 123 tài liệu tham khảo Tiếng Việt, Tiếng Anh Luận án có 28 hình 16 bảng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu Tiếng Việt, 118 tài liệu Tiếng Anh với nội dung liên quan đến: Các đặc điểm sinh học heo rừng, tiến hóa phát sinh lồi, đơng lạnh tế bào… 1.1 Giới thiệu heo rừng 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Sự phân bố của heo rừng 1.1.3 Đặc điểm chung của heo rừng 1.1.4 Phương thức tìm kiếm thức ăn 1.1.5 Phạm vi sống mật độ quần thể của heo rừng 1.1.6 Đặc điểm heo rừng Việt Nam 1.2 Tiến hóa phát sinh lồi 1.2.1 Chọn lọc nhân tạo tiến hóa 1.2.2 Phát sinh lồi tiến hóa 1.2.3 Các khái niệm phát sinh loài 1.3 Một số marker phân tử 1.3.1 ADN ty thể (mtADN) 1.3.2 Gen cytochrome b 1.3.3 Vùng kiểm soát (control region) 1.3.4 Gen 16S rRNA 1.3.5 Intron vùng nhân 1.3.6 Protein kinase C 1.3.7 Các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài phân tử heo rừng 1.4 Bảo tồn heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 1.4.1 Bảo tồn giao tử heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 1.4.2 Bảo tồn tế bào sinh dưỡng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên, heo rừng lai heo địa khu vực Tây Nguyên – Việt Nam Các khái niệm heo rừng thuần, heo rừng lai, heo địa trình bày đây: - Heo rừng có nguồn gốc Tây nguyên heo rừng thu tự nhiên khu vực Tây Nguyên - Heo rừng lai heo người dân nuôi khu vực Tây Ngun, có nguồn gốc khơng rõ ràng, từ heo rừng Thái Lan, Malaysia, - Heo địa giống heo hóa lâu đời người dân địa phương chăn ni: heo Móng Cái, heo Sóc, heo đen địa phương 2.2 Phương pháp 2.2.1 Điều tra giống heo rừng địa nuôi khu vực Tây Nguyên Lập phiếu điều tra tiến hành vấn hộ chăn nuôi theo câu hỏi đặt sẵn sở tìm hiể u trước về thông tin của các hô ̣ chăn nuôi nổ i bâ ̣t từ Sở Khoa ho ̣c và Công nghê ̣, người dân… , ghi chép số liê ̣u và dùng máy chu ̣p ảnh ghi la ̣i hình ảnh các giố ng heo rừng nuôi của từng hô ̣, trang tra ̣i cu ̣ thể Đánh giá sơ bô ̣ về nguồ n gố c, chấ t lươ ̣ng giố ng heo rừng nuôi 2.2.2 Đánh giá hình thái phân tích ADN 2.2.2.1 Đánh giá hình thái Các tiêu mặt thể: Hình thái heo rừng đánh giá qua tiêu như: chiều dài thân, chiều dài chân sau, chiều dài đuôi, chiều dài tai, chiều dài mõm, chiều cao vai Phân tích hộp sọ: số đo hộp sọ sử dụng để phân tích mơ tả Các số hộp sọ phân tích bao gồm: chiều dài hộp sọ, chiều dài hàm trên, chiều dài đường bản, bề rộng gò má, bề rộng chẩm, chiều dài hàm ếch, chiều dài hàng trên, chiều dài hàng hàm phía trên, bề rộng thái dương, khoảng cách hốc mắt, chiều dài đỉnh trán, chiều dài mũi 2.2.2.2 Phân tích ADN Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt q trình phân tích ADN ty thể 2.2.3 Thu thập, nuôi dưỡng heo rừng Tây Nguyên- Việt Nam thu nhận Quá trình thu thập ni dưỡng hóa tóm tắt hình 2.2 Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt q trình hóa 2.2.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng 2.2.5 Phương pháp thống kê Dữ liệu xử lý phân tích chương trình Sigma Plot 11.0 Giá trị P ≤ 0,05 đánh giá có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Điều tra giống heo rừng nuôi khu vực Tây Nguyên Bảng 3.1 Nguồ n gố c giố ng heo rừng nuôi điạ bàn Tây Nguyên TT Nguồ n gố c giố ng heo Số lươ ̣ng điều tra (con) Heo rừng Tây Nguyên thu từ 12 (0,53%) tự nhiên Heo lai với heo rừng Tây Nguyên 40 (1,77%) Heo rừng Thái Lan hoă ̣c Malaysia 56 (2,48%) Heo lai với heo rừng Thái Lan hoă ̣c 2150 (95,22%) Malaysia Tổ ng số 2258 Từ kế t quả điề u tra cho thấ y công thức lai tạo không đồng nhất, không ổn định, giống khơng có lý lịch rõ ràng, chất lượng khơng cao 3.2 Đánh giá hình thái phân tích ADN 3.2.1 Đánh giá hình thái heo rừng có nguồn gốc Tây ngun 3.2.1.1 Phân tích thơng số thể Bảng 3.2 Thông số đo thể heo Thông số đo Heo rừng có nguồn Heo nhà gốc Tây Nguyên Đực Chiều dài thể (A) 142,8±4,8a 126,3±4,2b 115,8±1,8c a b Chiều dài đuôi (B) 25,8±0,8 19,2±0,6 22,0±0,44c Chiều dài chân sau (C) 29,0±1,0a 25,2±0,7b 25,8±0,5b a a Chiều cao vai (D) 72,8±0,8 71,1±1,6 71,4±2,5a a a Chiều dài tai (E) 11,5±0,5 11,2±0,7 21,8±0,4b Chiều dài mũi (F) 24,0±0,5a 23,2±0,2a 21,0±0,3b a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) Các thông số thể heo rừng Tây Nguyên hầu hết lớn so với heo nhà, nhiên, thông số chiều cao vai chiều dài tai heo nhà lại lớn so với heo rừng Tây Nguyên 3.2.1.2 Phân tích hộp sọ Bảng 3.3 Thông số đo hộp sọ heo Heo rừng Heo nhà Thông số đo Đực Cái 350,3±4.4a 324,0±8,2b 235,9±7,6c A a b 303,3±7,9 273,1±0,6 237,6±3,2c B a b 296,3±6,3 269,8±2,2 228,1±1,4c C-C’ ab a 136,9±2,1 131,6±4,2 143,1±1,3b D 65,5±2,2a 67,7±0,7a 71,5±0,9a E a a 177,6±3,4 168,8±1,4 128,1±1,1b F-C’ a b 116,9±2,0 107,5±0,4 73,9±1,5c G 75,3±4,7a 59,8±1,0ab 41,8±1,3b H a a 34,0±2,9 30,0±1,2 41,1±3,6a I a a 94,9±1,6 93,4±1,7 93,9±1,0a J a b 341,0±4,8 298,7±3,0 220,2±4,4c L 103,9±1,3a 102,9±0,6ab 97,2±2,0b M a b 217,1±5,9 196,4±0,2 171,0±3,9c N a b 130,1±1,6 106,6±11,3 89,9±2,6c O 41,1±0,6a 45,7±3,5a 42,8±0,8a P a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) Các thông số hộp sọ heo rừng Tây Nguyên đực hầu hết lớn heo rừng heo nhà Tuy nhiên, thông số chiều rộng xương gò má heo rừng Tây Nguyên lại nhỏ heo nhà thông số bề ngang chẩm, bề rộng thái dương, khoảng cách hốc mắt, chiều cao chẩm chiều dài cửa nhóm heo gần 3.2.2 Phân tích ADN 3.2.2.1 Kết phân tích trình tự D-loop 19 cá thể heo rừng Tây Nguyên-Việt Nam có vị trí nucleotide biến đổi giống với heo rừng Thái Lan nhóm gọi heo rừng lai (VWB12-VWB20) Các cá thể lại gọi nhóm heo 11 vị trí biến đổi (14428, 14464, 14482, 14780, 14855, 14963, 15002 15036) Do đó, có quần thể heo rừng phân biệt mặt di truyền vùng Tây Nguyên Việt Nam Ba vị trí biến đổi heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun tìm thấy, chúng khác biệt hoàn toàn so với heo rừng Châu Á Châu Âu vị trí 14482, 14780 14963 Kết cho thấy, ba vị trí dùng để phân biệt heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên với cá thể heo rừng khác Châu Á Châu Âu Gen cytochrome b chứa vị trí đa hình vị trí 15036 (T/C), 15038 (G/A), 15041 (C/T) 15045 (G/A) ADN ty thể heo Các haplotype Châu Âu bao gồm E1 (TGCG) E2 (TGTG) Các haplotype Châu Á bao gồm A1 (CATA) A2 (CATG) [39]-[52] Trong nghiên cứu này, khơng có phân bố haplotype Châu Âu heo rừng heo địa Việt Nam khu vực Tây Nguyên Trong đó, 10 cá thể heo địa Tây Nguyên - Việt Nam mang haplotype A1 Châu Á cá thể heo địa Tây Nguyên - Việt Nam mang haplotype A2 Châu Á haplotype A1 Châu Á haplotype A2 Châu Á tìm thấy nhóm heo rừng lai 11 12 Hình 3.3 Các vị trí biến đổi vùng cytochrome b ty thể cá thể heo rừng Dấu chấm “.” Thể vị trí nucleotide giống 12 13 Khoảng cách di truyền nhóm tính tốn dựa phương pháp maximum-likelihood cho thấy, khoảng cách trung bình haplotype heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 0.0002 ± 0.0002, heo rừng lai 0.0008 ± 0.0004 heo địa khu vực Tây Nguyên - Việt Nam 0.0042 ± 0.0011 Sự khác biệt tạo nên cụm khác biệt heo Việt Nam khu vực Tây Nguyên Bảng 3.5 Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei quần thể heo rừng dựa trình tự cytochrome b Vùng ma trận phía khoảng di truyền trung bình, vùng ma trận phía sai số chuẩn Heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Nhóm heo rừng Heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Heo rừng lai Heo địa TN Heo rừng châu Á (A1) Heo rừng châu Á (A3) Heo rừng châu Âu (E1) Heo rừng châu Âu (E2) Heo rừng châu Á (A2) Heo rừng châu Âu (E2) 0.0026 Heo rừng châu Á (A2) 0.0029 Heo rừng châu Âu (E1) 0.0032 0.0016 0.0017 0.0037 0.0037 0.0037 0.0037 0.0015 0.0017 0.0016 0.0035 0.0037 0.0016 0.0032 0.0033 0.0021 0.0026 0.0040 Heo rừng lai Heo địa TN Heo rừng châu Á (A1) Heo rừng châu Á (A3) 0.0034 0.0034 0.0034 0.0006 0.0000 0.0006 0.0095 0.0101 0.0007 0.0095 0.0000 0.0008 0.0073 0.0026 0.0034 0.0024 0.0095 0.0119 0.0125 0.0111 0.0091 0.0059 0.0107 0.0113 0.0107 0.0085 0.0059 0.0119 0.0021 0.0032 0.0024 0.0049 0.0143 0.0038 0.0040 0.0131 Các cá thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên nằm chung nhóm tách biệt so với nhóm khác Điều chứng tỏ heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên tách biệt di truyền so với nhóm heo rừng lai heo địa Tây Nguyên - Việt Nam 3.2.2.3 Kết phân tích trình tự 16S 13 14 Kết điện di cho thấy khuếch đại thành công vùng trình tự 16S cá thể heo rừng với chiều dài sản phẩm 701 bp Các vùng nhiễu hai đầu xóa bỏ, đoạn trình tự 16S phân tích có độ dài 664 bp Có 23 điểm đa hình nucleotide đơn (SNP) tương đương với 3,74 % tổng số trình tự ADN phân tích (664 bp) Tuy nhiên, khơng có vị trí đặc trưng 23 vị trí biển đổi giúp phân biệt heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên heo rừng lai Vì vậy, nghiên cứu vùng trình tự 16S khơng marker hữu hiệu để phân biệt heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun heo rừng lai (Hình 3.5) Hình 3.5 Các vị trí biến đổi trình tự 16S cá thể heo thu thập Dấu “.” mơ tả vị trí nucleotide giống 14 15 3.3 Thuần hóa heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 3.3.1 Điạ điể m thu nhâ ̣n heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên Bảng 3.6 Điạ điể m và số lươ ̣ng heo rừng thu nhâ ̣n tự nhiên TT Điạ điể m thu nhâ ̣n Số heo rừng thu nhâ ̣n (con) Đực Cái Tổ ng Huyê ̣n Tánh Linh, Đức Linh (tỉnh 4 Bình Thuâ ̣n) Huyê ̣n Bảo Lâm, TP Bảo Lô ̣c (tỉnh Lâm Đồ ng) Huyê ̣n Đức Tro ̣ng, Đơn Dương 10 19 (tỉnh Lâm Đồ ng) Đà la ̣t, Bidoup-Núi bà (tỉnh Lâm Đồ ng ) TP Buôn Mê Thuô ̣t, huyê ̣n Ea 3 Kar tỉnh Đắ k Lắ k Thu nhâ ̣p từ các nguồ n khác (heo 11 nhỏ dưới 10kg) Tổ ng cô ̣ng 28 26 54 Đố i với heo rừng lớn, tỷ lê ̣ thuầ n hóa thành công sau tháng là 58,14%, đó tỷ lê ̣ thành công sau tháng thuầ n hóa đố i với heo rừng nhỏ là 81,82% Bảng 3.7 Tỷ lê ̣ thuầ n hóa thành công TT Các chỉ tiêu Số lươ ̣ng Số ng sau tháng nuôi thuầ n hóa (heo 30/43 lớn) Số ng sau tháng nuôi thuầ n hóa (heo 25/43 lớn) Số ng sau tháng đố i với heo rừng nhỏ 9/11 15 Tỷ lê ̣ (%) 69,77 58,14 81,82 16 3.3.2 Đặc điểm tập tính sinh sản heo rừng q trình hóa Trong q trình hóa, đực thành thục tính sau - tháng tuổi thành thục sinh dục, có khả giao phối để sinh sau 10 tháng tuổi Trong q trình ni nhốt để hóa, chúng tơi nhận thấy heo rừng đực giao phối vào ban đêm Quá trình giao phối diễn 2-4 lần/đêm Trường hợp nuôi nhốt với thời gian 1,5 năm phát thấy chúng giao phối với heo địa heo rừng vào ban ngày Số liệu bảng 3.8 mơ tả q trình động dục heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên điều kiện dưỡng nhân tạo Trong điều kiện này, heo có thời gian sinh sản quanh năm, dài thời gian sinh sản heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên điều kiện tự nhiên So với giống khác, mức độ biểu động dục heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên thấp thời gian động dục ngắn Tuy nhiên, trọng lượng heo sinh từ heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên lớn nhiều so với trọng lượng heo sinh giống khác (Bảng 3.6) Bảng 3.8 Một số đặc điểm sinh sản heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên giai đoạn sinh Giống heo Thời gian Mức độ Thời Thời Trọng đẻ biểu gian gian lượng heo năm động dục động giao (g) dục phối Heo rừng Quanh năm ++ 1,5-2,0 18h 700±7.1a có nguồn gốc Tây Nguyên Heo rừng Tháng 6550±10.4b có nguồn gốc tháng 11 Tây Nguyên tự nhiên Lai Thái Lan Quanh năm +++ 1,5-2 16-24 600±2.5c Bản địa RagLey Quanh năm + + + + + 2-2,5 18-24 395±1.7d 16 17 Bản địa Lang Hanh (LĐ) Heo Bản địa Đạ Oai (LĐ) Quanh năm +++++ 2-2,5 18-24 410±1.8de Quanh năm +++++ 2-2,5 18-24 420±2.4e Bảng 3.9 cho thấy, thời gian mang thai heo rừng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên giống thời gian mang thai nhóm heo khác Thời gian ni heo rừng Tây Nguyên điều kiện nuôi nhốt ngắn so với nhóm heo rừng Tây Nguyên tự nhiên, dài nhóm cịn lại Số lượng heo lần đẻ tương đương với số nhóm heo rừng khác Tuy nhiên, nhóm heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có số lứa đẻ năm cao so với nhóm điều kiện tự nhiên Bảng 3.9 Một số đặc điểm sinh sản heo rừng Tây Nguyên sau giai đoạn sinh Giống heo Trọng Thời Thời Thời Số Số lứa lượng heo gian gian gian chờ lượng đẻ (g) mang nuôi phối sau heo năm thai tách con/lứa (ngày) (ngày) (ngày) Heo rừng 700±7.1a 110-120 65-75 10-30 4–8 1,6-1,7 có nguồn gốc Tây Nguyên Heo rừng 550±10.4b 80-90 3–8 1,0 có nguồn gốc Tây Nguyên tự nhiên Lai Thái Lan 600±2.5c 110-120 60-65 10-20 4–8 1,8-1,9 Bản địa 395±1.7d 112-116 50-55 5-10 – 12 2,0-2,1 RagLey Bản địa 410±1.8de 112-116 50-55 5-10 – 12 2,0-2,1 Lang Hanh Bản địa Đạ 420±2.4e 112-116 50-55 5-10 – 10 2,0-2,1 Oai 17 18 3.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên- Việt Nam 3.4.1 Tinh trùng heo rừng 3.4.1.1 Đánh giá số đặc điểm tinh heo rừng Giá trị pH: Giá trị pH tinh heo từ giống Landrace khoảng 7, tinh heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có giá trị pH (Bảng 3.10) Kết cho thấy, giá trị pH tinh dịch thu từ mào tinh nhỏ so với giá trị pH tinh dịch xuất bên pH Mật độ tinh trùng Tỉ lệ sống chết Dạng kết dính Bảng 3.10 Các thông số tinh dịch Giống Landrace ST: Giống Landrace Heo rừng có 3350 Đại học Nơng Lâm nguồn gốc Tây Công ty Greenfeed (đánh giá tinh trùng Nguyên (đánh giá tinh trùng tinh dịch) tinh dịch) 7 23,93 ± 3.18 x 106 (a) 36,40 ± 7.77 x 106 (b) 498,67 ± 9,30 x 106 (c) 68,46 ± 2,49 % (a) 68,99 ± 1,29 % (b) 91,20 ± 1,17 % (c) C,d C,d A,b,c,d a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) Mật độ tinh trùng: Với lượng mật độ lớn, nguồn tinh trùng thu từ mào tinh heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên lưu trữ cho mục đích bảo tồn, chúng sử dụng cho tạo phơi phương pháp vi tiêm tinh trùng vào trứng Tỉ lệ sống tinh trùng: tỉ lệ tinh trùng sống cao heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu đông lạnh để bảo quản nguồn tinh trùng Đánh giá kết dính tinh trùng (Aggregation): Các tinh trùng bất động bám dính vào tinh trùng di động tạo thành cụm, ngồi mảnh mơ hay tế bào bám vào tinh trùng di động Tinh trùng 18 19 heo Giống Landrace ST: 3350 Công ty Greenfeed Giống Landrace Đại học Nơng Lâm có dạng chủ yếu, tức tinh trùng có bám dính vào tế bào biểu mơ hay mảnh mơ, tinh trùng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có dạng bao gồm dạng dạng tinh trùng tự Kỳ hình tinh trùng heo rừng: Trong trình quan sát, chúng tơi nhận thấy tinh trùng heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun chủ yếu có dạng kì hình xảy vùng đuôi tinh trùng, không nhận thấy bất thường xảy vùng đầu tinh trùng 3.4.1.2 Đông lạnh tinh trùng Ảnh hưởng tiến trình hạ nhiệt Trong nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát thời gian hạ nhiệt độ trình đông lạnh tinh trùng heo rừng theo nghiệm thức sau:  Nghiệm thức 1: 20cm (5 phút) + 15cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 2: 20cm (5 phút) + 15cm (15 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 3: 20cm (5 phút) + 10cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 4: 20cm (5 phút) + 10cm (15 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 5: 20cm (5 phút) + 5cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 6: 20cm (5 phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng Sau đông lạnh, tinh trùng đông lạnh giải đông đánh giá tỉ lệ sống chết dựa phương pháp nhuộm eosin-nigrosin Số tinh trùng sống chết đếm 200 tinh trùng Bảng 3.11 Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông nghiệm thức khác Nghiệm thức Tỉ lệ tinh 23,67%a 30,67%b 24,67%a 37,83%c 35,33%d 40,67%e trùng sống 19 20 Kết cho thấy nghiệm thức 1, nghiệm thức có tỉ lệ tinh trùng sống thấp Nghiệm thức có tỉ lệ tinh trùng sống cao 40,67%, nghiệm thức có tỉ lệ tinh trùng sống 37,83% nghiệm thức có tỉ lệ tinh trùng sống 35,33% nghiệm thức có tỉ lệ tinh trùng sống 30,67% (Bảng 3.11) So với nghiên cứu khác, kết có tỉ lệ tinh trùng sống cao sau giải đông Trong nghiên cứu Panida cộng năm 2011, tỉ lệ tinh trùng sống 38,10% [80] Tỉ lệ sống tinh trùng sau giải đông nghiên cứu có tỉ lệ cao 40,67% Như vậy, nghiệm thức 4, nghiệm thức nghiệm thức có tốc độ làm lạnh phù hợp cho q trình đơng lạnh tinh trùng heo rừng, q trình đơng lạnh theo nghiệm thức (20cm (5 phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng) phù hợp cho đông lạnh tinh heo rừng Tây Nguyên Ảnh hưởng nồng độ glycerol Tỷ lê ̣ số ng của tinh trùng đông la ̣nh đươ ̣c đánh giá sau thời gian đông la ̣nh tháng Trong q trình đơng lạnh tinh trùng, chúng tơi sử dụng môi trường đông lạnh bổ sung glycerol nồng độ khác 5%, 10%, 15% 20% Bảng 3.12 Tỷ lê ̣ số ng của tinh trùng thu từ mào tinh đông la ̣nh Nồng độ glycerol (%) 10 15 20 Tỉ lệ tinh 13,66%a 12,94%a 25,59%b 19,71%c trùng sống Tỉ lệ sống chết môi trường đơng lạnh có nồng độ glycerol 15% cao đó, mơi trường đơng lạnh có nồng độ glycerol khác có tỉ lệ sống/chết thấp nồng độ 5%, 10% nồng độ 20% (Bảng 3.12) Đây lần đầu tiên, quy trình đơng lạnh tinh heo từ mào tinh nghiên cứu Kết thu khả quan 20 21 3.4.2 Đông lạnh tế bào Trong nghiên cứu này, tế bào từ mơ tai heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun phân lập ni cấy sau tế bào bảo quản đông lạnh nitơ lỏng Trong trình ni cấy, mảnh mơ bắt đầu dính vào đĩa nuôi cấy ngày thứ Ngày thứ – 6, tế bào nuôi cấy bắt đầu phát triển mọc xung quanh miếng mô tai heo Sau 10 ngày ni cấy, tế bào mọc kín khoảng 90-95% bề mặt đĩa ni (Hình 3.12) Hình 3.12 Tế bào heo rừng Tây Nguyên nuôi cấ y sơ cấ p A: Tế bào sau ngày nuôi (x 20) B: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x 10) C: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x 20) D: Tế bào lan tỏa đa ̣t cấ y chuyề n (x 10) 21 22 Hình 3.13 Tế bào heo rừng Tây Nguyên nuôi cấ y chuyề n phòng TN A: Tế bào sau tách trypsin/edta 0,25% (X20) B: Tế bào sau 24h cấy chuyền lần (X10) C: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần (X10) D: Tế bào sau 48h cấ y chuyề n lầ n (X20) E: Tế bào sau 48h cấ y chuyề n lầ n (X20) F: Tế bào sau 72h cấ y chuyề n (X10) Sau cấy chuyền, tế bào tách trypsin bảo quản đông lạnh nitơ lỏng Sau đông lạnh tháng, tế bào giải đông nuôi cấy để kiểm tra sức sống khả tăng sinh tế bào Kết cho thấy, sau giải đông tỉ tệ sống tế bào 60% Tế bào tăng sinh phát triển mạnh sau 3-4 ngày sau giải đông đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày (Hình 3.14) Hình 3.14 Tế bào heo rừng Tây Nguyên sau giải đông A, B, C: tế bào nuôi cấy sau giải đông ngày A1, B1, C1: tế bào nuôi cấy sau giải đông ngày 22 23 KẾT LUẬN - Heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun thu nhận lồi heo Sus scrofa Linnaeus, 1758 - Quá trình thu thập, nuôi dưỡng heo rừng Tây Nguyên đạt tỉ lệ hóa thành cơng sau tháng cao 81,82% cá thể có trọng lượng nhỏ (dưới 10 kg) - Quá trình động dục heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên điều kiện dưỡng xảy quanh năm, dài thời gian sinh sản heo rừng Tây Nguyên điều kiện tự nhiên Các thông số thể thông số hộp sọ heo rừng Tây Nguyên hầu hết lớn so với heo nhà - Xác định vị trí SNP vùng D-loop vị trí SNP gene cytochrome b heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt heo rừng Tây Nguyên nhóm heo rừng khác - Tinh trùng heo rừng Tây Nguyên thu từ mào tinh có giá trị pH = 6, mật độ 498,67 ± 9,3 x 106, tỉ lệ sống chết đạt trung bình 91,20% ± 1,17 Tinh trùng heo rừng Tây Ngun có dạng kết dính vào tế bào biểu mơ, mảnh mơ, kết dính với bao gồm dạng tinh trùng tự Các dạng kì hình tinh trùng heo rừng Tây Nguyên bình thường, có vài dạng kì hình xảy vùng đuôi, không nhận thấy bất thường xảy vùng đầu tinh trùng - Tỉ lệ sống tinh trùng heo rừng Tây Nguyên sau giải đông 40,67% Tỉ lệ sống tế bào sau giải đông 60%, tế bào tăng sinh phát triển mạnh đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày 23 24 ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục có nghiên cứu sâu đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên điều kiện tự nhiên hóa - Phân tích trình tự cịn lại ADN ty thể để xây dựng trình tự ADN ty thể heo rừng Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định vị trí phân loại heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên mối quan hệ phát sinh loài heo rừng giới - Xác định vị trí SNP vùng D-loop vị trí SNP gen cytochrome b heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt heo rừng Tây Nguyên nhóm heo rừng khác - Đánh giá số đặc điểm sinh học (sinh học sinh sản) heo rừng khu vực Tây Ngun 24 25 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Ngọc Châu, Nguyễn Khắc Duy, Lê Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, 2012 Phân tích số đặc điểm đa hình mối quan hệ phát sinh loài lợn rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên dựa trình tự gen cytochrome b ty thể Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 285291 Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Thành Long, Diệp trung Cang, Võ Thành Trung, Nguyễn Thị Phương Thảo, Hoàng Nghĩa Sơn, 2015 Đánh giá số đặc điểm tinh trùng thu từ mào tinh lợn rừng địa Tây Nguyên (Sus scrofa) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(4A): 1195-1201 Hồng Nghĩa Sơn, Nguyễn Thị Phương Mai, Hà Thanh Tùng, Lê Thị Châu, Nguyễn Hữu Dn, Nguyễn Khắc Duy, Đồn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê Thành Long, 2013 Đánh giá mối quan hệ di truyền heo rừng Việt Nam dựa vùng D-loop ty thể Tạp chí Sinh học, 35(3SE): 200-206 Le Thanh Long, Nguyen Thi Phuong Mai, Doan Chinh Chung, Do Minh Si, Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Son, 2014 The gentic relationship of Vietnamese pigs in Central highlands assessed by cytochrome b Open Journal of Gentics., (5): 362-369 Hoàng Nghĩa Sơn, Lê Thành Long, Nguyễn Thị Phương Mai, 2014 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học lợn rừng (Sus scrofa) Tây Nguyên Tạp chí Sinh học, 36(2): 253-258 25