Đề tài phân biệt các loại thịt heo gà trâu bò dê cừu bằng kỹ thuật multiplex pcr

i TÓM TẮT Đề tài “Phân biệt loại thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà kỹ thuật multiplex - PCR” tiến hành Viện Công nghệ Sinh học Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP HCM từ ngày 15/10/2009 đến ngày 1/5/2010 Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình m-PCR phân biệt loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu; ứng dụng quy trình m-PCR để phát loại thịt hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, có xử lý nhiệt mẫu bột thịt thị trường làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc Kết đạt sau: Đã xây dựng quy trình m-PCR phát thịt heo, gà, dê, cừu, bị lẫn trâu Tỷ lệ thích hợp cho primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol Quy trình áp dụng cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt nhiệt độ 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’; 130oC/30’, 180oC/15’ Ảnh hưởng tỷ lệ DNA diện hỗn hợp DNA hỗn hợp thịt lên khả phát m-PCR xác định Đối với hỗn hợp DNA lồi có tỷ lệ nhau, nồng độ DNA thấp mà m-PCR phát gà 0,0001 ng/μl, heo 0,00025 ng/μl, cừu, dê, trâu/&bò 0,0025 ng/μl Còn hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần trâu, bị, dê, cừu, tỷ lệ thấp mà m-PCR phát trâu/&bò, dê 0,1%, cừu 1% Tỷ lệ giống hỗn hợp DNA hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ảnh hưởng đến khả phát m-PCR M-PCR không phát thịt trâu/&bò, dê, cừu với tỷ lệ ≤ 10% hỗn hợp thịt xử lý 130oC/30’ ii SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle, goat, sheep, pig, and chicken by multiplex - PCR technique” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from October 15, 2009 to May 1, 2010 The project was aimed: (i) to build the m-PCR reaction used for differentiation of commercially available meat including lamb, beef and/or buffalo meat, chicken, pork and goat meat; (ii) to apply this reaction in identification of meat species in raw and processed meat mixtures The results were summarized as follows: The optimal m-PCR condition for detection of the meat species was confirmed, in which the proportion of primers for identification of pork, lamb, beef, chicken, goat meat, and buffalo was 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol (FSIM: RG: RCH: RCB: RS: RP), respectively This protocol could be applied to fresh meat and meat that had been processed at 80oC/15; 120oC/15'; 120oC/30 '; 130oC/15'; 130oC/30', and 180oC/15' The effect of the amount of DNA template from different meat species in the reaction was also investigated For DNA mixture involving the six meat species with equal ratio, the lowest concentration for detection of DNA was 0.0001 ng/μl in chicken, 0.00025 ng/μl in pork, 0.0025 ng/μl in lamb, goat, buffalo and/or cattle In the mixture with reduced DNA concentrations from lamb, cattle and goat meat, the lowest rate of DNA that can be detected in was 0.1% in buffalo meat and/or beef, 0,1% in goat meat and 1% in lamb iii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG TÓM TẮT .i SUMMARY ii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi DANH SÁCH SƠ ĐỒ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu 1.3 Mục đích Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược thịt thịt chế biến .3 2.1.1 Giới thiệu sơ lược thịt 2.1.2 Giới thiệu sơ lược thịt chế biến 2.1.3 Tình hình gian lận thị trường thịt giới Việt Nam 2.1.3.1 Tình hình gian lận thị trường thịt tươi thịt chế biến giới 2.1.3.2 Tình hình gian lận thị trường thịt tươi thịt chế biến Việt Nam 2.2 Các phương pháp phát thịt 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein 2.2.1.1 Phương pháp điện di .6 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch 2.2.1.3 Phương pháp sắc ký .9 2.2.2 Phương pháp dựa vào DNA 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR 11 2.3 DNA ty thể gen cytochrome b việc phát loài 21 2.3.1 DNA ty thể 21 2.3.2 Di truyền ty thể .25 2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát nguồn gốc loài sản phẩm thịt chế biến 25 2.4 Tổng quan cơng trình nghiên cứu phát loài thịt phương pháp multiplex PCR .26 Chương .29 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 29 3.2 Nội dung nghiên cứu 29 3.3 Vật liệu .29 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 29 3.3.2 Primer 29 3.3.3 Hóa chất, thiết bị dụng cụ .30 iv 3.4 Phương pháp tiến hành 30 3.4.1 Lấy bảo quản mẫu 30 3.4.2 Tách chiết DNA 31 3.4.3 Xây dựng quy trình m-PCR phát thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò và/hoặc trâu .31 3.4.3.1 Phát loại thịt phản ứng PCR đơn 31 3.4.3.2 Thiết lập tối ưu hóa quy trình m-PCR .32 3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khả phát thịt trâu m-PCRError! Bookmark not 3.4.4 Ứng dụng m-PCR để phát thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà 32 3.4.4.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA phát m-PCR 33 3.4.4.2 Thực m-PCR hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần trâu, bò, dê, cừu 33 3.4.4.3 Thực m-PCR để phát thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .33 3.4.4.4 Thực m-PCR để phát thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 34 3.4.4.5 Thực m-PCR với bột thịt thị trường 34 Chương .37 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .37 4.1 Xây dựng quy trình m-PCR 37 4.1.1 PCR phát loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu 37 4.1.2 Q trình thiết lập tối ưu hóa m-PCR 38 4.1.3 Thí nghiệm xác định khả phát thịt trâu m-PCR 40 4.2 Ứng dụng m-PCR phát thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà .40 4.2.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA lồi phát m-PCR 40 4.2.2 M-PCR hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần trâu, bò, dê, cừu 42 4.2.3 M-PCR phát thịt heo, gà, trâu/&bị, dê, cừu hỗn hợp thịt khơng xử lý nhiệt 43 4.2.4 M-PCR phát thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 44 4.2.4.1 Kết phát thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt độ thời gian 44 4.2.4.2 Kết so sánh m-PCR với thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt nhóm tỷ lệ phối trộn 47 4.2.5 M-PCR với bột thịt thị trường .50 Chương .51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC 63 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSE : bovine spongiform encephalophathy FSIM : forward primer SIM (kí hiệu forward primer chung m-PCR) GC : gas chromatography HPLC : high performance liquid chromatography IEF : isoelectric focusing LC : liquid chromatography LTRs : long terminal repeats m-PCR : multiplex polymerase reaction chain MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine (UUA/G) MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine (UCN) MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide PCR : polymerase chain reaction Prion : proteinaceous infectious particle RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RCh : reverse primer chicken RG : reverse primer goat RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography RP : reverse primer pig RS : reverse primer sheep SSRs : simple sequence repeats vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mơ hình kiểm tra mẫu kỹ thuật lai DNA 10 Hình 2.2: Genome ty thể .24 Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ heo, cừu, bò, gà, dê 37 Hình 4.2: Sản phẩm PCR thịt bò trâu .38 Hình 4.3: Kết m-PCR theo PCR riêng lẻ 39 Hình 4.4: Kết tối ưu m-PCR 39 Hình 4.5: Kết thí nghiệm khẳng định m-PCR phát thịt trâu 40 Hình 4.6: Giới hạn nồng độ DNA phát m-PCR 41 Hình 4.7: Kết m-PCR hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần trâu, bò, dê, cừu 42 Hình 4.8: M-PCR phát thịt heo, gà, bò, dê, cừu hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .43 Hình 4.9: M-PCR phát thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 80oC/15’(M2.1-M2.7) 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 46 Hình 4.10: M-PCR phát thịt heo, gà, trâu/&bị, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 120oC/30’(M4.1-M4.7) 130oC/15’ (M5.1-M5.7) 46 Hình 4.11: M-PCR phát thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 130oC/30’(M6.1-M6.7) 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 46 Hình 4.12: Kết m-PCR với bột thịt thị trường 50 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài thịt 20 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu 36 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) mô loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein chuỗi vận chuyển 21 Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA 23 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR thịt tươi 31 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến phản ứng PCR thịt tươi 32 Bảng 3.3: DNA template thí nghiệm khẳng định m-PCR phát thịt trâu Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu hỗn hợp 33 Bảng 3.5: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt xử lý nhiệt .35 Bảng 4.1: Giới hạn nồng độ DNA phát m-PCR 41 Bảng 4.2: Tỷ lệ thấp trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR phát hỗn hợp thịt xử lý nhiệt độ thời gian 44 Bảng 4.3: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (30:30:10:10:10:10) .47 Bảng 4.4: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (40:40:5:5:5:5) .47 Bảng 4.5: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (48:48:1:1:1:1) .48 Bảng 4.6: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) 48 Bảng 4.7: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) 48 Bảng 4.8: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) 49 Bảng 4.9: Kết so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt thịt xử lý nhiệt tỷ lệ phối trộn (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03) .49 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, nhu cầu lương thực thực phẩm tăng cao việc đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm điều cần thiết Trong đó, sản phẩm có nguồn gốc từ thịt mối quan tâm xã hội Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ hay nhiều loại thịt khác Do đa dạng hình thức, chất lượng giá thành sản phẩm thịt chế biến gây vấn đề gian lận thương mại Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm Đặc biệt, gian lận ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng hay vài lồi thịt lý sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay lý tơn giáo (ví dụ, đạo Hindu khơng ăn thịt bị, đạo Hồi đạo Do Thái không ăn thịt heo) Thịt chế biến thường xử lý nhiệt độ cao 1000C (khoảng 1200C thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…) Đặc biệt bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc xử lý nhiệt độ khoảng 1300C sản xuất từ phụ phế phẩm cơng nghiệp giết mổ heo, trâu, bị, cừu, gà, dê,…nên số mầm bệnh nguy hiểm tồn có khả gây bệnh Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc có khả lây lan sang người Vì lý này, nước giới có Việt Nam khơng cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bị, cừu vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE Vì thế, việc phát triển ứng dụng phương pháp phát xác nhanh chóng loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhu cầu cần thiết thị trường xã hội Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt phương pháp phát dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc trưng cho loài standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.) Các phương pháp phát dựa vào protein chậm ứng dụng cho sản phẩm thịt xử lý nhiệt Do đó, phương pháp dựa vào DNA thường sử dụng đặc biệt phương pháp PCR đặc trưng cho lồi Trong đó, phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP địi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao Còn phương pháp multiplex PCR dễ thực nên sử dụng rộng rãi việc phân biệt loài thịt Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục tiêu thích hợp phân biệt loại thịt xử lý nhiệt 1.2 Mục tiêu - Xây dựng quy trình phát loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu phương pháp multiplex PCR 1.3 Mục đích - Góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại sản phẩm thịt chế biến cho người bột thịt làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc - Ngăn ngừa lan truyền mầm bệnh BSE từ thức ăn gia súc sang loài thú nhai lại người Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược thịt thịt chế biến 2.1.1 Giới thiệu sơ lược thịt Thịt khái niệm dùng để số mơ có giá trị sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ động vật Trong thương mại, thịt gồm có mơ: mơ cơ, mơ mỡ, mơ liên kết, mô xương sụn mô máu Thành phần hóa học thịt bao gồm nước, protein, lipid, glucid, chất trích ly chứa nitơ khơng chứa nitơ, khoáng, vitamin enzym Các thành phần phụ thuộc vào lồi thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, phần nuôi dưỡng, mức độ giai đoạn vỗ béo, phận súc thịt thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004) Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) mô loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) Loại mơ Thịt bị (%) Thịt heo (%) Thịt cừu (%) Mô 57-62 40-62 49-58 Mô mơ 3-16 15-40 4-18 Mô liên kết 9-12 6-8 7-11 Mô xương sụn 17-29 8-18 18-38 Mô máu 0,8-1 0,6-0,8 0,8-1 (Theo Xmolxki, 1975) Tính chất mơ thành phần cấu tạo khác Do đó, tùy theo đặc tính tỉ lệ thành phần cấu tạo loại mơ định tính chất thịt Trong súc thịt, mơ mơ có giá trị dinh dưỡng cao nhất, thấp mô liên kết Mô mỡ có giá trị lượng cao cịn làm cho thịt có vị béo Giá trị thực phẩm thịt đánh giá qua tỉ lệ protein chứa giá trị sinh 51 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã hoàn thiện quy trình m-PCR phát thịt heo, gà, dê, cừu, bị lẫn trâu với tỷ lệ thích hợp primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol Quy trình áp dụng cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’; 130oC/30’, 180oC/15’ Ảnh hưởng tỷ lệ DNA diện hỗn hợp DNA hỗn hợp thịt lên khả phát m-PCR xác định Phân biệt loài thịt sản phẩm thịt chế biến phương pháp multiplex PCR bị ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ, kích thước đoạn DNA mục tiêu 5.2 Đề nghị Tiến hành thí nghiệm m-PCR phát lồi trâu/& bị, dê, cừu với tỷ lệ cao 10% xử lý 130oC/30’ để xác định 130oC/30’ tỷ lệ thấp trâu lẫn bò, dê, cừu mà m-PCR phát Ứng dụng m-PCR để khảo sát thêm nhiều hỗn hợp thịt chế biến nhiều mẫu bột thịt Xây dựng phương pháp để phân biệt xác thịt bị thịt trâu 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Thị Cúc, 2006 Tình hình xuất nhập động vật sản phẩm động vật Cục Thú y Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003 Chế biến thịt Giáo trình học tập trường Đại học Nông Lâm TP HCM Lương Quý Phương, 2006 Sản xuất kit tách chiết DNA kit PCR phát gen halothan heo Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư cơng nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Lưu Phúc Lợi, 2005 Bài giảng Sinh tin học Đại học Nông Lâm TPHCM Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004 Chế biến bảo quản thịt sữa Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, 163 trang Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007 Phân biệt loại thịt heo, bị, cừu phương pháp multiplex PCR Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM TIẾNG NƯỚC NGỒI Alberts B., Bray D., Lewis J., Raf M., Roberts K and Watson J.D.,1994 Molecular Biology of the Cell (3rd ed.), Garland Publishing Inc, New York and London Arslan A., Ilhak O I Calicioglu M., 2006 Effect of method of cooking on dentification of heat processed beef using polymerase chain reaction (PCR) technique Meat Science 72: 326–330 10 Ashoor S H., Monte W G., Stiles P G., 1998 Liquid chromatographic identification of meats Journal of Association of Official Analytical Chemists 71:397–403 11 Behrens M., Untham., Brinkmann Y., Buchholz R., and Latus N.,1999 Identification of Animal Species in Heated and Complex Meat Products Using Species Specific PCR Reactions Fleischwirtsch 79: 97 – 100 53 12 Bellagamba F., Valfre F., Panseri S., & Moretti V M., 2003 Polymerase chain reaction-based analysis to detect terrestrial animal protein in fish meal Journal of Food Protection 66(4): 682–685 13 Beneke B and Hagen M., 1998 Applicability of PCR (Polymerase Chain Reaction) for the Detection of Animal Species in Heated Meat Products Fleischwirts 78: 1016 – 1019 14 Bogenhagen D., Clayton D.A., 1974 The number of mitochondrial deoxyribonucleic acid genomes in mouse L and human HeLa cells Journal of Biological Chemistry 249:7791 15 Borgo R., Souty Grosset C., Bouchon & Gomot D L., 1996 PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA for identification of quail meat species Journal of Food Science 61: 1–4 16 Bossier P., 1999 Authentication of seafood products by DNA pattern Journal Food Science 64:1899–1993 17 Brodmann P D., Moor D., 2003 Sensitive and semi quantitative TaqMan real time polymerase chain reaction systems for the detection of beef (Bos taurus) and the detection of the family mammalia in food and feed Meat Science 65:599–607 18 Brodmann P D., Nicholas G., Schaltenbrand P., Ilg E C., 2001 Identifying unknown game species: experience with nucleotide sequencing of the mitochondrial cytochrome b gene and a subsequent basic local alignment search tool search European Food Research and Technology 212:491– 496 19 Burgener M., Hubner P.,1998 Mitochondrial DNA enrichment for species identification and revolutionary analysis Z Lebensm Unters Forsch 207:261–263 20 Carnegie P R., Illic M Z., Etheridge M.O., Collins M G., 1983 Improved high performance liquid chromatographic method for analysis of histidine dipeptides anserine, camosine and balenine present in fresh meat Journal of Chromatography 261:153–157 21 Chikuni K., Tabata T., Kosugiyama M., Monma M and Saito M., 1994 Polymerase Chain Reaction Assay for Detection of Sheep and Goat Meats Meat Science 37: 337 – 345 54 22 Chow S., Inogue S., 1993 Intra- and Interspecifc Restriction Fragment Length Polymorphism in Mitochondrial Genes of Thun- nus Tuna Species National Research Institute of Far Seas Fisheries 30: 207-224 23 Chung G.S., Lee M H., Kim J M., Park J M., 1998 Differentiation the species of origin of meats on the basis of the contents of histidine dipeptides in muscle Journal of Veterinary Science 40:1–6 24 Collins S.J., Lawson V A Masters C.L., 2004 Transmissible spongiform encephalopathies Lancet 363 (9402): 51–61 25 Colombo F., Viacava R., Giaretti M., 2000 Differentiation of the species ostrich (Struthio camelus) and emu (Dromaius novaehollandiae) by polymerase chain reaction using an ostrich-specific primer pair Meat Science 56:15–17 26 Cushwa W T., Medrano J F., 1996 Applications of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for genetic analysis of livestock species Animal Biotechnology 7:11–31 27 Dalmasso A., Fontanella E., Piatti P., Civera T., Rosati S., Bottero M.T., 2004 A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs Molecular and Cellular Probes 18: 81–87 28 Desmarais E., Lanneluc I., Lagne J., 1998 Direct amplification of length polymorphism (DALP) or how to get and characterize new genetic markers in many species Nucleic Acids Research 26:1458–1465 29 Ellen H., Hans T., Gottfried S., 1964 Deoxyribonucleic Acid Associated with Yeast Mitochondria Biochemical and Biophysical Research Communication 15: 127 - 132 30 Fairbrother K S., Hopwood A J., Lockley A K., Bardsley R G., 1998 Meat speciation by restriction fragment length polymorphism analysis using an actin cDNA probe Meat Science 50:105–114 31 Fairbrother K.S., Hopwood A.J., Lockley A.K and Bardsley R.G., 1998 The Actin Multigene Family and Livestock Speciation Using the Polymerase Chain Reaction Animal Biotechnology 9: 89 – 100 32 Fontaine K.M., Cooley J.R., Simon C., 2007 Evidence for paternal leakage in hybrid periodical cicadas (Hemiptera: Magicicada spp.) PloS one 2(9): e892 55 33 Fukall L., Kas J., 1989 The advantages of immunoassay in food analysis Trends in Analytical Chemistry 8: 112 – 116 34 Guoli Z., Mingguang Z., Zhijiang Z., Hongsheng O., Qiang L., 1999 Establishment and application of a polymerase chain reaction for the identification of beef Meat Science 51:233–236 35 Gyllesten, U B., Wharton, D., Josefsson, A and Wilson, A C., 1991 Paternal inheritance of mitochodrial DNA in mice Nature 352: 255-257 36 Haushi S., Basumatary R., Girish P S., Doley S., Bardoloi R K., Kumar A., 2009 Identification of chicken, duck, pigeon and pig meat by speciesspecific markers of mitochondrial origin Meat science Article in Press 37 Hayashi K., 1996 PCR SSCP Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of PCR Products Laboratory Proto- cols for Mutation Detection (Landegren, U., ed.), Oxford University Press pp 14 – 22 38 Herman L., 2000 Determination of the animal origin of raw food by speciesspecific PCR Journal of Dairy Research 68:429–436 39 Hird H., J., Chisholm A.,Sanchez M., Hernandez R., Goodier K., Schneede C., Boltz and Popping B., 2006 Effect of heat and pressure processing on DNA fragmentation and implications for the detection of meat using a realtime polymerase chain reaction Food Additives and Contaminants 23:645–650 40 Hitchcock C H S., 1998 Immunoassays for veterinary and food analysis Elsevier Applied Science Publishers Ltd., London, New York, p3 41 Hoeh W.R., Blakley K.H., Brown W.M., 1991 Heteroplasmy suggests limited biparental inheritance of Mytilus mitochondrial DNA Science 251:1488– 1490 42 Hofmann K., 1997 Nachweis der Tierart bei Fleisch und Fleischerzeugnissen Mitteilung Fleischwirtschaft 77 (2):151-154 In: Detection of meat of different animal species in meat products P Review of applicable methods Mieso i Wedliny 1998, 3, 74-79 [in Polish] 43 Holland P M., Abramson R D., Watson R., Gelfand D H., 1991 Detection of specific polymerase chain reaction product by utilization the 5_ to 3_ exonuclease activity of Thermus aquaticus Proceedings of the National 56 Academy of Sciences USA 88:7276–7280 44 Hong W., Gao D B., Zhang A H., Pan W Q., Lian, C Z L., 2004 Multiplex Polymerase Chain Reaction Method for Detection of Bovine Materials in Foodstuffs Journal of Association of Official Analytical Chemists International 86(4): 764-767 45 Hopwood A.J., Fairbrother K.S., Lockley A.K and Bardsley R.G., 1999 An Actin Gene-Related Polymerase Chain Reaction (PCR) Test for Identification of Chicken in Meat Mixtures Meat Science 53: 227 – 231 46 Hsieh H.M., Chiang H.L., Tsai L.C., Lai S.Y., Huang N.E., Linacre A., Lee J.C.I., 2001 Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals Forensic Science International 122: 7-18 47 Hsing M H., Chin C T., Li C T., Hsiao L C., Nu E H., Rocky T P S., Adrian L., James C L., 2005 Species identification of meat products using the cytochrome b gene Forensic science Journal 4: 29-36 48 Hui Y H., 2006 Handbook of Food science technology and engineering CRC Press Taylor & Francis Group 49 Irfan O I., 2007 Identification of meat species by polymerase chain reaction (PCR) teachnique Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 31(3): 159-163 50 Irwin D.M., Kocher T.D., Wilson A.C., 1991 Evolution of the cytochrome b gene of mammals Journal of Molecular Evolution 32: 128-44 51 Jain S., Brahmbhait M N., Rank D N., Joshi C G and Solank J V., 2007 Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR assay Indian Journal of Animal Sciences 77 (9): 880-881 52 Kesmen Z., Sahin F., Yetim H., 2007 PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages Meat Science 77: 649–653 53 Kocher T D., Thomas W K., Meyer A., Edwards S V., Paabo S., Villablanca F X., et al., 1989 Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing of conserved primers Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America 86: 6196-200 54 Koh M C., Lim C H., Chua S B., Chew S T., Phang S T W., 1998 Random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprints for identification of red 57 meat animal species Meat Science 48:275–285 55 Kondo R., Matsuura E.T., Chigusa S.I., 1992 Further observation of paternal transmission of Drosophila mitochondrial DNA by PCR selective amplification method Genetical Research 59 (2): 81–4) 56 Kremar P and Rencova E., 2003 Identification of species specific DNA in feedstuffs Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(26): 76557658 57 Lahiff S., Glennon M., Lyng J., Smith T, Shilton N., Maher M., 2002 Real-time polymerase chain reaction detection of bovine DNA in meat and bone meal samples Journal of Food Protection 65:1158–1165 58 Laube L., Spiegelberg A., Butschke A., Zagon J., Schauzu M., Kroh L., Broll H., 2003 Methods for the detection of beef and pork in foods using real-time polymerase chain reaction International Journal of Food Science & Technology 38:111–118 59 Lee J.C.I and Chang J.G., 1994 Random Amplified Poly-morphic DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD PCR) Finger-prints in Forensic Species Identification Forensic Science International 67: 103 – 107 60 Lockley A K., Bardsley R G., 2000 DNA-based methods for food authentication Trends in Food Science & Technology 11: 67 – 77 61 Maede, D., 2006 A strategy for molecular species detection in meat and meat products by PCR-RFLP and DNA sequencing using mitochondrial and chromosomal genetic sequences European Food Research and Technology 224(2): 209–217 62 Martin, I., Garcia T., Fajardo V., Lopez-Calleja I., Hernández P E., Gonzalez I., and Martín R 2007 Species-specific PCR for the identification of ruminant species in feedstuffs Meat Science 75:120–127 63 Martinez I., 1997 DNA typing of fish products for species identification In: Seafood from Product to Consumer: Integrated Approach to Quality J Luten, T Borresen, J Oehlenschlager (eds.) Amsterdam: Elsevier Science 497–506 64 Martinez I., Yman M., 1999 Species identification in meat products by RAPD analysis Food Research International 31:459–466 58 65 Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamad J., Shinmura Y., 1999 A quick and simple method for the identification of meat species cow meat product by PCR assay Meat Science 51: 143-148 66 McPherson M J and Moller S G., 2006 PCR Taylor and Francis Group 67 Meusel M.S., Moritz R.F., 1993 Transfer of paternal mitochondrial DNA during fertilization of honeybee (Apis mellifera L.) eggs Cureent Genetics 24 (6): 539–43) 68 Meyer R., Candrian U and Luethy J., 1994 Detection of Pork in Heated Meat Products by Polymerase Chain Reaction (PCR) Journal AOAC International 77: 617 – 622 69 Meyer R., Hoefelein C., Luethy J., & Candrian U., 1995 Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food Journal of Association of Official Analytical Chemists International 78: 1542–1551 70 Michael A I., David H G., 1990 PCR protocol: A guide to methods and application Academic Press, San Diego, CA p 3-12 71 Michele L., 2003 Food authenticity traceability Woodhead Publishing Limited Abington Hall, Abington Cambridge CB1 6AH England 72 Miguel A R., Teresa G., Isabel G., Luis A., Pablo E H and Rosario M., 2004 PCR identification of beef, sheep, goat and pork in raw and heat treated meat mixtures Journal of Food Protection 67: 172-77 73 Minkiewicz P., Dziuba J., Nałecz D., 2000 Modern methods of separation and research of peptides structure and proteins of food Przem Spo 12: 34-37 74 Montiel-Sosa J.F., Ruiz E., Montoya J., Roncales P., Lopez-Perez M.J., PerezMartos A., 2000 Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA Journal of Agricultural and Food Chemistry 48(7):2829-2832 75 Murray B W., McClymont R A., & Strobeck C., 1995 Forensic identification of ungulate species using restriction fragment digests of PCR amplified mitochondrial DNA Journal of Forensic Science 40: 943–951 76 Nass M.M., Nass S., 1963 Intramitochondrial Fibers with DNA characteristics Journal of Cell Biology 593–629 59 77 Partis L., Croan D., Guo Z., Clark R., Coldham T and Murby J.,2000 Evaluation of a DNA Fingerprinting Method for Determining the Species of Origin of Meats Meat Science 54: 369 – 376 78 Pascoal A., Prado M., Calo P., Cepeda A., & Barros-Velazquez J., 2005 Detection of bovine DNA in raw and heat-processed foodstuffs, commercial foods and specific risk materials by a novel specific polymerase chain reaction method European Food Research and Technology 220(3–4): 444–450 79 Penman & Danny, 2002 Mitochondria can be inherited from both parents NewScientist.com 5/2/2008 80 Pinto A D., Forte V.T., Conversano M.C., Tantillo G.M., 2005 Duplex polymerase chain reaction for detection of pork meat in horse meat fresh sausages from Italian retail sources Food Control 16: 391-394 81 Pyz L R., 1998 Methods of species identification of meat Med Wet 54 (11): 732-736 [in Polish] 82 Rahman A S M., Ahmed M M M., 2007 Rapid and sensitive identification of buffalo’s, cattle’s and sheep’s milk using species-specific PCR and PCR– RFLP techniques Food Control 18:1246–1249 83 Rea S., Chikuni K., Avellini P.,1996 Possibility of using single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis for discriminating European pig and wild boar meat samples Italian Journal of Food Science 3:211– 220 84 Roa K.B.C.A., Bhat V and Totey S.M., 1996 Detection of Species-Specific Genetic Markers in Farm Animals Through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 13: 135 – 138 85 Rodriguez M A., Garcia T., Gonzalez I., Asensio L., Mayoral B., Lopez-Calleja I., Hernandez P E., Martin R., 2003 Identification of goose, mule duck, turkey, and swine in foie grass by species-specific polymerase chain reaction Journal of agriculture and food chemistry 51:1524–1529 86 Saeed T., Ali S G., Rahman H A.A., Sawaya W N., 1989 Detection of pork and lard as adulterants in processed meat: Liquid chromatographic analysis of derivatized triglycerides Journal - Association of Official Analytical 60 Chemists 72:921–925, 1989 87 Saez R., Sanz Y., Toldra F., 2004 PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products Meat Science 66:659–665 88 Sambrook J., Russell W D., 2001 Molecular cloning (A laboratory manual) Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA 89 Sawyer M., Rensen G., Smith W., Yee M., Wong A., Osburn B., Cullor J., 1997 Overcoming RNA inhibition in the fluorescent polymerse chain reaction assay to enhance detection of bovine DNA in cattle feeds Department of Population Health and Reproduction, School of Veterinary Medicine, University of California 90 Sutovsky, P., et al, 1999 Ubiquitin tag for sperm mitochondria Nature 402: 371–372 91 Tajima K., Enishi O., Amari M., Mitsumori M., Kajikawa H., Kurihara M., Yanai S., Matsui H., Yasue H., Mitsuhashi T., Kawashima T., Matsumoto M., 2002 PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 66(10):2247–2250 92 Tartaglia M., Saulle E., Pestalozza S., Morelli L., Antonucci G., Battaglia P., 1998 Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds: A molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials Journal of Food Protection 61:513–518 93 Too H P., 2001 Demystifying the new genetics Molecular aspects of biomedical sciences Biochemistry Department Faculty of medicine National University of Singapore 244 pages 94 Toorop R M., Murch S J., Ball R O., 1997 Development of a rapid and accurate method for separation and quantification of myofibrillar proteins in meat Food Research International 30:619–627 95 Verbeke R., Brabander H D., 1985 Differentiation of meat species in processed meat products through identification of animal fat species Biochemical Identification of Meat Species R L S Patterson (ed.) New York: Elsevier Science Publishing, Inc pp 145–154 96 Wallace R.B., Shaffer J., Murphy R.F., Bonner J., Hirose T., Itakura K., 1979 Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: 61 the effect of single base pair mismatch Nucleic Acids Research 6: 35433557 97 Wayne R.K., Geffen E., Girman D.J., Koepfli K.P., Lau L.M., Marshall C.R., 1997 Molecular systematics of the Canidae Syst Biol 46(4):622-53 98 Weighardt F., 2004 The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms Session 10 “Quantitative PCR for the detection of GMOs” European Commission Joint Research Centre 19 pages 99 Wiesner R.J., Ruegg J.C., Morano I., 1992 Counting target molecules by exponential polymerase chain reaction, copy number of mitochondrial DNA in rat tissues Biochimistry Biophysica Acta 183: 553–559 100 Wolf C., Rentsch J and Huebner P., 1999 PCR-RFLP Analysis of Mitochondrial DNA: A Reliable Method for Species Identification Journal of Agricultural and Food Chemistry 47:1350 – 1355 101 Zouros E., Freeman K R., Ball A O and Pogson G H., 1992 Direct evidence for extensive paternal mitochondrial DNA inheritance in the marine mussel Mytilus Nature 359: 412-414 TRANG WEB 102 http://archive.food.gov.uk 103 http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=182 &Itemid=65 104 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 105 http://align.genome.jp 106 http://www.thuvienkhoahoc.com 107 http://www.mitomap.org/MITOMAP/mitomapgenome 108 Protocol online: http://www.protocol-online.org/prot/Molecular-Biology/PCR/ Multiplex- PCR 109 http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=4227 110 Octavian, 1997 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR 62 (http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/Trblesht.html) 111 http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/download.htm 112 http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/manual.htm 63 PHỤ LỤC KẾT QUẢ M-PCR VỚI CÁC NHÓM TỶ LỆ PHỐI TRỘN Tỷ lệ phát (%) 120 100 80 60 40 20 N1 M2.1 M3.1 M4.1 M5.1 M6.1 M7.1 Không xử 80oC/15' 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' lý nhiệt Nhiệt độ thời gian xử lý (a) Nhóm 1: tỷ lệ phối trộn (30:30:10:10:10:10) Tỷ lệ phát (%) 120 100 80 60 40 20 N2 M2.2 Không xử lý nhiệt 80oC/15' M3.2 M4.2 M5.2 M6.2 M7.2 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' Nhiệt độ thời gian xử lý (b) Nhóm 2: tỷ lệ phối trộn (40:40:5:5:5:5) Tỷ lệ phát (%) 120 100 80 60 40 20 N3 M2.3 Không xử 80oC/15' lý nhiệt M3.3 M4.3 M5.3 M6.3 M7.3 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' Nhiệt độ thời gian xử lý (c) Nhóm 3: tỷ lệ phối trộn (48:48:1:1:1:1) Tỷ lệ phát (%) 64 90 80 70 60 50 40 30 20 10 N4 M2.4 Không xử lý nhiệt 80oC/15' M3.4 M4.4 M5.4 M6.4 M7.4 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' Thời gian nhiệt độ xử lý Tỷ lệ phát (%) (d) Nhóm 4: tỷ lệ phối trộn (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 N5 M2.5 M3.5 M4.5 M5.5 M6.5 M7.5 Không xử 80oC/15' 120oC/15'120oC/30'130oC/15'130oC/30'180oC/15' lý nhiệt Nhiệt độ thời gian xử lý (e) Nhóm 5: tỷ lệ phối trộn (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) Tỷ lệ phát (%) 70 60 50 40 30 20 10 N6 M2.6 M3.6 M4.6 M5.6 M6.6 M7.6 Không xử 80oC/15' 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' lý nhiệt Nhiệt độ thời gian xử lý (f) Nhóm 6: tỷ lệ phối trộn (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) 65 Tỷ lệ phát (%) 70 60 50 40 30 20 10 N7 M2.7 M3.7 M4.7 M5.7 M6.7 M7.7 Không xử 80oC/15' 120oC/15' 120oC/30' 130oC/15' 130oC/30' 180oC/15' lý nhiệt Nhiệt độ thời gian xử lý (g) Nhóm 7: tỷ lệ phối trộn (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03) Biểu đồ: Tỷ lệ phát m-PCR nhóm tỷ lệ phối trộn không xử lý nhiệt xử lý nhiệt (a) Nhóm 1: tỷ lệ phối trộn (30:30:10:10:10:10) (b) Nhóm 2: tỷ lệ phối trộn (40:40:5:5:5:5) (c) Nhóm 3: tỷ lệ phối trộn (48:48:1:1:1:1) (d) Nhóm 4: tỷ lệ phối trộn (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) (e) Nhóm 5: tỷ lệ phối trộn (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) (f) Nhóm 6: tỷ lệ phối trộn (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) (g) Nhóm 7: tỷ lệ phối trộn (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03)