Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mlpa xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân u nguyên bào thận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - Đỗ Thị Ngọc Thùy NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN LẶP HOẶC MẤT ĐOẠN TẠI VỊ TRÍ 1p VÀ 16q TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẬN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Đỗ Thị Ngọc Thùy NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN LẶP HOẶC MẤT ĐOẠN TẠI VỊ TRÍ 1p VÀ 16q TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẬN Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật xét nghiệm y học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS Nguyễn Văn Thắng TS Bùi Chí Bảo Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS BS Nguyễn Văn Thắng Thầy hướng dẫn, bảo, dạy dỗ em từ bước vào học Giải phẫu bệnh Thầy gương sáng cho em phấn đấu Em xin chân thành cảm ơn TS Bùi Chí Bảo Thầy truyền dạy kiến thức quý báu cho em gương sáng công việc, nghiên cứu học tập Hai Thầy hướng dẫn bỏ công sức, giúp đỡ em nhiều giúp em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Anh Chị khoa Vi sinh, Sinh học phân tử bệnh viện Nhi đồng Thành phố tạo điều kiện sở vật chất nguyên vật liệu giúp tơi hồn thành thu thập số liệu cho luận văn Xin chân thành cảm ơn Bộ môn Y sinh học phân tử- Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi thu thập số liệu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Đồng 1, Phòng nghiên cứu khoa học, Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi đồng cho phép tạo điều kiện tốt để tơi thu thập xử lý số liệu cho luận văn Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Bộ môn Xét nghiệm Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, nhiệt tình giúp đỡ cung cấp nhiều kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Đỗ Thị Ngọc Thùy MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 U nguyên bào thận 1.1.1 Đại cương 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Gen sinh học phân tử 1.1.4 Đặc điểm giải phẫu bệnh u nguyên bào thận 12 1.1.5 Phân loại u nguyên bào thận 13 1.1.6 Điều trị u nguyên bào thận 16 1.2 Kỹ thuật MLPA 17 1.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật MLPA: 19 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại đoạn dị mẫu mơ vùi nến u ngun bào thận 22 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 23 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 23 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 23 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: 23 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu: 23 2.3 Quy trình nghiên cứu: 23 2.4 Các quy trình kỹ thuật 24 2.4.1 Dụng cụ, thiết bị: 24 2.4.2 Hóa chất nghiên cứu: 24 i 2.4.3 Các quy trình kỹ thuật 25 2.5 Thu thập số liệu 25 2.6 Lưu đồ nghiên cứu 27 2.7 Kiểm soát sai lệch 28 2.7.1 Kiểm soát sai lệch chọn lựa 28 2.7.2 Kiểm sốt sai lệch thơng tin 28 2.7.3 Kiểm soát chất lượng kỹ thuật MLPA 28 2.8 Phương pháp quản lý phân tích số liệu 28 2.9 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.9.1 Thời gian nghiên cứu 29 2.9.2 Địa điểm nghiên cứu 29 2.10 Xử lý số liệu 29 2.11 Đạo đức nghiên cứu: 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 30 3.1.1 Đặc điểm tuổi 30 3.1.2 Đặc điểm giới tính bệnh nhân 30 3.1.3 Đặc điểm phân bố vị trí khối u: 31 3.1.4 Phân loại u theo giai đoạn bệnh dựa tổn thương mô học 31 3.1.5 Đặc điểm mô học 32 3.1.6 Di hạch 33 3.2 Kết thực phản ứng MLPA 33 3.2.1 Kết chiết tách DNA 33 3.2.2 Kết thực MLPA 36 3.2.3 Tỷ lệ đoạn exon 1p và/hoặc 16p 37 3.2.4 Tỷ lệ đoạn exon 1p 37 3.2.5 Tỷ lệ đoạn exon 1p 38 3.2.6 Tỷ lệ đoạn exon 1p 16q 38 3.2.7 Tỷ lệ tăng đoạn exon 1q 38 i 3.2.8 Một số gen có liên quan khác phát kỹ thuật MLPA 39 Chương BÀN LUẬN 41 4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 41 4.1.1 Đặc điểm tuổi 41 4.1.2 Đặc điểm giới tính bệnh nhân 43 4.1.3 Phân bố u theo vị trí: 43 4.1.4 Phân loại u theo giai đoạn bệnh dựa tổn thương mô học: 43 4.1.5 Phân loại mô học 44 4.1.6 Di hạch 44 4.2 Kết thực phản ứng MLPA 45 4.2.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu mô vùi nến 45 4.2.2 Kết thực MLPA 47 4.2.3 Tỷ lệ đoạn exon 49 4.2.4 Tăng số lượng 1q 51 4.2.5 Bất thường gen TP53 51 4.2.6 Bất thường gen WT 52 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Những hội chứng gen có liên quan đến UNBT Bảng 1.2: Phân nhóm nguy theo mơ học bệnh nhân hóa trị liệu trước– Phân loại SIOP [84] 14 Bảng 3: Phân nhóm nguy theo mô học bệnh nhân phẫu thuật trước– Phân loại SIOP [84] 15 Bảng 1.4: Phân nhóm nguy theo mô học – Phân loại COG 16 Bảng 1.5: So sánh kỹ thuật MLPA sinh học phân tử khác ứng dụng phát lặp đoạn 18 Bảng 3.5: Kết tách chiết sau đo máy Nanodrop 1000 34 Bảng 3.6: Kết thực MLPA 36 Bảng 3.7: Tỷ lệ đoạn exon 1p và/hoặc 16p 37 Bảng 3.8: Tỷ lệ đoạn exon 1p 37 Bảng 3.9: Tỷ lệ đoạn exon 16p 38 Bảng 3.10: Tỷ lệ đoạn exon 1p 16p 38 Bảng 3.11: Tỷ lệ tăng đoạn exon 1q 38 Bảng 3.12: Một số gen có liên quan khác phát kỹ thuật MLPA 39 Bảng 4.1: So sánh tuổi 41 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: Tần suất mắc năm u nguyên bào thận u khác thận 1.000.000 trẻ 15 tuổi năm 1990 Biểu đồ 1.2: Tần suất mắc năm u nguyên bào thận u khác thận năm 1.000.000 trẻ 15 tuổi năm 2020 Biểu đồ 1.3: Tỷ lệ sống cịn khơng bệnh bệnh nhân giai đoạn I/II 10 Biểu đồ 1.4: Tỷ lệ sống không bệnh bệnh nhân giai đoạn giai đoạn III/IV 10 Biểu đồ 1.5: Hướng dẫn phân loại nguy theo COG cho UNBT 11 Biểu đồ 3.1: Sự phân bố giới tính u nguyên bào thận 31 Biểu đồ 3.2: Di hạch ổ bụng 33 i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Hình ảnh thể tế bào u lịng niệu quản (H&E x 4X) 32 Hình 3.2: Kết đo nồng độ DNA máy 35 Hình 3.3: Điện di agarose gel 0.5% 36 Hình 3.4: Kết giải trình tự gen máy ABI 3500 phân tích kết genmarker 1.97 40 Hình 4.1: Sự khử Cytosine 46 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 in Lynch syndrome (HNPCC) by novel techniques", Human mutation, 22 (3), pp 258-258 50 Nakata K, Colombet M, Stiller C A, Pritchard‐Jones K, et al, (2020), "Incidence of childhood renal tumours: An international population‐based study", International journal of cancer, 147 (12), pp 3313-3327 51 Niedzielski J, Taran K, Młynarski W, Sitkiewicz A, (2012), "Is the SIOP-2001 Classification of Renal Tumors of Childhood accurate with regard to prognosis? A problem revisited", Archives of medical science: AMS, (4), pp 684 52 Ng A G A, Cole T et al (2007), "Congenital abnormalities and clinical features associated with Wilms' tumour: a comprehensive study from a centre serving a large population", European journal of cancer European journal of cancer Jun;43(9):1422-9 Epub 2007 May 17 pp 1422-1429 53 Ooms A H, Gadd S, Gerhard D S, Smith M A, et al, (2016), "Significance of TP53 mutation in Wilms tumors with diffuse anaplasia: A report from the children's oncology group", Clinical Cancer Research, 22 (22), pp 5582-5591 54 Park J E, Noh O K, Lee Y, Choi H S, et al, (2020), "Loss of Heterozygosity at Chromosome 16q Is a Negative Prognostic Factor in Korean Pediatric Patients with Favorable Histology Wilms Tumor: A Report of the Korean Pediatric Hematology Oncology Group (K-PHOG)", Cancer research and treatment: official journal of Korean Cancer Association, 52 (2), pp 438 55 Pelletier J, Bruening W, Li F P, Haber D A, et al, (1991), "WT1 mutations contribute to abnormal genital system development and hereditary Wilms' tumour", Nature, 353 (6343), pp 431-434 56 Pritchard-Jones K, Kelsey A, Vujanic G, Imeson J, et al, (2003), "Older age is an adverse prognostic factor in stage I, favorable histology Wilms’ tumor treated with vincristine monochemotherapy: a study by the United Kingdom Children’s Cancer Study Group, Wilm’s Tumor Working Group", Journal of clinical oncology, 21 (17), pp 3269-3275 57 Phelps H M, Kaviany S, Borinstein S C, Lovvorn H N, (2018), "Biological drivers of Wilms tumor prognosis and treatment", Children, (11), pp 145 58 Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Handbook https://wwwqiagencom/us/products/discovery-and-translationalresearch/dna-rna-purification/dna-purification/genomic-dna/qiaampdna-ffpe-tissue-kit/ Qiaagen: Qiaagen, 2020 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 60 59 Rahman N, Abidi F, Ford D, Arbour L, et al, (1998), "Confirmation of FWT1 as a Wilms’ tumour susceptibility gene and phenotypic characteristics of Wilms’ tumour attributable to FWT1", Human genetics, 103 (5), pp 547-556 60 Rahman N, Arbour L, Tonin P, Renshaw J, et al, (1996), "Evidence for a familial Wilms' tumour gene (FWT1) on chromosome 17q12– q21", Nature genetics, 13 (4), pp 461-463 61 Rivera M N, Haber D A, (2005), "Wilms' tumour: connecting tumorigenesis and organ development in the kidney", Nature Reviews Cancer, (9), pp 699-712 62 Ruteshouser EC H V, (2004), "Familial Wilms tumor", American journal of medical genetics Aug 15;129C(1) pp 29-34 63 Schwartz M, Dunø M, (2004), "Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method", Genetic testing, (4), pp 361-367 64 Snijders A M, Nowak N, Segraves R, Blackwood S, et al, (2001), "Assembly of microarrays for genome-wide measurement of DNA copy number", Nature genetics, 29 (3), pp 263-264 65 Spreafico F B F, (2006), "Wilms' tumor: past, present and (possibly) future", Expert review of anticancer therapy Feb;6(2) pp 249-258 66 Spreafico F B G, Collini P et al (2008), "Treatment of high-risk relapsed Wilms tumor with dose-intensive chemotherapy, marrowablative chemotherapy, and autologous hematopoietic stem cell support: experience by the Italian Association of Pediatric Hematology and Oncology", Pediatric blood and cancer Jul;51(1) pp 23-28 67 Stiller C, Parkin D, (1990), "International variations in the incidence of childhood renal tumours", British journal of cancer, 62 (6), pp 1026-1030 68 Szychot E, Apps J, Pritchard-Jones K, (2014), "Wilms’ tumor: biology, diagnosis and treatment", Translational pediatrics, (1), pp 12 69 Uba A, Chirdan L, (2007), "Childhood Wilm\'s tumour: prognostic factors in north central Nigeria", West African journal of medicine, 26 (3), pp 222-225 70 van Dijk M C, Rombout P D, Boots-Sprenger S H, Straatman H, et al, (2005), "Multiplex ligation-dependent probe amplification for the detection of chromosomal gains and losses in formalin-fixed tissue", Diagnostic Molecular Pathology, 14 (1), pp 9-16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 71 Vujanić G M, Sandstedt B, Harms D, Kelsey A, et al, (2002), "Revised International Society of Paediatric Oncology (SIOP) working classification of renal tumors of childhood", Medical and pediatric oncology, 38 (2), pp 79-82 72 Vujanić GM S B, (2010), "The pathology of Wilms' tumour (nephroblastoma): the International Society of Paediatric Oncology approach", Journal of Clinical Pathology, Feb;63(2) pp 102-109 73 Vujanic GM S B, Harm D et al (2002), "Revised International Society of Pediatric Oncology (SIOP) working classification of renal tumors of childhood", Medical and Pediatric Oncology 38 pp 7982 74 Wegert J, Vokuhl C, Ziegler B, Ernestus K, et al, (2017), "TP53 alterations in Wilms tumour represent progression events with strong intratumour heterogeneity that are closely linked but not limited to anaplasia", The Journal of Pathology: Clinical Research, (4), pp 234-248 75 Williams R D, Al‐Saadi R, Natrajan R, Mackay A, et al, (2011), "Molecular profiling reveals frequent gain of MYCN and anaplasia‐ specific loss of 4q and 14q in Wilms tumor", Genes, Chromosomes and Cancer, 50 (12), pp 982-995 76 Wittmann S, Zirn B, Alkassar M, Ambros P, et al, (2007), "Loss of 11q and 16q in Wilms tumors is associated with anaplasia, tumor recurrence, and poor prognosis", Genes, Chromosomes and Cancer, 46 (2), pp 163-170 77 Yang J, Li S Y, Li Y Q, Cao J Q, et al, (2013), "MLPA-based genotype–phenotype analysis in 1053 Chinese patients with DMD/BMD", BMC medical genetics, 14 (1), pp 29 78 Hồng Ngọc Thạch B S, Phó Hồng Diệp, (2013), "Phân loại u thận trẻ em u nguyên bào thận theo SIOP 2001 Bệnh viện Nhi Trung Ương từ 2019-2012", (1), pp 60 79 Schouten J P, McElgunn C J, Waaijer R, Zwijnenburg D, et al, (2002), "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification", Nucleic Acids Research, 30 (12), pp e57-e57 80 Stuppia L, Antonucci I, Palka G, Gatta V, (2012), "Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases", International journal of molecular sciences, 13 (3), pp 3245-3276 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình nhuộm Hematoxylin Eosin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 Phụ lục 2: Quy trình tách chiết DNA Nguyên tắc kỹ thuật tách DNA: tách chiết DNA dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) Thực theo quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu mô paraffin Bộ kit thương mại sử dụng QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit Thành phần kit:  QIAamp MinElute columns  Collection Tube  Dung dịch đệm ATL  Dung dịch đệm AL  Dung dịch đệm AW1  Dung dịch đệm AW2  Dung dịch đệm ATE  Proteinase  UNG Chuẩn bị mẫu: - Lựa chọn tiêu mô bệnh học tương ứng với danh sách lập - Loại bỏ bệnh nhân khơng có tiêu khỏi danh sách - Soi tiêu mô bệnh học để xác định vùng mô u cần lấy Khoanh vùng mô cần lấy tương ứng với vùng soi tiêu có hình ảnh tế bào u rõ, tổ chức hoại tử (được thự bác sĩ Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi Đồng thực dựa vào tiêu chuẩn phân loại mô bệnh học u nguyên bào thận) - Lựa chọn khối vùi nến tương ứng với tiêu chọn, đặt khối vùi nến lên máy cắt vi tiện, chỉnh độ dầy lát cắt mức 10m Tiến hành cắt thành lát cắt, trải lên lam kính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 - Đối chiếu vùng khoanh tiêu chọn, tiến hành cạo phần mơ lam kính cho vào eppendorf đậy nắp kín - Đánh mã số cho mẫu mơ nghiên cứu Quy trình chiết tách Lấy tube eppendorf chứa mẫu chọn theo tiêu chí mục 2.1.3 Thêm 1mL xylen, đậy nắp, vortex 10 giây Ly tâm 15000 vòng/2 phút nhiệt độ phòng (15-250C) Dùng micropipette loại bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần cặn Thêm 1mL Ethanol (96-100%), vortex Ly tâm 15000 vòng/2 phút nhiệt độ phòng (15-250C) Dùng micropipette loại bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần cặn Mở nắp eppendorf để nhiệt độ 370C 10 phút (để cho bay hết Ethanol cịn sót lại) Thêm 180L dung dịch đệm ATL, 20L proteinase K, vortex để trộn hỗn hợp 10 Ủ 560C (hoặc mẫu thử ly giải hoàn toàn) 11 Ủ 900C (nếu ủ với thời gian lâu nhiệt độ cao làm DNA đứt gãy nhiều hơn) 12 Ly tâm nhẹ 13 Thêm 2L UNG, vortex 14 Ủ 500C 15 Ủ 950C 20 phút 16 Thêm 200L dung dịch đệm AL, vortex Thêm 200L Ethanol (96-100%), vortex 17 Ly tâm nhẹ 18 Chuyển hỗn hợp sang cột QIAamp MinElute (chứa collectiontube 2mL), đậy nắp cột Ly tâm 6000 x g (hoặc 8000rpm) phút 19 Chuyển cột vừa ly tâm sang collection tube 2mL khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 20 Thêm 500L dung dịch đệm AW1 vào cột QIAamp MinElute Ly tâm 6000 x g (hoặc 8000rpm) phút Chuyển cột vừa ly tâm sang collection tube 2mL khác 21 Thêm 500L dung dịch đệm AW2 vào cột QIAamp MinElute Ly tâm 6000 x g (hoặc 8000rpm) phút Chuyển cột vừa ly tâm sang collection tube 2mL khác 22 Ly tâm 20000 x g (hoặc 14000rpm) phút để làm khơ hồn tồn màng lọc (bước quan trọng Ethanol cịn sót lại màng lọc ảnh hưởng đến chất lượng DNA thu được) 23 Chuyển cột QIAamp MinElute sang eppendorf 1.5mL 24 Thêm 20-100L dung dịch đệm ATE vào màng lọc cho ATE thấm vào màng lọc 25 Đậy nắp đặt nhiệt độ phòng phút (Thời gian ủ kéo dài đến phút giúp tăng lượng DNA thu được) 26 Ly tâm 20000 x g (hoặc 14000rpm) phút 27 Loại bỏ cột QIAamp MinElute, thu gDNA 28 DNA thu chưa sử dụng bảo quản -300C đến -150C Đo nồng độ DNA thu kiểm tra độ tin Nguyên tắc để xác định nồng độ acid nucleic (DNA) dựa vào giá trị mật độ quang OD sau: dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm (OD260 nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA mẫu dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD260 nm tương ứng với nồng độ là: - 50 μg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi - 40 μg/ml cho dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Hàm lượng DNA xác định công thức: [DNA] = OD260 x 50 (μg) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 Độ hấp thụ bị ảnh hưởng mẫu khơng (chứa RNA protein) Vì vậy, thực tế phương pháp thường dùng để định lượng mẫu DNA có độ tinh đạt yêu cầu Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 280 nm hấp thụ acid amin, đo giá trị mật độ quang OD bước sóng 280 nm Độ DNA xác định tỷ số OD260/ OD280 Nếu tỷ số 1,8 - 2,0 dung dịch DNA đem đo coi Cách đo: Đo nồng độ độ tinh DNA máy Nanodrop 2000/2000c Bước Mở máy tính phần mềm ứng dụng dùng đo OD: Nanodrop nhấn “Acid nucleic” Bước Dùng μl nước làm mẫu trắng Khi đo nước, nhấn nút “Blank”, đưa thông số giá trị Lưu ý, sau lần đo xong phải lau nước dung dịch mẫu Bước Hút dung dịch DNA (2 μl), cho vào máy nhấn nút “Measure”, ghi lại kết nồng độ độ tinh mẫu DNA Đưa DNA nồng độ đủ để thực MLPA: Lượng DNA cần để thực phản ứng MLPA từ 20-50ng/L Do nồng độ DNA thu lớn 50ng/L phải tính tỷ lệ pha lỗng với dung dịch đệm dung dịch đệm ATE Sau tiến hành đo ghi lại kết nồng độ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 Quy trình chiết tách DNA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 Phụ lục 3: Kỹ thuật MLPA điện di mao quản Sử dụng kit thương mại Kit thương mại SALSA MLPA probemix P380B1 Wilms Tumour (MRC - Holland) SALSA MLPA gồm 43 MLPA probe, khuếch đại sản phẩm có kích thước từ 0-500 nt, 12 probe NST số 1, probe NST số 16, probe NST X, 17 probe NST số 2, 4, 11, 17 TNFRSF18_1p36.33 CHD5_1p36.31 MIR34A_1p36.22 MFN2_1p36.22 WNT4_1p36.12 ABCA4_1p22.1 HMGSC2_1p12 BCL9_1q21.2 MPZ_1q23.3 KISS1_1q32.1 IRF6_1q32.2 SDCCAG8_1q43 MYCN-ex2_2p24.3 MYCN-ex3_2p24.3 MYCN-ex3_2p24.3 DYSF_2p13.2 PAX3_2q36.1 PKD2_4q22.1 FBXW7- FBXW7-ex7_4q31.3 FBXW7-ex3_4q31.3 IGF2_11p15.5 WT1-ex11_11p13 WT1-ex9_11p13 WT1-ex5_11p13 CREBBP_16p13.3 ABCC6_16p13.11 VKORC1_16p11.2 SALL1_16q12.1 SLC12A3_16q13 TK2_16q21 CDH1_16q22.1 MLYCD_16q23.3 FANCA_16q24.3 TP53-ex10_17p13.1 TP53-ex7_17p13.1 ex12_4q31.3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 TP53-ex3_17p13.1 RAI1_17p11.2 RPS6KA3_Xp22.12 AMER1-ex2_Xq11.2 AMER1-ex2_Xq11.2 AMER1-ex1_Xq11.2 CHM_Xq21.2 GBE1_3p12 ATR_3q23 NIPBL_5p13 IL4_5q31 CDK5RAP2_5q33 NODAL_10q22 GABRB3_15q12 CAPN3_15q15 LDLR_19p13 CRX_19q13 Ngồi kit cịn kèm theo 10 đoạn trình tự kiểm sốt chất lượng cho phản ứng: gồm có 04 đoạn Q-fragment (Quantity control fragment) 64-70-76-82 nt, 03 đoạn D-fragment (Denaturation control fragment) 88-92-96 nt, đoạn 100 nt cho nhiễm sắc thể X đoạn 105 nt cho nhiễm sắc thể Y * Thành phần hóa chất: - SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris-HCl, EDTA PEG-6000, pH 8.5 - SALSA Ligase-65: Glycerol, BRIJ 0.05%, EDTA, KCl, Tris-HCl, BetaMercaptoethanol 0.1%, pH 7.5, Ligase-65 enzyme (từ vi khuẩn) - Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3.5 - Ligase buffer B: Tris-HCl, non-ionic detergents, MgCl2, pH 8.5 - SALSA PCR Primer Mix: chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh quang Cy5, dNTPs, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8.0 - SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0.5%, EDTA, DTT 0.1%, KCl, Tris-HCl, Polymerase enzyme (nguồn gốc vi khuẩn), pH 7.5 - Probemix: chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi khuẩn, Tris-HCl, EDTA, pH 8.0 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 70 * Bảo quản: hóa chất bảo quản nhiệt độ -250C đến -150C, bảo quản hộp tránh ánh sáng * Hóa chất để phân tách đoạn: - Formamide chất lượng cao: Hi-Di Formamide Beckman Sample Loading Solution (SLS) - Labelled size standard: Beckman D1-600 - Dầu khoáng - Polymers: Beckman gel *Các bước tiến hành Chương trình nhiệt cho phản ứng MLPA: (1) Biến tính DNA: 980C phút (2) Phản ứng lai hóa: 600C 16 – 20 (qua đêm) [50] Phản ứng nối đoạn probe: 540C 15 phút 980C phút (4) Phản ứng PCR: 950C 30 giây 35 chu kỳ 600C 30 giây 720C 60 giây 720C 20 phút Quy trình kỹ thuật: Chọn mẫu chứng: mẫu chứng nam mẫu chứng nữ xác định khơng có đột biến liên quan đến bệnh, tiến hàn thực chiết tách MLPA để chọn chứng tin cậy cho mẫu thử Quy trình: - Lấy 5μl mẫu DNA (có nồng độ 50 đến 250ng) cho vào tube 0,2ml đem biến tính DNA 980C phút Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 - Thêm 3μl hỗn hợp hybridisation master mix vào tube phản ứng (gồm 1,5μl dung dịch đệm MLPA 1,5μl probemix), ủ 95oC phút, sau lai hóa 60oC 16h – 20h (qua đêm) - Thêm 32μl hỗn hợp Ligase-65 master mix (gồm 25μl dH2O, 3μl Ligase buffer A, 3μl Ligase buffer B, 1μl enzyme Ligase-65) vào tube phản ứng, trộn đều, ủ 54oC 15 phút để nối probe gắn huỳnh quang, sau tăng nhiệt độ lên 98oC phút để phá hủy enzyme ligase65 sau phản ứng nối probe - Thêm 10μl hỗn hợp polymerase master mix (gồm 7,5μl dH2O, 2μl SALSA PCR primer 0,5μl SALSA polymerase) vào tube tiến hành chạy phản ứng PCR, lặp lại 35 chu kỳ Sau kéo dài kết thúc 72oC 20 phút - Sản phẩm sau khuếch đại phân tách đoạn hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP điều kiện: 32μl SLS (hay formamide) + 0.2μl Beckman D1-labeled CEQ size standard 600 + 1μl sản phẩm PCR; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C /20 giây, điện bơm mẫu vào 2kV 30 giây, điện phân tách đoạn 4,8kV 60 phút - Kết sau chạy điện di phân tích tự động để phát đột biến nhờ phần mềm GeneMarker ver 1.91 (Softgenetics) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 Phụ lục : Bảng thu thập số liệu U (Giai đoạn bên Thoái sản (1=1 No ID Mơ học (1=Khu trú, bên, Vị trí u (1=Thuận lợi, 2=Lan tỏa, 2=2 (1=trái, 2= Không 3=không Di (1= có, bên) 2=phải) thuận lợi) thối sản) 2=khơng) Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tăng Mất Mất 16q (1= đoạn đoạnGen đoạn có, 1q WT genGen (1= có, (1=nam, Tuổi Mất đoạn 1p 1,2,3,4,5) Giới 2=nữ) Mất đoạn 2=khơng) 2=khơng) TP53 (1= có, 2=khơng) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn