PAGE 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân tộc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng[.]
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân tộc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh dẫn đến ngộ độc cấp tính, ngộ độc mạn tính, bệnh truyền qua thực phẩm Chất độc tính lũy thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả lao động, gây bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa gây ung thư Khơng thế, cịn ảnh hưởng đến phát triển kinh tế, xã hội, an ninh trị quan hệ quốc tế [13] Theo thống kê Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại nước phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thường gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22] Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu, theo ước tính Y tế, riêng năm 2001 cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Từ năm 2001-2006, nước ghi nhận 5600000 ca tiêu chảy ngộ độc thực phẩm, có 84 ca tử vong Riêng tháng đầu năm ngoái ghi nhận 750.000 ca tiêu chảy có 12 ca tử vong Thực tế theo chuyên gia phải gấp 10 lần số công bố [10].[20] Các bệnh liên quan đến thực phẩm mối nguy tác động đến sức khoẻ người giới (Wood CS 1983) Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em quốc gia phát triển cho khách du lịch đến vựng cú dịch lưu hành Thực phẩm nước bị ô nhiễm phương tiện lây truyền chủ yếu loại vi khuẩn Các mẫu xét nghiệm thực phẩm nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC vựng cú dịch lưu hành (Black CS, 1981,1982; Ryder CS, 1976) Nhiễm trùng ETEC thường xảy vào mùa nóng, ẩm ướt điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển thực phẩm nước ETEC có khả sinh độc tố chịu nhiệt ST độc tố không chịu nhiệt LT Độc tố không chịu nhiờt cú cấu trúc chức độc tố tả (cholerae toxin) Vì người bị nhiễm độc tố bị tiêu chảy cấp tính với mức độ nước trầm trọng Trên giới nhiều nhà khoa học nhiờn cứu sản xuất thành cơng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT ETEC sử dụng protein tái tổ hợp để thiết kế sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây bệnh kỹ thuật ELSA latex thu kết tốt (Cryan B,1990; Oto CS,1983) Nguyên lý kỹ thuật sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT sau sử dụng kháng thể để phát độc tố LT ETEC Tuy nhiên giá thành sản phẩm cao chưa đáp ứng với điều kiện kinh tế nước ta Ở Việt Nam, chi phí điều trị cho bệnh liên quan đến thực phẩm nguyên vi khuẩn gây nên đắt Tuy nhiên chưa có thống kê rõ ràng nguyên gây vụ ngộ độc thực phẩm nên khó phịng chống Với điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam thiếu hiểu biết vệ sinh an toàn thực phẩm người dân nên ngộ độc thực phẩm ETEC chiếm tỷ lệ không nhỏ Phương pháp nuôi cấy phát ETEC thực phẩm mà phải phát có mặt độc tố ETEC thực phẩm kỹ thuật ELISA hay latex nhằm phát gen mã hóa độc tố chủng ETEC thực phẩm Cho đến có nghiên cứu Việt Nam tác giả Nguyễn Thị Thanh Yến CS năn 2005 viện dinh dưỡng ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát khả sinh độc tố LT E coli mẫu thực phẩm Tuy nhiên kỹ thuật giá thành cao phức tạp khó áp dụng cho phong xét nghiệm thực phẩm tuyến tỉnh Xuất phát từ thực tiễn chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC quy mô phũng thớ nghiệm” Đây tiền đề quan trọng cho nghiên cứu nhằm mục đích sản xuất sinh phẩm immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) E.coli sinh độc tố số nhóm thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB biến nạp vào tế bào khả biến DH5αα Biểu tinh Protein EltB tế bào vi khuẩn E.coli để sản xuất kháng thể kháng LT quy mơ phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1.Tỡnh hình vệ sinh an toàn thực phẩm 1.1.1.Trên giới Theo thống kê Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm khơng an tồn [26] Tại nước phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thường gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22] Tại Úc, ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm Ở Mỹ hàng năm ước đốn có khoảng đến triệu người bị mắc bệnh nguyên nhân ăn uống 9000 trường hợp tử vong [12].[48] Một nghiên cứu khác bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh New-York Mỹ, phát có gia tăng gấp lần từ 1980 đến 1990 [6] Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm virus viêm gan A làm tử vong người Năm 1999 xảy 591 vụ ngộ độc thực phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người Nguyên nhân thực phẩm bị nhiễm VSV 8.505 trường hợp, hóa chất 9.506 trường hợp, thực vật hặc động vật có chất độc 2.719 trường hợp Phần lớn trường hợp ngộ độc xảy căng tin 7.529 trường hợp[2] Một thống kê 10 năm xác định yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Trung Quốc cho thấy 93,24 % nguyên nhân vi sinh vật, có 6,76% yếu tố hóa học [23] Ngộ độc thực phẩm VSV ngày gia tăng quốc gia phát triển quốc gia phát triển, đăc biệt E.coli Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 người bị nhễm bệnh Enterohaemorrhagie E.coli [3] 1.2 Ở Việt Nam Tình trạng nhiễm thực phẩm diễn phổ biến nước, chủ yếu ô nhiễm mầm bệnh sinh học hóa chất [10] Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10] Điều tra thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, 100% mẫu thực phẩm kiểm tra: bánh mì, thịt nguội, thịt quay dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm mặt vi sinh [3] Tại Hải Phịng có 76,4% thực phẩm khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh, tỷ lệ khơng đạt vệ sinh thức ăn đường phố 92,9% Có tới 85% mẫu thực phẩm ăn chợ không đạt tiêu chuẩn vi sinh, với số lượng vi khuẩn có thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [20] Khơng thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm diễn phổ biến nhiều địa phương khác nước [10] Cùng với tình trạng nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm Việt Nam xảy thường xuyên Theo thống kê chưa đầy đủ Cục ATVSTP, từ năm 2000 đến năm 2007, trung bình năm có khoảng 181 vụ ngộ độc thực phẩm xảy với khoảng 5.211 người mắc khoảng 48 ca tử vong Tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung bình 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết 0,06/100.000 dân/năm Tuy nhiên, thực tế, chưa có hệ thống giám sát đến sở, việc thống kê báo cáo chưa thiết lập nên số ca ngộ độc thực phẩm thực tế hàng năm cao nhiều Theo ước tính WHO, ngộ độc thực phẩm hàng năm Việt Nam khoảng triệu ca Ngồi tình trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm mạn tính diễn phức tạp Ngộ độc thực phẩm mạn tính thường Ýt biểu lâm sàng thường khơng dội nh ngộ độc cấp tính Tuy nhiên, hậu ngộ độc thực phẩm mạn tính cịn nguy hiểm nhiều, dẫn đến hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng Riêng quý IV năm 2010, nước xảy 18 vụ ngộ độc làm người tử vong, có vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc 323 người với 242 người nhập viện Nguyên nhân vi sinh (gồm nhóm vi khuẩn Salmonella, Streptoccocus, E.Coli Staphylococcus); độc tố tự nhiên hóa chất Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định nguyên nhân không lấy mẫu thực phẩm lưu sở Mới nhất, ngày 30/12, có 461 cơng nhân thuộc công ty địa bàn quận 12 huyện Húc Mụn, TP.HCM phải nhập viện cấp cứu ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng com.vn) 1.3.Ngộ độc thực phẩm E.coli 1.3.1 Vài nét E.coli E.coli Eschirich phân lập từ phân người năm 1885 E.coli ký sinh bình thường đại tràng người số động vật Sau trẻ đời khoảng 3h, người ta thấy E.coli đại tràng từ sống suốt đời với thể vật chủ E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất số sinh tố, giữ thăng vi khuẩn chí ruột Trong số vi khuẩn hiếu khí đại tràng, E.coli chiếm 80% Một số hình ảnh E.coli 1.3.2 Phân loại Có nhiều cách phân chia lồi E.coli cách phân loại theo type huyết hay dùng Cách phân loại dựa cấu trúc kháng nguyên khác cú trờn bề mặt tế bào vi khuẩn - Kháng nguyên O định kháng nguyên quan trọng Bản chất lipopolisaccharide nằm trờn vỏch tế bào vi khuẩn Có 171 loại kháng nguyên O xác định, số số chỳng cú phản ứng chéo với vi khuẩn khác [34].[44] - Kháng nguyên K kháng nguyên bề mặt Kháng nguyên K nằm bên kháng nguyên O Người ta xác định khoảng 80 loại khỏng nguyên K khác [14].[34] - Kháng nguyên H kháng nguyên lụng cú chất hóa học protein Có 56 loại kháng nguyờn lụng khác [14].[34] Dựa kháng nguyên O, K H người ta phân biệt 700 type huyết khác E.coli Phân loại dựa vào ly giải phage đặc hiệu có khoảng 50 type phage Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm loại [21] - EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột - EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột - ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột - EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột - EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bỏm dớnh đường ruột 1.3.3 Đặc điểm sinh học 1.3.3.1 Hình thái học - E.coli trực khuẩn kích thước trung bình 1-3àx 0,5àm, đứng riêng rẽ thành đôi Trong điều kiện khơng thích hợp (ví dụ: mơi trường có kháng sinh), vi khuẩn dài sợi - Bắt mầu Gram (-) - Di động hệ thống lông xung quanh thân không di động - Có thể có vỏ 1.3.3.2 Tính chất ni cấy - Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện - Nhiệt độ thích hợp 37 oC mọc 40 oC, sống nhiệt đô 5-40o C - pH 7,4 - E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, số phát triển mơi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng - Ở điều kiện thích hợp, E.coli phát triển nhanh, thời gian phân chia thành hệ khoảng 20 đến 30 phút - Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli làm đục nhẹ môi trường, sau 24h làm đục Những ngày sau, đáy ống có cặn - Trên mơi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp thấy khuẩn lạc Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S: trịn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, gặp dạng M dạng R - Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khúm trũn ướt (dạng S) màu trắng đục Để lâu khóm trở nên khơ nhăn (dạng R) Kích thước khóm 23mm - Trên thạch mỏu: Cú chủng dung huyết β, có chủng khơng dung huyết α - Trên mơi trường chẩn đốn chun biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khúm tớm ánh kim - Trên mơi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím - Trên mơi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ 10 - Trờn môi trường đường: Lên men sinh lactose, glucose, galactose Lên men không saccarose khơng lên men dextrin, glycogen 1.3.3.3 Tính chất sinh vật hóa học - Phản ứng oxydase(-), Citrat Simmons(-) - Lên men glucose (+), Lên men sorbitol (-), Lên men lactose(+/-) - Phản ứng RM (+), Phản ứng VP (-), Urease (-), Indole (+), H 2S (-), Sinh (+), Lysine decarboxylase (+), Arginine dihydrolase (+), Ornithin decarboxylase (+), ONPG (+) 1.3.4 Khả gây bệnh đường tiêu hóa E.coli vi khuẩn gây bệnh hội Hiện người ta xác định loại E.coli có khả gây tiêu chảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC ♦ ETEC Để gây bệnh tiêu chảy, E.coli địi hỏi phải có hai yếu tố độc lực là: + Khả bám cư ngụ niêm mạc ruột + Khả sản sinh độc tố Các yếu tố bỏm dớnh: - Khả bám cư ngụ ETEC vào tế bào màng nhầy biểu mô ruột non điều kiện quan throng trình gây bệnh Quá trình thực qua số yếu tố trung gian gọi CFA (Colonization Factor Antigen “yếu tố kháng nguyên cư ngụ”) yếu tố kháng nguyên bề mặt E.coli (E.coli surface antigen) Các CFA có chất protein chúng có tính kháng ngun ngun mạnh, có khả gây ngưng kết hồng cầu số loài khác [36].[38].[46] - Cho đến người ta phát số loại CFA khác CFA Insulin, CFA II, CFA III, CFA IV CFAII mô tả yếu tố