TỔNG QUAN
Tổng quan về măng cụt
1.1.1 Giới thiệu chung về măng cụt
Hình 1.1 Cây và quả măng cụt
Quả Măng cụt (Garcinia mangostana L.) là một loại quả nhiệt đới thuộc họ Bứa (Clusiaceae), chúng được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Indonexia… Thái Lan là quốc gia có sản lượng măng cụt lớn nhất trên thế giới, sản xuất khoảng 3,8 triệu tấn/ năm Ở Việt Nam, măng cụt được trồng chủ yếu tại các tỉnh Đông Nam và châu thổ đồng bằng sông Cửu Long như Tây Ninh, Trà Vinh, Bến Tre ….
Măng cụt trước kia được tiêu thụ chủ yếu dưới dạng trái cây tươi, tuy nhiên hiện nay nhiều sản phẩm nước ép, mứt, kẹo măng cụt được sản xuất rộng rãi hơn Vỏ quả măng cụt chiếm tỉ lệ lớn (khoảng 65% khối lượng quả) và thường sẽ bị bỏ đi – như một loại phế thải [1].
1.1.2 Phân bố và sản lượng ỞViệt Nam, măng cụt được trồng chủ yếu ở các tỉnh thành phía Nam do khí hậu ở đây nóng ấm giúp cây phát triển tốt Theo số liệu thống kê năm 2016, măng cụt được xếp vào loại trái cây đặc sản của quốc gia với diện tích gần 25.000 ha tập trung ở Nam Bộ Trong đó, Bến Tre được mệnh danh "vương quốc măng cụt" với diện tích lên tới 4,2 nghìn ha Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc – FAO, tổng sản lượng măng cụt cùng với xoài và ổi tại Việt Nam năm 2018 là gần 780 nghìn tấn, đem lại nguồn lợi kinh tế to lớn.
Kết quả khảo sát hiện trạng canh tác cây măng cụt ở Đồng Nai năm 2016 cho thấy diện tích trồng măng cụt của tỉnh ước tính khoảng 656 ha Cũng trong năm này, toàn huyện Trà Ôn, Vĩnh Long có khoảng 560 ha trồng măng cụt Năm
2016, diện tích trồng măng cụt của riêng thị xã Thuận An, Bình Dương là 680ha.
Hình 1.2 Vùng phân bố măng cụt chủ yếu tại Việt Nam
Nhận thấy tiềm năng to lớn và nguồn lợi kinh tế mà măng cụt đem lại cho người dân, nhiều tỉnh thành đã đẩy mạnh trồng mới, phát triển các vùng trồng măng cụt Đến 2019, toàn tỉnh Bình Dương đã trồng hơn 1000 ha măng cụt Năm 2021, thành phố Bảo Lộc, Lâm Đồng có khoảng 250 - 300 ha trồng măng cụt, cả trồng xen và trồng thuần, là nguồn cung ứng trái dồi dào Huyện Đạ Huoai – khu vực trồng cây ăn trái chính của Lâm Đồng có khoảng 330 ha đất trồng Huyện Cát Tiên trồng măng cụt với khoảng 80ha đất Một cây măng cụt cho khoảng 100kg trái/1 vụ mùa. Còn theo khảo sát của Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn huyện Cầu Kè – Trà Vinh, toàn huyện có gần 500ha măng cụt cho trái ở độ tuổi từ 8 đến trên 15 năm. Năng suất bình quân măng cụt cho trái đạt 10 - 11 tấn/ha.
Tính đến thời điểm này Tiên Phước – Quảng Nam có 275ha măng cụt (mật độ trồng bình quân 5 cây/sào, quy ra 100 cây/ha) Trong đó, khoảng 50ha đã cho quả Bình quân mỗi vụ, 1 cây dưới 15 năm tuổi thu được 30kg quả, 1 cây từ hơn 15 -
25 năm tuổi đạt năng suất 50kg quả, 1 cây trên 30 năm tuổi cho 100kg quả Tính trung bình, mỗi mùa 1ha măng cụt cho sản lượng 5 - 10 tấn Trên toàn tỉnh QuảngNam có 1000 ha trồng măng cụt, trong đó hơn 60% diện tích đã cho quả.
Có thể thấy rằng, diện tích và sản lượng măng cụt đang ngày càng tăng lên Nguồn nguyên liệu trở nên sẵn có và dồi dào nhưng lại chỉ tập trung ở các tỉnh thành Nam Trung bộ và Nam Bộ Do đó, để thuận tiện trong việc vận chuyển, bảo quản, giữ chất lượng cho vỏ quả, luận văn này hướng đến việc sử dụng nguyên liệu đã được xử lý khô.
Măng cụt là loại cây thân gỗ, lâu năm, có thể cao tới 10 – 15 m, cây phân nhiều nhánh, có nhựa mủ màu vàng Lá đơn, dày, màu lục sẫm, hình bầu dục thuôn dài Hoa lưỡng tính, có lá bắc Quả măng cụt có dạng hình cầu, đường kính quả khoảng 5 - 7 cm với vỏ quả khi chín có màu đỏ tía Khối lượng cả quả trung bình khoảng 60 – 80 gam.
Hình 1.3 Măng cụt và hình ảnh bổ dọc quả
Quả măng cụt được chia làm 2 phần chính là vỏ quả và thịt quả Vỏ quả bao gồm vỏ ngoài mỏng, cứng, sẫm màu và vỏ trong dày, mềm hơn Thịt quả hay ruột quả có màu trắng ngà, vị ngọt thanh, có mùi thơm nhẹ đặc trưng và được chia thành
6 – 8 múi nhỏ Các mũi có kích cỡ khác nhau, có thể bao gồm cả hạt cứng hoặc không.
Cây măng cụt dễ trồng và chăm sóc, có thể sinh trưởng ở nhiều loại đất khác nhau, nơi có điều kiện thoát nước tốt Khí hậu nhiệt đới với nhiệt độ, độ ẩm cao và lượng mưa dồi dào là điều kiện thuận lợi cho cây phát triển mạnh.
Trước đây, mùa măng cụt thường bắt đầu vào khoảng từ tháng 4 đến tháng 6 âm lịch hàng năm Khi đạt độ chín, quả măng cụt có màu đỏ thẫm, tròn đầy, chuẩn vị, ngọt thơm Hiện nay, trên địa bàn các tỉnh thành như Quảng Nam đã xuất hiện các giống cây măng cụt cho sản lượng 2 vụ/ năm Vụ 1, cây ra hoa từ tháng 3
- 4, người dân có thể thu hoạch từ tháng 7-8; cây ra hoa vụ 2 vào khoảng từ tháng
8 – 9, thời điểm tháng 12 đến tháng 01 năm sau sẽ cho trái chín có thể thu hoạch. Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng, thời vụ ra hoa, cho quả tập trung nhất là vụ 2 Cây măng cụt non có thể cho 200 – 300 quả, đến khi cây trưởng thành, lượng quả trung bình mỗi mùa là 500 quả Có cây có thể cho đến 3000 quả trong một vụ mùa.
1.1.4 Đặc điểm của vỏ quả măng cụt
Vỏ quả măng cụt chiếm khoảng 50 – 65% khối lượng quả [2] Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về lợi ích của loại quả này đối với sức khỏe con người cũng như trong công nghệ sản xuất thực phẩm sản xuất thạch, nước ép Với các phương pháp nghiên cứu hiện đại, nhiều công bố cho thấy vỏ quả măng cụt chứa nhiều hợp chất polyphenol có tính chống oxy hóa cao Đặc biệt, các nghiên cứu đã phát hiện được có khoảng 50 loại xanthone – nhiều nhất từ trước đến nay – tồn tại ở quả măng cụt, chiếm đa số ở phần vỏ quả.
Hình 1.4 Vi phẫu vỏ quả măng cụt
Vi phẫu từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì vỏ là 1 lớp tế bào hình chữ nhật đứng, kích thước khá đều với lớp cutin dày Mô mềm đạo 6-7 lớp, tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn, chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai và túi tiết ly bào Mô cứng gồm 12-14 lớp, tế bào hình đa giác góc tròn, vách dày, ống trao đổi rõ, kích thước không đều, xếp thành vòng gần liên tục Mô mềm đạo, tế bào hình đa giác, nhiều túi tiết ly bào, mạch gỗ bị cắt dọc trong vùng mô mềm đạo.
Tổng quan về Polyphenol
Polyphenol nói chung là hợp chất có nguồn gốc thực vật hoặc bán tổng hợp có chứa nhân thơm, có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) Polyphenol được chia làm các nhóm nhỏ bao gồm: flavonoid (chiếm khoảng 60%), axit phenolic, stilbene, lignan và một vài loại polyphenol khác Các nghiên cứu hiện nay cho thấy polyphenol có tác dụng chống lại các gốc tự do hay chống oxi hóa, chống viêm, ổn định huyết áp, tim mạch, giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường type 2, …
Hình 1.5 Một vài nhóm chất Polyphenol điển hình
Trong các loại quả như nho, táo, lê trung bình chứa 200 – 300 mg polyphenol/100g trọng lượng tươi Polyphenol nổi bật trong các loại thực phẩm còn có thể kể đến như là resveratrol trong rượu vang đỏ, curcumin trong củ nghệ,
… Hàm lượng polyphenol được tìm thấy trong lớp ngoài thực vật cao hơn so với lớp bên trong Đặc biệt, trong vỏ quả măng cụt chứa hàm lượng lớn polyphenol, khoảng 474,53 mg GAE/100mL [7] Bên cạnh đó, hàm lượng phenolic trong lớp vỏ cứng bên ngoài của măng cụt có giá trị tổng phenol là 275,99±1,07 mg GAE/g, flavonoid 115,98±0,84 mg EQ/g và tannin 115,4±4,57 mg EAT/g [8].
Phần lớn lượng hợp chất thuộc nhóm polyphenol phân bố trong không bào của tế bào thực vật, lượng ít nằm ở thành tế bào (thể hiện trong hình ảnh dưới đây) Có thể thấy rằng nếu muốn trích ly triệt để, ta cần phá vỡ thành tế bào cũng như phân giải màng không bào của tế bào thực vật.
Hình 1.6 Phân bố của Polyphenol trong tế bào thực vật [9]
Hình 1.7 Một vài chất thuộc nhóm Xanthone
Trong nhóm polyphenol thì xanthone là những chất có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất Xanthone còn là “ứng cử viên tiềm năng” trong việc điều trị chứng liệt rung (parkinson) và chứng mất trí nhớ (alzheimer) [10] Khi chiết xuất hợp chất từ vỏ quả măng cụt bằng dung môi ethanol 75% thu được cặn thành phẩm có tỉ lệ 7,5% khối lượng nguyên liệu khô ban đầu, trong đó xanthone chiếm khoảng 95% cặn tách chiết Bên cạnh đó, kết quả phân tích HPLC cho thấy 71% cao chiết là alpha mangostin [11] Năm 2015, Yoswathana và Eshtiaghi đã nghiên cứu tối ưu quy trình tách chiết xanthone bằng ethanol, kết quả cho thấy sử dụng ethanol 95% thu được lượng xanthone cao nhất, 57,42 mg hợp chất/ 1g vỏ quả khô [12].
Xanthone không có vị, tan trong rượu, ete, chất kiềm, không tan trong nước Tính đến năm 2008, hơn 68 hợp chất nhóm xanthone được tìm thấy và tách chiết từ vỏ măng cụt [6] Nhóm xanthone gồm nhiều hợp chất nổi bật được kể tên và đo hàm lượng theo bảng dưới đây Theo bảng thống kê, α- mangostin là hợp chất thuộc nhóm xanthone có hàm lượng cao nhất.
Bảng 1.2 Hàm lượng của một số chất thuộc nhóm xanthone [13]
Phần vỏ quả Phần thịt quả
STT Tên hợp chất (mg/100g (mg/100g (mg/100g (mg/100g
0,85 0,17 0,88 Để có được bảng thống kê trên, nhóm nghiên cứu do tác giả Wittenauer đứng đầu đã thực hiện tách chiết bằng dung môi methylene chloride Mẫu sau đó được định lượng bằng HPLC – DAD và định danh bằng phương pháp LC-MS. α-mangostin
Năm 1855, α-mangostin đã được tìm thấy trong số các xanthones chính được lấy từ vỏ của quả măng cụt (Schmid, 1855) Hợp chất này có màu vàng nhạt, có thể thu được từ các bộ phận khác của cây, chẳng hạn như nhựa cây khô và vỏ cây Đến thập niên 30 của thế kỉ 20, cấu trúc của hợp chất α-mangostin được xác định và nghiên cứu sâu hơn.
Hình 1.8 Công thức hóa học và alpha mangostin dạng bột
Tên khoa học đầy đủ của hợp chất này là 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8- bis(3-methylbut-2-enyl)xanthen-9-one, khối lượng phân tử là 410,466 g/mol. α– mangostin có tính kị nước lớn, gây ra trở ngại lớn trong việc ứng dụng hoạt chất này Các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có chứa α – mangostin thường yêu cầu hàm lượng cồn và chất hoạt động bề mặt cao để dễ dàng hòa tan α – mangostin. Khi hòa tan α-mangostin trong dung môi thích hợp, dung dịch này sẽ hấp thụ cực đại tại bước sóng 244nm, 317 nm và 352 nm [14] Trong dung môi EtOH, đỉnh hấp thụ cao nhất tại bước sóng 244 nm, giảm dần khi bước sóng tăng Do đó nên lựa chọn bước sóng 244 nm để tính toán đo đạc số liệu. Ứng dụng của α-mangostin
Hợp chất này đã được phát hiện có nhiều hoạt tính sinh học, với tác dụng chống viêm, chống khối u, bảo vệ tim mạch, có hiệu quả trong chữa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ký sinh trùng, chất chống oxy hóa và chống béo phì α – mangostin gần đây đã được sử dụng để thay thế hoặc như một chất bổ trợ cho kháng sinh trong điều trị một số bệnh truyền nhiễm, để giảm các vấn đề phát sinh do lạm dụng kháng sinh [15].
Tannin là các polyphenol đa nguyên tử có vị chát, có tính thuộc da và bị kết tủa khỏi dung dịch bằng protein hoặc các alkaloid Tannin là nhóm hợp chất phổ biến trong thực vật với hàm lượng khác nhau, trong đó khi quả còn xanh có hàm lượng Tannin nhiều hơn khi đã chín Trong vỏ quả măng cụt, hàm lượng tannin được báo cáo chiếm khoảng 14,1 %, propelargonidin và prodelphinidin là hai dạng chủ yếu [16].
Chiết xuất tannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và nó đã được xử dụng làm chất chống oxy hóa thực phẩm Nhờ vào các hoạt tính này, tannin đã được ứng dụng vào trong quá trình tạo tủa với protein, sản xuất rượu vang, bia, làm trong dịch ép,…[17, 18].
Như vậy, có thể thấy polyphenol là nhóm hợp chất có rất nhiều công dụng có lợi cho sức khỏe, có tiềm năng to lớn trong ứng dụng vào thực phẩm, dược phẩm Việc tách và thu nhận polyphenol từ vỏ quả măng cụt chính là tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào và giúp người tiêu dùng được sử dụng hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên, hữu cơ, chứ không phải các hoạt chất được tổng hợp trong các phòng thí nghiệm Đây là xu hướng mà mọi nơi đang hướng đến.
Tổng quan về các phương pháp trích ly
Các phương pháp thu nhận polyphenol hiện nay đa phần là các phương pháp hóa lý ngâm chiết sử dụng dung môi, … và chưa thu nhận được hàm lượng cao hợp chất dẫn đến thất thoát không đáng có Phương pháp trích ly là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình trích ly là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Cơ sở để thực hiện phương pháp này dựa vào sự phân cực của dung môi chiết và hợp chất cần chiết Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong công nghệ tách chất màu tự nhiên từ thực vật [19].
Khi thực hiện phương pháp này cần lưu ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất, có thể kể đến như là chênh lệch nồng độc chất cần thiết ở trong nguyên liệu và dung môi, hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu, ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ và dung môi chiết Phương pháp trích ly được chia thành nhiều loại như trích ly tĩnh (ngâm chiết), trích ly động (phương pháp soxhlet), trích ly sử dụng dung môi siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction), trích ly dưới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction) hay chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent).
1.3.1 Phương pháp trích ly ngâm (ngâm chiết)
Phương pháp trích ly ngâm chiết hay còn gọi là đun cách thủy được tiến hành ở nhiệt độ dưới 100 o C, ở áp suất 1 atm (hay 101.325 Pa), là phương pháp tương đối đơn giản và dễ lắp đặt, gia nhiệt gián tiếp qua nước, tránh hiện tượng quá nhiệt khi đun nóng, hạn chế được hiện tượng cháy chất cần đun Bên cạnh đó, sử dụng nhiệt gián tiếp từ nước sẽ góp phần kiểm soát được nhiệt độ và giảm nhiệt nhanh nếu tăng cao hơn so với nhiệt độ khảo sát Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong công nghệ tách chất màu tự nhiên từ thực vật. Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, dễ dàng thực hiện được với quy mô lớn.
Nhược điểm: tốn dung môi chiết nên không kinh tế
1.3.2 Phương pháp trích ly soxhlet
Phương pháp này được thực hiện trên hệ thống soxhlet như hình 1.9: nguyên liệu xay thô được đặt trực tiếp trong ống (4) hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để dễ lấy bột cây ra khỏi máy Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống (4) để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau (6) Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài số (2), như vậy dung môi sẽ thấm ướt nguyên liệu rồi xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau (6) Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Sử dụng bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống (3) lên cao hơn, rồi theo ống ngưng hơi lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, chảy thẳng xuống ống (4) đang chứa nguyên liệu Dung môi ngấm vào nguyên liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống (4) càng nhiều, mức dung môi lên cao trong ống (4) và đồng thời cũng dâng cao trong ống
(6), vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống (6), dung môi sẽ bị hút về bình cầu (1) lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống
(4) Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình trích ly Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong nguyên liệu Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (8), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kính, nếu thấy không còn vết gì trên kính là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất, lấy dung môi trích ly ra khỏi bình cầu (1), đuổi dung môi, thu được cao chiết.
Hình 1.9 Hệ thống chiết soxhlet Ưu điểm:
- Tiết kiệm dung môi, không phải tốn công lọc và châm dung môi mới
- Không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới như các kỹ thuật khác.
- Chiết kiệt hợp chất trong nguyên
- Kích thước của máy Soxhlet làm giới hạn lượng nguyên liệu cần chiết
- Chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì vậy không thích hợp chiết các hợp chất kém bền nhiệt.
1.3.3 Trích ly sử dụng dung môi siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction) Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại.Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn Ở trạng thái này, chất lỏng có những tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp… Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần Trong phương pháp này, thường dùng
CO2 trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (đôi khi trộn với vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, metanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoit của CO2) do nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoit và an toàn trong vận hành.
1.3.4 Trích ly dưới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction) hay chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent) Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi Nguyên tắc của nó tương tự như phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell) Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40 – 200 o C) Dung môi được bơm vào ống chiết và giữ ở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume) Quá trình được lặp lại vài lần (cycles) Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ (N 2 ).
1.3.5 Phương pháp trích ly có hỗ trợ bởi enzym phân giải
Công nghệ trích ly hỗ trợ bằng các loại enzym công nghiệp giúp đẩy mạnh quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, pectin, … từ đó tăng cường khả năng thu nhận hoạt chất sinh học mong muốn.
Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến mức độ hoạt động của enzym là nhiệt độ ủ, pH môi trường, nồng độ enzym so với nguyên liệu, thời gian ủ, …
Bảng 1.3 Một số loại chế phẩm enzym được quan tâm trong phân giải thực vật
1 Liều lượng khuyên dùng: 0,5 – 0,7 mg enzym / 1g nguyên liệu; pH tối ưu: 5-6; nhiệt độ tối ưu: 45 – 60 o C
Viscozym (arabanase, cellulase, β-glucanase, hemicellulase, và xylanase)
2 Liều lượng khuyên dùng: 0,25 – 0,5 mg enzym (khoảng 200- 400ml dịch) / 1g nguyên liệu; pH tối ưu: 3,5 - 5; nhiệt độ tối ưu: 50 – 55 o C
3 Liều lượng khuyên dùng: 0,5 – 0,7 mg enzym / 1g nguyên liệu; pH tối ưu: 5,3 – 6; nhiệt độ tối ưu: 95 – 100 o C
4 Liều lượng khuyên dùng: 0,25 – 0,5 mg enzym (khoảng 200- 400ml dịch) / 1g nguyên liệu; pH tối ưu: 4,5; nhiệt độ tối ưu: 50 o C
Các chế phẩm enzym kể trên đều là những chế phẩm thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu khả năng phân giải yếu tố thực vật Mỗi loại chế phẩm enzym sẽ tác động, phân giải một chất hay nhóm chất nhất định Vì vậy, hiệu suất của quá trình trích ly chịu ảnh hưởng trực tiếp từ loại chế phẩm sử dụng Đích đến của enzym phải là vị trí nơi có thể giải phóng nhiều polyphenol, tận dụng để thu được nguồn hoạt chất cao nhất Dựa vào bảng thành phần hóa học ở vỏ quả măng cụt (Bảng 1.1), nhận thấy hàm lượng cellulose có giá trị khoảng 42% lượng nguyên liệu, đây là một con số khá lớn Vì vậy, nghiên cứu này muốn hướng tới việc sử dụng enzym Viscozym nhằm làm đứt gãy cấu trúc cellulose, giúp dễ dàng trích ly được lượng Polyphenol nhiều và nhanh nhất.
1.3.6 Phương pháp trích ly có hỗ trợ bởi sóng siêu âm
Trích ly bằng sóng siêu âm được biết đến có nhiều ưu điểm vượt trội như có thể chiết xuất ở nhiệt độ thấp giúp bảo toàn được hoạt tính sinh học của các hoạt chất tự nhiên Công nghệ này cũng làm tăng đáng kể tỷ lệ thu hồi hoạt chất sinh học so với công nghệ truyền thống.
Thực hiện siêu âm mẫu có thể sử dụng bể siêu âm hoặc đầu dò siêu âm.
Bể siêu âm được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng làm sạch, chuẩn bị mẫu phân tích, dung môi sắc ký HPLC tại các phòng các thí nghiệm, phân xưởng sản xuất cơ khí, nhà máy chế tạo ở hầu hết các lĩnh vực Ngoài chức năng siêu âm cơ bản, một vài chức năng như “degas” và “sweep” đem lại hiệu quả cao trong quá trình loại bỏ bớt khí, tạo nhũ tương, hòa tan và đồng hóa mẫu phân tích.
Hiệu suất trích ly các hợp chất khi sử dụng sóng siêu âm tăng lên là nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, làm tăng sự thoát ra của các chất nội bào vào trong dung dịch Công suất siêu âm càng lớn thì hiện tượng xâm thực khí càng mạnh do đó cấu trúc thành tế bào bị phá vỡ nhiều hơn và hiệu quả trích ly chất tăng lên.
Luận văn này mong muốn nghiên cứu ảnh hưởng cúa sóng siêu âm đến quá trình trích ly một vài hợp chất polyphenol trên vỏ quả măng cụt khô.
1.3.7 Một vài nghiên cứu trích ly hợp chất áp dụng công nghệ hỗ trợ bằng enzym và sóng siêu âm
Theo các nghiên cứu, để có thể tăng hiệu suất của quá trình trích ly, nhiều công nghệ được ứng dụng vào để hỗ trợ và nổi bật là sử dụng sóng siêu âm hoặc sử dụng enzym trong bước tiền xử lý nguyên liệu Theo các công bố khoa học, việc kết hợp đồng thời cả hai yếu tố này sẽ càng giúp đạt hiệu quả cao, làm tăng hàm lượng tổng số polyphenol nói riêng, hay từng thành phần như flavonoid, tannins,
Nghiên cứu sản xuất vi hạt nhằm ứng dụng vào ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm
Nổi bật với đặc tính chống oxy hóa cao, các hợp chất thuộc nhóm polyphenol trích ly từ vỏ quả măng cụt được hy vọng sẽ là một chất bảo quản tự nhiên an toàn cho thực phẩm và sức khỏe con người.
Phụ gia thực phẩm là những chất được chủ định đưa vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, có hoặc không có giá trị dinh dưỡng, nhằm giữ hoặc cải thiện đặc tính của thực phẩm (Luật an toàn thực phẩm số 55/2010/QH12).
- Nâng cao tính chất cảm quan thực phẩm
- Tăng mức độ sử dụng an toàn của thực phẩm
- Tăng cơ hội lựa chọn thực phẩm
- Giảm giá thành sản phẩm
Chất bảo quản thực phẩm là những phụ gia thực phẩm, được cố ý cho vào thực phẩm mà với sự hiện diện của nó hoặc dẫn xuất của nó, có khả năng hạn chế, ngăn ngừa sự hư hỏng của thực phẩm Kìm hãm, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản, giúp cho công nghệ chế biến đơn giản hơn (nhiệt độ, thời gian,…). Để có thể ứng dụng dễ dàng vào ngành công nghiệp thực phẩm, nghiên cứu định hướng sản xuất vi hạt mang hợp chất mong muốn nhằm nâng cao tính thích ứng sinh học (dễ dàng hòa tan trong dung môi an toàn, duy trì khả năng giải phóng thuốc,…).
Công nghệ nano cho phép thao tác và sử dụng vật liệu ở tầm phân tử, làm tăng và tạo ra tính chất đặc biệt của vật liệu Trong y sinh học các hạt nano được xem như là các robot nano thâm nhập vào cơ thể giúp con người có thể can thiệp ởqui mô phân tử hay tế bào Hiện nay, con người đã chế tạo ra hạt nano có đặc tính sinh học có thể dùng để hỗ trợ chẩn đoán bệnh, dẫn truyền thuốc, tiêu diệt các tế bào ung thư… Một số tác dụng ưu việt của sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng được ứng dụng công nghệ nano có thể kể đến như là không gây ảnh hưởng đến các mô lành, ít gây tác dụng phụ, khắc phục những nhược điểm của các loại thuốc truyền thống như độ hòa tan, khả năng thẩm thấu, tỉ lệ đào thải,…giúp đem lại hiệu quả chữa trị tối ưu cho người bệnh Bảng 1.4 thống kê các nghiên cứu tạo các vi hạt - hạt nano nhằm các mục đích khác nhau.
Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu tạo vi hạt
STT dạng hạt Vật liệu mang Mục đích Nguồn nano
1 Hạt nano HPC-dioctyl sulfosuccinate 141 Tăng cường độ hòa [26] tinh thể N tan
Nano vàng Au / Carrageenan Giải phóng thuốc
2 (Au) Oligosaccharide điều trị ung thư nhờ [27] tác động của pH
Hạt nano Kiểm soát mức độ
3 PLGA / hyaluronic acid giải phóng hợp chất [28] polyme và đích đến của nó
Dipalmitoyl Nhắm mục tiêu đến phosphatidylcholine (DPPC) và
Hạt các dòng tế bào ung
4 1-oleoyl-2-[12- [29] liposomes biotinyl(aminododecanoyl)]-sn- thư biểu mô tế bàogan glycero-3-phosphocholine
5 Hạt nano Cyclodextrin Tham gia giải [30]
6 Hạt nano Decosanoic acid Duy trì khả năng [31] lipid rắn giải phóng thuốc
Hạt nano Có thể kéo dài thời
7 tiền chất Polymer-surfactant gian vận chuyển [32] bán rắn hợp chất
Hạt nano Fe3O4 (oxit sắt) / tế bào gốc Mục tiêu vận
Kim loại trung mô (MSC) bào ung thư phổi
Hạt nano Cải thiện độ hòa tan
9 chống kết Poloxamer 188 và soluplus và tốc độ hòa tan [34] tinh
Alpha mangostin có tính chất khó tan trong nước, việc chuyển hóa cấu dạng của hoạt chất giúp nó có tính thích ứng sinh học cao học, phù hợp với nhiều mục đích ứng dụng hơn Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu được công bố liên quan đến sản xuất hạt nano mang hợp chất α – mangostin bằng các chất hóa học khác nhau với mục đích giải quyết tình trạng khó hòa tan trong dung môi nước hay kiểm soát con đường vận chuyển, đích đến của hợp chất này. Một vài nghiên cứu được thống kê trong bảng dưới đây:
Bảng 1.5 Bản chất của một số loại vi hạt mang hợp chất α-mangostin
Dạng hạt nano Nguyên liệu sản xuất Nguồn
Chitosan, PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid) [35] Hạt nano polyme Chitosan, alginate và genipin [36] Β-cyclodextrin-chitosan [37]
Các mixen nano PVP (polyvinylpyrrolidone) [38]
(Nanomicelles) MPEG (poly(ethylene glycol) monomethyl [39] ether) và PLA (polylactic acid)
Hạt nano Cholesterol Tween 60, Ethanol [40] liposome Lecithin đậu nành [41]
Hạt nano lipid rắn Tinh dầu hoa oải hương và cetyl palmitate [42]
Hạt nano kim loại Ag (Bạc) [45]
Hạt nano nhũ Captex 200 P, Tween 80, carbopol 90 và silica [46] tương
Từ các thống kê trên nhận thấy việc tạo vi hạt rất được quan tâm, đem lại nhiều lợi ích to lớn, giúp nâng cao giá trị của sản phẩm Nghiên cứu của luận văn này mong muốn hướng đến quá trình chế tạo vi hạt mang hợp chất α – mangostin từ hai nguyên liệu là Chitosan và Carrageenan Đây đều là hai loại vật liệu có khả năng phân hủy sinh học và tính tương thích sinh học cao, cũng như an toàn trong việc sử dụng Chitosan (CS) là sản phẩm deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose Chitin là thành phần chính cùa thành tế bào nấm, xương ngoài của động vật chân đốt như tôm cua, … Carrageenan khi được chiết tách từ loại tảo biển thích hợp là chất bột mịn, màu vàng nâu đến trắng, không mùi và không vị Carrageenan thường được coi là một chất không gây độc và không gây kích ứng khi được sử dụng trong các công thức dược phẩm dùng ngoài đường tiêm Vai trò của chất này là làm tá dược nhũ hóa, tạo gel, ổn định, gây phân tán, kiểm soát giải phóng cũng như làm tăng độ nhớt.
Nghiên cứu sử dụng phương pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate (STPP) có hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực để sản xuất hạt nano chitosan/carrageenan/MGS STPP là tác nhân liên kết ngang trong tạo hạt dạng nano thực phẩm bởi các tính chất như không có độc tính, khá dễ tan, kích thước nhỏ.
1.5 Một số công trình nghiên cứu về trích ly polyphenol từ vỏ quả măng cụt tại Việt Nam và trên thế giới
Trong các đề tài nghiên cứu trước đây trên đã có những kết quả về việc nghiên cứu tách chiết các chất có trong vỏ quả tuy nhiên có thể nhận thấy vẫn chưa có được kết quả đáng kể Nghiên cứu của Chaovanalikit cho các kết quả anthocyanin đã được tìm thấy trong vỏ quả ngoài (179,49mg cyanidin-3-glucoside (Cyn-3-Glu)/100g) trong khi hầu hết các tổng phenolic được tìm thấy trong vỏ quả trong (3.404 mg axit Gallic tương đương (GAE) / 100 g) Sau khi quá trình ép, tổng hàm lượng phenolic và anthocyanin nước măng cụt là khoảng 205,36 mg GAE/100 ml trong khi hàm lượng anthocyanin là khoảng 0,87 mg Cyn3-Glu/100ml Sấy phun cho hàm lượng anthocyanin và tổng phenolic chiết xuất từ bột măng cụt tốt hơn so với sấy chân không Cùng với đó dịch chiết được xử lý bằng hai phương pháp bay hơi có và không có enzym pectinase, kết quả cho thấy sấy chân không cho chất lượng anthocyanin tốt hơn so với sấy đối lưu Việc bổ sung enzym có thể làm giảm màu polymer và tăng tổng phenolics có trong nước măng cụt [47] Tỉ lệ 2% axit axetic trong ethanol 95% sẽ giúp trích ly được anthocyanin với hàm lượng cao nhất [48] Các nghiên cứu cũng đã tìm thấy được điều kiện tối ưu hóa quá trình tách chiết tannin với kích thước nguyên liệu 20/30 mesh pha trong nước: ethanol 95% (1:1) là ở 80 o C, 2 giờ, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:10 Ở điều kiện này sẽ cho hàm lượng Tannin thu được là 11,14% tổng khối lượng [17].
Bảng 1.6 Một số kết quả nghiên cứu về hiệu suất trích ly polyphenol từ vỏ quả măng cụt thu nhận từ Cần Thơ, Việt Nam [4]
Phương Nguyên liệu Vỏ quả tươi Vỏ quả khô pháp
Trích ly Trích ly bằng EtOH - - bằng dung 75 o môi Trích ly bằng EtOH - HS: 73,25±0,59%
Trích ly bằng Hàm lượng -
Acetonitrile 90%, bổ Polyphenol: sung 1% HCl 19,25% CK
EAE Trích ly có hỗ trợ bởi - -
Assisted Trích ly có hỗ trợ bởi - HL: 20,00% CK
Extraction) enzym Pectinex HS: 91,3 % Điều kiện xử lý enzym: ủ với 5% enzym so với lượng nguyên liệu, tại pH 5; ở 60 o C trong 30 phút. Điều kiện trích ly: Etanol 45%, 60 o C,
Trích ly có hỗ trợ bởi - HL: 20,40% CK enzym Termamyl HS: 94,07 % Điều kiện xử lý enzym: ủ với 5% enzym so với lượng nguyên liệu, tại pH 5; ở 60 o C trong 30 phút. Điều kiện trích ly: Etanol 45%, 60 o C,
UAE Trích ly có hỗ trợ bởi - -
E-UAE Trích ly kết hợp giữa - - sống siêu âm và từng loại enzym
Hai yếu tố hỗ trợ bằng enzym và sóng siêu âm là hai yếu tố dễ dàng thực hiện, chi phí thấp, hiệu quả cao Nguồn nguyên liệu được thu mua từ các chợ đầu mối lớn, các xí nghiệp sản xuất thực phẩm từ măng cụt, hay mua tại vườn từ những quả bị hỏng, không đảm bảo để tiêu thụ … sau đó sẽ được tiền xử lý loại bỏ nước giúp đảm bảo bảo quản nguyên liệu tốt hơn.
Từ các cơ sở khoa học trên, đề tài “ Nghiên cứu quy trình trích ly một số hợp chất Polyphenol trong vỏ quả Măng cụt khô (Garcinia mangostana L ) định hướng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ” được triển khai để áp dụng các kỹ thuật hiện đại như siêu âm, xúc tác enzym nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận polyphenol Trong đó, đề tài tập trung nghiên cứu vỏ quả khô do khả năng có thể bảo quản lâu dài, sử dụng mọi thời điểm trong năm mà không phụ thuộc vào mùa vụ của nông sản.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là vỏ quả măng cụt Lâm Đồng, thu hoạch vụ 2019-2020 ở độ chín ăn được, vỏ màu tím đậm, phần vỏ sau khi tách được thái lát mỏng, làm khô tới độ ẩm < 12%, nghiền nhỏ tới đường kính hạt < 1mm và bảo quản trong túi PE hút chân không ở -21 o C cho tới khi sử dụng.
Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Bột vỏ khô sử dụng trực tiếp cho thí nghiệm, bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời.
2.1.2 Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Xuất xứ Ghi chú
1 Ethanol Wako Nhật Bản Độ tinh khiết 99%
2 Chế phẩm enzym Sigma Aldrich Hoạt độ
6 Acetic acid Trung Quốc Độ tinh khiết 99%
7 Acid clohydric Wako Nhật Bản Nồng độ 35 - 37%
- Thiết bị cân phân tích, độ chính xác 0,0001g;
- Máy đo quang phổ UV-Visible;
- Bể siêu âm, đầu dò siêu âm;
- Máy khuấy từ gia nhiệt;
- Kính hiển vi điện tử quét FE-SEM
- Một số thiết bị dụng cụ khác, …
Hình 2.2 Một số thiết bị dùng trong thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu, phân tích
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu khảo sát nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô
Tiến hành khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số và một số hợp chất polyphenol quan trọng trong vỏ quả măng cụt khô (tannin, α – mangostin) Trích ly triệt để để thu hồi toàn bộ lượng hợp chất có trong vỏ quả.
Quy trình trích ly cơ bản dựa theo các nghiên cứu đã công bố trước đó: Thực hiện phương pháp trích ly rắn - lỏng với dung môi ethanol 60%, bổ sung
1% HCl, nhiệt độ trích ly là 60 o C Dịch chiết sau khi thu hồi đem đi phân tích, xác định hàm lượng các hợp chất nghiên cứu.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình trích ly polyphenol
Thực hiện nghiên cứu theo sơ đồ bố trí thí nghiệm dưới đây:
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình trích ly polyphenol có hỗ trợ xúc tác enzym
2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ dịch enzym/ nguyên liệu khô trong quá trình xử lý nguyên liệu với enzym
Tiến hành khảo sát về tỉ lệ dung môi chứa enzym/ nguyên liệu khô bởi khả năng xúc tác giữa các cấu tử enzym trong dung môi với nguyên liệu phụ thuộc khá nhiều ở sự phân bố trong hỗn hợp ủ Nếu dùng quá ít hoặc quá nhiều dung môi chứa enzym, có thể xuất hiện những phần nguyên liệu khô quá đặc hay quá loãng và không thể tương tác với tác nhân phân giải.
Enzym được xác định hàm lượng và pha loãng vào dung dịch nước cất có điều chỉnh pH bằng HCl, từ đây gọi là dịch enzym.
Bảng 2.2 Xác định tỉ lệ ml dịch enzym/ g nguyên liệu
Nghiệm Yếu tố thay đổi
(Tỉ lệ (ml) dịch enzym : (g) Yếu tố cố định thức nguyên liệu)
1 1:1 - Liều lượng enzym: 1 mg chế phẩm enzym/ 1g nguyên liệu
- Thời gian xử lý nguyên liệu với enzym: 30 phút
Dịch chiết sau khi thu được sẽ được phân tích đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong đó (xác định hàm lượng polyphenol tổng số và hàm lượng α – mangostin).
Xác định hiệu suất trích ly hợp chất bằng công thức:
Wt: Hàm lượng hợp chất thu được (%CK)
Wmẫu: Tổng hàm lượng hợp chất có trong mẫu nguyên liệu ban đầu (%CK)
Thống kê, ghi nhận lại kết quả và lựa chọn ra tỉ lệ phù hợp mà ở đó hiệu suất trích ly polyphenol và α – mangostin cao nhất.
2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường dung môi Hoạt độ của enzym phân giải chịu ảnh hưởng lớn từ pH môi trường dung môi Tiến hành xác định pH phù hợp để hàm lượng hoạt chất thu được là cao nhất.
Bảng 2.3 Xác định chỉ số pH tối ưu cho quá trình xử lý enzym
Nghiệm Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định thức (pH dung môi)
1 4 - Tỷ lệ dịch enzym/nguyên liệu: theo tỷ lệ đã chọn trong nghiên cứu trước (mục 2.2.3.1)
- Liều lượng enzym: 1 mg chế phẩm enzym/ 1g
- Thời gian xử lý nguyên liệu với enzym: 30
Thống kê số liệu và chọn chỉ số pH dung môi đệm tương ứng với kết quả hiệu suất trích ly mong muốn.
2.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xử lý nguyên liệu với enzym
Enzym hoạt động tốt ở những khoảng nhiệt độ khác nhau tùy thuộc vào nguyên liệu và tình hình thí nghiệm thực tế Tiến hành thử nghiệm các mốc nhiệt độ lần lượt là 40 50, 60 o C.
Bảng 2.4 Xác định nhiệt độ phù hợp cho quá trình xử lý enzym
Nghiệm Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định thức (Nhiệt độ)
1 40 o C - Tỷ lệ dịch enzym/ nguyên liệu: theo tỷ lệ đã chọn trong nghiên cứu trên (mục 2.2.3.1)
- pH dịch đệm: theo pH đã chọn trong
- Liều lượng enzym: 1 mg chế phẩm enzym/ 1g nguyên liệu
- Thời gian xử lý nguyên liệu với enzym:
Thống kê số liệu và chọn nhiệt độ ủ phù hợp.
2.2.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý nguyên liệu với enzym
Thời gian xử lý nguyên liệu với enzym càng lâu thì khả năng phân giải của enzym càng tăng Tuy nhiên, thời gian xử lý quá dài cũng có thể dẫn đến việc phân cắt quá mức các nguyên liệu hay thậm chí ảnh hưởng đến cả hoạt chất đích mong muốn Từ đó khiến cho dịch thu được lẫn tạp chất, không đạt hiệu quả như mong đợi Các mốc thời gian được nghiên cứu là 20, 30, 40 phút.
Bảng 2.5 Xác định thời gian phù hợp cho quá trình xử lý enzym
Nghiệm Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định thức (Thời gian)
- Tỷ lệ dịch enzym/ nguyên liệu: theo tỷ lệ đã
1 20 phút chọn trong nghiên cứu trên (mục 2.2.3.1)
- pH dịch đệm: theo pH đã chọn trong nghiên cứu trên (mục 2.2.3.2)
- Nhiệt độ: theo nhiệt độ đã chọn trong nghiên
- Liều ượng enzym: 1 mg chế phẩm enzym/ 1g nguyên liệu
Thống kê số liệu và chọn khoảng thời gian phù hợp.
2.2.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng enzym
Liều lượng sử dụng enzym trong một thí nghiệm cần đạt được hiệu quả tốt nhất nhưng cũng phải đáp ứng tiêu chi phí tiết kiệm, vừa đủ nhu cầu Tiến hành thử với các liều lượng lần lượt là 0,033; 0,1; 1; 3; 5; 10 mg enzym/ g nguyên liệu.
Bảng 2.6 Xác định hàm lượng enzym phù hợp cho quá trình xử lý nguyên liệu vớ i enzym
Nghiệm Yếu tố thay đổi
(mg chế phẩm enzym/ g Yếu tố cố định thức nguyên liệu)
1 0,033 - Tỷ lệ dịch enzym/ nguyên liệu: theo tỷ lệ đã chọn trong nghiên
- pH dịch đệm: theo pH đã chọn trong nghiên cứu trên (mục
- Nhiệt độ: theo nhiệt độ đã chọn
4 3 trong nghiên cứu trên (mục
- Thời gian xử lý nguyên liệu với
5 5 enzym: theo thời gian đã chọn trong nghiên cứu trên (mục
Thống kê, đánh giá số liệu thu được, lựa chọn liều lượng enzym tối ưu nhất.
2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình trích polyphenol có hỗ trợ bởi sóng siêu âm
2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ siêu âm và thời gian
Xây dựng quy trình tách chiết có hỗ trợ bởi sóng siêu âm với sự thay đổi của chế độ siêu âm Quan sát hai chế độ khác nhau là chế độ Sonic và Degas.
Các yếu tố ảnh hưởng được thực hiện theo các yếu tố cố định:
- Nhiệt độ trích ly: 50 độ C
- Thời gian siêu âm: xét 6 mốc thời gian siêu âm từ 5 – 30 phút (mỗi mốc cách nhau 5 phút)
-Tỷ lệ (ml) dung môi/ (g) nguyên liệu: 20:1
Quy trình: siêu âm các mẫu theo thời gian → ủ thêm đến khi đủ 30 phút
→ lọc thu dịch chiết → ủ bã thêm 2 lần, mỗi lần 30 phút (không siêu âm) → lọc thu dịch chiết.
Việc thực hiện thời gian trích ly đồng đều trong 30 phút đầu tiên giúp đảm bảo đánh giá đúng ảnh hưởng của yếu tố siêu âm chứ không phải do yếu tố thời gian tiếp xúc dung môi trích ly.
Phân tích, tính toán hàm lượng hợp chất có trong dịch chiết Dựa vào kết quả để lựa chọn ra chế độ siêu âm cho hiệu suất trích ly hợp chất cao hơn.
2.2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết, lọc dịch Thực hiện theo chế độ đã lựa chọn ở mục 2.2.4.1
Quy trình: siêu âm các mẫu theo thời gian → ủ thêm đến khi đủ 30 phút → lọc thu dịch chiết → ủ bã thêm 3 lần, mỗi lần 30 phút (không siêu âm) → lọc thu dịch chiết giữa các lần.
Dịch lọc thu được đem đo hàm lượng hoạt chất, tính hiệu suất từng lần thu dịch theo tổng số hàm lượng hoạt chất tương ứng Mục tiêu của nghiên cứu là lựa chọn ra con số lần chiết phù hợp để không chỉ đảm bảo hiệu suất trích ly cao, mà còn giúp rút ngắn thời gian trích ly và giảm lượng dung môi chiết.
2.2.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly có hỗ trợ bởi sóng siêu âm
Thực hiện nghiên cứu theo chế độ đã lựa chọn ở mục 2.2.4.1, số lần thu hồi dịch trích ly thực hiện theo kết quả mục 2.2.4.2
Xét khoảng nhiệt độ thích hợp nhất, thu được nhiều hàm lượng chất nhất.
Các khoảng nhiệt độ xét đến là 40 o C, 50 o C, 60 o C.
Phân tích đánh giá các chiết xuất thu được sau trích ly Polyphenol
2.3.1 Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo TCVN 9745-1:2013
Chuẩn bị dịch chiết mẫu: 0,5g mẫu măng cụt được đồng nhất trong 5ml methanol 60% (bổ sung 1% HCl) , đặt ở bình ổn nhiệt 60°C, chiết trong 5-10 phút. Để nguội, votex, ly tâm và gạn cẩn thận, thu dịch chiết Lặp lại các bước chiết thêm
1 lần, phối trộn các dịch chiết, thêm dung môi methanol 60% cho đến 10mL và trộn đều.
Xác định hàm lượng polyphenol: Tiến hành pha loãng dung dịch (dùng pipet chuyển 1,0 ml dịch chiết vào bình định mức 100ml Pha loãng đến vạch định mức, trộn đều) Hút 1ml dung dịch chiết mẫu đã pha loãng, thêm 5ml dung dịch Folin-Ciocalteu 10%, sau vài phút thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7,5% (phần trăm khối lượng) và lắc đều Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 60 phút Đo độ hấp thu quang học với nước ở bước sóng 765nm. Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch gallic acid cú nồng độ (0, 10, 20, 30, 40 50 àg/ml).
Hàm lượng polyphenol, được xác định dựa trên đường chuẩn acid gallic và được biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô mẫu được tính bằng công thức:
(D mẫu - D giao điểm) x Vmẫu x d x 100 w T = S chuẩn x m mẫu x 10 000 x w DM,mẫu
Trong đó: wT: Hàm lượng polyphenol (%)
D mẫu : Mật độ quang thu được đối với dung dịch mẫu thử
Dgiao điểm: Mật độ quang tại điểm đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất cắt trục y
(%) Độ dốc thu được từ hiệu chuẩn tuyến tính phù hợp nhất Khối lượng của phần mẫu thử (g) Thể tích của dịch chiết mẫu (ml)
Hệ số pha loãng được dùng trước khi xác định phép đo màu Hàm lượng chất khô của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng
2.3.2 Xác định hàm lượng tannin bằng phương pháp Lowenthal (TCVN458-2001)
Chuẩn bị dịch chiết: Cho 5g mẫu và 50mL nước sôi vào bình tam giác 250mL Đun cách thủy, vừa đun sôi trong 30 phút Thu dịch lọc và tiếp tục chiết vài lần cho đến khi không còn phản ứng định tính Để nguội và chuyển vào bình định mức 250mL và định mức đến vạch Lắc đều.
Lấy 5mL dịch lọc mẫu, 5mL thuốc thử sufoindigocamin, 150mL nước cất vào bình tam giác 250mL Khuấy đều, tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch KMnO40,1N vừa nhỏ vừa lắc đều cho đến khi xuất hiện màu vàng kim thì dừng lại.
Song song tiến hành với mẫu đối chứng, thay dịch lọc mẫu bằng nước cất.
Trong đó: k: Hệ số tính toán tanin tương ứng với 1ml KMnO 4 0,1N (k 0,005825) M: Là hệ số hiệu chỉnh nồng độ của KMnO4 0,1N (M = 1) V: Tổng thể tích dịch pha chế (100ml). v: Thể tích dung dịch đem chuẩn độ (10ml) a: Lượng KMnO 4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng b: Lượng KMnO 4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm. m: Là khối lượng mẫu đem đi làm thí nghiệm
2.3.3 Xác định hàm lượng alpha-mangostin
Pha loãng dịch chiết theo tỉ lệ nhất định trong dung môi EtOH 60%, lắc đều để tan hoàn toàn lượng alpha-mangostin Tiến hành đo quang phổ UV-Vis tại vùng bước sóng khoảng từ 200 – 400 nm.
Trong dải sóng này, có thể ghi nhận các đỉnh đặc trưng của hợp chất alpha-mangostin tại bước sóng 244nm, 318nm.
Nghiên cứu tạo ra vi hạt polyme chứa hợp chất mong muốn nhằm tăng tiềm năng ứng dụng trong công nghệ dược phẩm, thực phẩm
2.4.1 Phân lập hoạt chất alpha – mangostin
Dựa theo bài báo ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết Ethylacetate từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana)’’ đăng trên Tạp chí phân tích Hóa, Lý và
Sinh học năm 2021 để xây dựng quy trình tách chiết hoạt chất alpha mangostin.
Tiến hành thí nghiệm: Cô quay chân không phần dịch chiết để thu được cao tổng Phân bố cao tổng lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần : hexane, EtOAc và butanol Tiếp tục loại bỏ các dung môi để thu được các cao tương ứng Tiến hành phương pháp sắc ký cột silica gel và rửa giải bằng hỗn hợp dung môi thích hợp Sản phẩm thu được là hợp chất cần tìm.
Cấu trúc hợp chất sẽ được xác định kiểm tra lại khi phân tích phổ MS; 1D-2D-NMR.
2.4.2 Chế tạo vi hạt tổ hợp giữa polyme tự nhiên với chiết xuất α – mangostin a Cơ sở phương pháp
Cấu trúc của hạt α – mangostin khá lớn và tồn tại vài nhược điểm như khó tan trong nước, khó hấp thu vào máu và tế bào, nếu có thì nồng độ hấp thu khá thấp Do đó, việc nghiên cứu bào chế hạt α – mangostin dạng nano được hướng đến để có thể tăng hiệu quả hấp thu hoạt chất vào cơ thể Không chỉ vậy, hoạt chất dạng nano bảo quản tốt hơn, không bị chuyển hóa thành chất khác và không bị đào thải ra ngoài. b Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch hòa tan carrageenan: cân 50 mg carrageenan vào cốc đong, bổ sung 100 ml nước cất Khuấy từ và gia nhiệt dung dịch ở 80 o C trong 15 phút Làm nguội dung dịch về 50 o C, bổ sung 5 mg KCl hòa tan trong 5 ml nước cất vào cốc đong Hỗn hợp dung dịch tiếp tục được khuấy từ trong 15 phút.
Chuẩn bị dung dịch chitosan: thêm 100 mg chitosan vào 100 ml dung dịch axit acetic 1%, khuấy từ trong tối thiểu 30 phút để hòa tan hoàn toàn chitosan.
Khi nhiệt độ dung dịch carrageenan xuống dưới 40 o C, nhỏ từ từ dung dịch chitosan vào cốc đựng, đồng thời sử dụng đầu dò siêu âm với tốc độ 10000 vòng/ phút tiến hành tác động sóng cao tần vào hỗn hợp dung dịch Sóng siêu âm giúp phá vỡ các cấu trúc liên kết cơ bản và phân bố đồng đều các phân tử carrageenan với chitosan Các hạt nano sau khi hình thành sẽ mang theo thành phần MGS thông qua việc bổ sung từ từ dịch lỏng MGS (pha loãng một lượng MGS theo tính toán (Bảng 2.7) vào trong 20 ml ethanol) Tiếp tục thêm nhỏ giọt dung dịch STPP (20 mg STPP hòa tan trong 2 ml nước cất) vào hỗn hợp trong cốc đong STPP giúp tạo ra polyme liên kết chéo, từ đó hình thành các hạt nano mang bản chất carrageenan
– chitosan Hỗn hợp được duy trì khuấy bằng đầu dò siêu âm trong 5 phút để thu được dung dịch đồng nhất. Ủlạnh hỗn hợp bằng nước đá trong vòng 2 giờ, ly tâm thu cặn ở tốc độ 6000 vòng/ phút Phần cặn này chính là các hạt MGS dạng nano hay CCG (carrageenan/ chitosan/ α–mangostin) Tiếp tục tiến hành quá trình đông khô và nghiền để thu được dạng bột khô Bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời.
Bảng 2.7 Công thức thành phần hàm lượng (gam) hóa chất có trong vi hạt
CCG0 CCG5 CCG10 CCG15 CCG20
STPP 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 α–mangostin 0 0,008 0,016 0.024 0,032 c Phương pháp phân tích
Hình thái và sự phân bố của các vi hạt CCG được xác định và quan sát bởi kính hiển vi điện tử quét phân giải cao FESEM và kỹ thuật tán xạ ánh sáng động DLS.
2.4.3 Phương pháp phân tích vi sinh a Tiến hành thí nghiệm
Nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn, vi nấm xuất hiện phổ biến trong đời sống hằng ngày, ảnh hưởng phần nào đến sức khỏe: Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Candida albicans.
Tiến hành khởi động các chủng vi sinh vật với lượng vi khuẩn đạt 5 x 10 5
CFU/ml, nồng độ nấm đạt 1 x 10 3 CFU/ml Cùng với đó, chất phân tích được hòa tan trong 100% DMSO, sau đó pha loãng theo các hệ số thích hợp bằng nước cất.
Mỗi giếng trên đĩa nuôi cấy tế bào được thêm vào 10 μl chất phân tích và
190 μl dịch vi sinh vật Nuôi trong tủ ấm 37 o C trong 16 –
Các kết quả thu được IC 50 (nồng độ chất ức chế 50%), MIC (nồng độ chất ức chế tối thiểu), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) và MFC (nồng độ diệt nấm tối thiểu).
Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ mẫu thấp nhất đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
IC50 được tính toán thông qua tỷ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật bằng phần mềm Rawdata:
Trong đó: Hc và Lc tương ứng là mẫu ở nồng độ cao nhất và thấp nhất; Hi và Li tương ứng là % ức chế ở nồng độ cao nhất và nồng độ thấp nhất.
2.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa a Cơ sở phương pháp Áp dụng phương pháp xác định hoạt độ các chất chống oxy hóa của các loại thực phẩm bằng phản ứng với 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) gốc bền.
Các gốc DPPH tự do có độ hấp thụ cực đại mạnh tại bước sóng 517 nm và có màu đỏ tía Quá trình chuyển màu đỏ tía sang vàng tương ứng với độ hấp thụ mol phõn tử gốc DPPH tại bước súng 517 nm giảm từ 9660 àM -1 cm -1 xuống 1640 àM -1 cm -1 khi electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro (tương đương hydrua) để tạo thành DPPH-H khử Kết quả sự khử màu tỷ lệ đối với lượng hydrua tương đương được giữ lại.
Trolox là một chất tương tự vitamin E được sử dụng làm chất chuẩn đối chứng Hoạt độ chống oxy hóa của mẫu được biểu thị bằng số micromol đương lượng Trolox (TE) trên 100 g mẫu. b Tiến hành thí nghiệm
Mẫu được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha loãng trong ethanol 96% Lấy thuốc thử hòa cùng mẫu thử theo tỉ lệ thích hợp, lắc đều, giữ ở 37 o C trong 30 phút, tránh ánh sáng Đo kết quả với bước sóng λ 515 nm. c Tính toán kết quả
Khả năng quét gốc tự do DPPH (%) = ẫ − × 100% ẫ đố ℎứ