Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Hóa học các hợp chất thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành hóa hữu cơ, đang có xu hướng phát triển mạnh mẽ. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên vô cùng phong phú và quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú do nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 5.000 loài được sử dụng làm thuốc. Nhân dân ta từ lâu đã biết sử dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh. Bắt nguồn từ kinh nghiệm dân gian, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đến nay rất nhiều dược liệu đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trong cuốc sống và khoa học.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THANH BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS EX FR.) KARST LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2018 ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THANH BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS EX FR.) KARST Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT TS TRẦN MẠNH TRÍ Hà nội – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ nhiều từ gia đình, cá nhân tập thể Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Đạt – Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, TS Trần Mạnh Trí – giảng viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Khoa Hóa học Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đào tạo giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ động viên tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! LỜI CAM ĐOAN Tơi là: Phạm Thanh Bình Học viên cao học: Chun ngành Hóa hữu – K26 Tơi xin cam đoan luận văn thạc sĩ cơng trình nghiên cứu trung thực chưa sử dụng cơng trình khác Các thí nghiệm để thu thập số liệu luận văn thân tơi tiến hành thí nghiệm phịng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam với đồng ý hướng dẫn TS Nguyễn Tiến Đạt TS Trần Mạnh Trí Các số liệu phục vụ cho phân tích, nhận xét đánh giá tơi thu thập từ nguồn có ghi rõ tài liệu tham khảo TÁC GIẢ LUẬN VĂN Phạm Thanh Bình MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .2 LỜI CAM ĐOAN .3 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ .9 Chương 1: TỔNG QUAN 10 1.1 Đặc điểm thực vật .10 1.2 Giới thiệu nấm Linh chi 10 1.2.1 Phân bố sinh thái nấm Linh chi 13 1.2.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi .13 1.2.3 Tác dụng dược lý 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc 23 2.4 Phương pháp thử hoạt tính .24 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-AmylaseAmylase .24 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseglucosidase 26 2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm 28 Chương THỰC NGHIỆM 30 3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu: 30 3.2 Quy trình phân lập chất .30 3.3 Thơng số hóa lý hợp chất phân lập 32 3.3.1 Hợp chất (GL-Amylase1): ergosterol 32 3.3.2 Hợp chất (GL-Amylase2): ergosterol peroxide 32 3.3.3 Hợp chất (GL-Amylase3): 3β,26-Amylasedihydroxy-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8,24-Amylasedien-Amylase11-Amylaseone 33 3.3.4 Hợp chất (GL-Amylase4): ganoderic aldehyde A (3-Amylasehydroxy-Amylase11-Amylaseoxolanosta-Amylase8,24-Amylase dien-Amylase26-Amylaseal) 33 3.3.5α-lanosta-8,24-dien-11-one Hợp chất 5α-lanosta-8,24-dien-11-one (GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one): 3β,24S,25α-lanosta-8,24-dien-11-oneS,26-Amylasetetrahydroxy-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8-Amylaseen-Amylase11-Amylaseone 34 3.3.6 Hợp chất (GL-Amylase6): ganoderma acid AM1 (3β-Amylasehydroxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylasetetraoxo 5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselannost-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoic acid) 34 3.3.7 Hợp chất (GL-Amylase7): ganoderic acid C6 (3β,12β-Amylasedihydroxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylase tetraoxo-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanost-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoic acid) 35 3.3.8 Hợp chất (GL-Amylase8): ganoderic acid C 35 3.3.9 Hợp chất (GL-Amylase9): ganodermadiol (lanosta-Amylase7,9(11),24-Amylasetriene-Amylase3,26-Amylasediol) .36 3.3.10 Hợp chất 10 (GL-Amylase10): methyl 3β-Amylasehydroxy-Amylase12β-Amylaseacetoxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylase tetraoxo-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoate 36 3.4 Thử hoạt tính sinh học 10 hợp chất phân lập từ nấm Linh chi (G lucidum) 37 3.4.1 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseamylase 37 3.4.2 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseglucosidase .37 3.4.3 Thử hoạt kháng viêm 37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 4.1 Cấu trúc hợp chất phân lập từ nấm Linh chi 39 4.1.1 Hợp chất 1: (GL-Amylase1): ergosterol 39 4.1.2 Hợp chất 2: (GL-Amylase2): ergosterol peroxide 43 4.1.3 Hợp chất 3: (GL-Amylase3): 3β,26-Amylasedihydroxy-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8,24-Amylasedien-Amylase11-Amylaseone 47 4.1.4 Hợp chất (GL-Amylase4): Ganoderic aldehyde A (3-Amylasehydroxy-Amylase11-Amylaseoxolanosta-Amylase8,24-Amylase dien-Amylase26-Amylaseal) 50 4.1.5α-lanosta-8,24-dien-11-one Hợp chất 5α-lanosta-8,24-dien-11-one (GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one): 3β,24S,25α-lanosta-8,24-dien-11-oneS,26-Amylasetetrahydroxy-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8-Amylaseen-Amylase11-Amylaseone 53 4.1.6 Hợp chất (GL-Amylase6): ganoderma acid AM1 (3β-Amylasehdroxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylasetetraoxo 5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselannost-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoic acid) 60 4.1.7 Hợp chất (GL-Amylase7): Ganoderic acid C6 (3β,12β-Amylasedihydroxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylase tetraoxo-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanost-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoic acid) 63 4.1.8 Hợp chất (GL-Amylase8): ganoderic acid C 67 4.1.9 Hợp chất (GL-Amylase9): Ganodermadiol (Lanosta-Amylase7,9(11),24-Amylasetriene-Amylase3,26-Amylasediol) 70 4.1.10 Hợp chất 10 (GL-Amylase10): methyl 3β-Amylasehydroxy-Amylase12β-Amylaseacetoxy-Amylase7,11,15α-lanosta-8,24-dien-11-one,23-Amylase tetraoxo-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-oneα-Amylaselanosta-Amylase8-Amylaseen-Amylase26-Amylaseoate 73 4.2 Hoạt tính sinh học chất phân lập từ nấm Linh chi G lucidum 77 4.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseamylase 77 4.2.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseglucosidase 78 4.2.3 Hoạt tính kháng viêm 79 KẾT LUẬN .80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 85 DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng số liệu 13C NMR hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum) 42 Bảng Số liệu phổ hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one 5α-lanosta-8,24-dien-11-one4 Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α-Amylaseamylase 77 Bảng Kết thử hoạt tính enzyme α-Amylaseglucosidase 78 Bảng 5α-lanosta-8,24-dien-11-one Kết thử hoạt tính kháng viêm 79 DANH MỤC HÌNH Hình Một số loài nấm thuộc chi Ganoderma 11 Hình Mẫu nấm linh chi (G lucidum Karst) 30 Hình Sơ đồ phân lập hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum) 31 Hình Cấu trúc hợp chất GL-Amylase1 39 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one Phổ 1H hợp chất GL-Amylase1 .39 Hình Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase1 40 Hình Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase1 .41 Hình Phổ MS hợp chất GL-Amylase1 41 Hình Cấu trúc hợp chất GL-Amylase2 43 Hình 10 Phổ 1H NMR hợp chất GL-Amylase2 44 Hình 11 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase2 44 Hình 12 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase2 .45α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 13 Phổ HSQC hợp chất GL-Amylase2 .45α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 14 Phổ HMBC hợp chất GL-Amylase2 46 Hình 15α-lanosta-8,24-dien-11-one Phổ MS hợp chất GL-Amylase2 46 Hình 16 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase3 .47 Hình 17 Phổ 1H NMR hợp chất GL-Amylase3 48 Hình 18 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase3 48 Hình 19 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase3 .49 Hình 20 Phổ MS hợp chất GL-Amylase3 49 Hình 21 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase4 .5α-lanosta-8,24-dien-11-one0 Hình 22 Phổ 1HNMR hợp chất GL-Amylase4 5α-lanosta-8,24-dien-11-one1 Hình 23 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase4 5α-lanosta-8,24-dien-11-one1 Hình 24 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase4 .5α-lanosta-8,24-dien-11-one2 Hình 25α-lanosta-8,24-dien-11-one Phổ MS hợp chất GL-Amylase4 5α-lanosta-8,24-dien-11-one2 Hình 26 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one .5α-lanosta-8,24-dien-11-one6 Hình 27 Phổ 1H hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one 5α-lanosta-8,24-dien-11-one6 Hình 28 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one 5α-lanosta-8,24-dien-11-one7 Hình 29 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one .5α-lanosta-8,24-dien-11-one7 Hình 30 Phổ HSQC hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one .5α-lanosta-8,24-dien-11-one8 Hình 31 Phổ HMBC hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one 5α-lanosta-8,24-dien-11-one8 Hình 32 Phổ COSY hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one .5α-lanosta-8,24-dien-11-one9 Hình 33 Phổ NOESY hợp chất GL-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one 5α-lanosta-8,24-dien-11-one9 Hình 40 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase7 63 Hình 41 Phổ 1H hợp chất GL-Amylase7 64 Hình 42 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase7 65α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 43 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase7 .65α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 44 Phổ HSQC hợp chất GL-Amylase7 .66 Hình 45α-lanosta-8,24-dien-11-one Phổ HMBC hợp chất GL-Amylase7 66 Hình 46 Phổ MS hợp chất GL-Amylase7 67 Hình 47 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase8 67 Hình 48 Phổ 1H hợp chất GL-Amylase8 68 Hình 49 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase8 69 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one0 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase8 .69 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one1 Phổ MS hợp chất GL-Amylase8 70 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one2 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase9 .70 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one3 Phổ 1H hợp chất GL-Amylase9 71 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one4 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase9 72 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one5α-lanosta-8,24-dien-11-one Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase9 .72 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one6 Phổ MS hợp chất GL-Amylase9 73 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one7 Cấu trúc hợp chất GL-Amylase10 .73 Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one8 Phổ 1H hợp chất GL-Amylase10 75α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 5α-lanosta-8,24-dien-11-one9 Phổ 13C NMR hợp chất GL-Amylase10 75α-lanosta-8,24-dien-11-one Hình 60 Phổ DEPT hợp chất GL-Amylase10 76 Hình 61 Phổ MS hợp chất GL-Amylase10 76 DANH MỤC VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-AmylaseNMR H-AmylaseNMR A-Amylase5α-lanosta-8,24-dien-11-one49 CC DEPT DMSO HMBC HSQC IC5α-lanosta-8,24-dien-11-one0 RP-Amylase18 SRB TMS Tiếng Anh Diễn giải Carbon-Amylase13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance human lung adenocarcinoma cell Column chromatography Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Cộng hưởng từ hạt nhân proton Dimethylsulfoxide Heteronuclear mutiple Bond Connectivity Heteronuclear single-Amylase quantum coherence (CH3)2SO Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Inhibitory concentration at 5α-lanosta-8,24-dien-11-one0% Reserve phase C-Amylase18 Sulforhodamine B Tetramethylsilane Nồng độ ức chế 5α-lanosta-8,24-dien-11-one0% đối tượng thử nghiệm Chất hấp phụ pha đảo C-Amylase18 Sulforhodamine B Tetramethylsilane Tế bào ung thư phổi ở người Sắc kí cột Phổ DEPT ĐẶT VẤN ĐỀ Hóa học hợp chất thiên nhiên, phận chuyên ngành hóa hữu cơ, có xu hướng phát triển mạnh mẽ Thế giới thực vật nguồn tài nguyên vô phong phú quý giá hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Xu hướng sâu nghiên cứu tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ