Nghiên cứu cơ sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng để gieo ươm và trồng thông nhựa (pinus merkusii jungh et de vriese) trên đất thoái hóa ở miền bắc việt nam

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM ======================== NGUYỄN THỊ THUÝ NGA TÓM TẮT LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU CƠ SỞ KHOA HỌC SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐA CHỦNG ĐỂ GIEO ƯƠM VÀ TRỒNG THÔNG NHỰA (Pinus merkusii Jungh Et de Vriese) TRÊN ĐẤT THỐI HĨA Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÂM NGHIỆP Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS PHẠM QUANG THU Phản biện 1: ……………………………………………… …………………………………………………………… Phản biện ……………………………………………… ………………………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… …………………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2016 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN - Nguyễn Thị Thuý Nga, Phạm Quang Thu (2009), Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân có hiệu lực cao đặc điểm sinh học chúng để sản xuất phân vi sinh cho lâm nghiệp Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 1038 – 1045 - Nguyễn Thị Thuý Nga (2015), Phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axit (IAA) đối kháng nâm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 3948 - 3959 - Nguyễn Thị Thuý Nga (2015), Nghiên cứu tạo chế phẩm đa chủng VSV đánh giá hiệu chế phẩm sản xuất Thông nhựa (Pinus merkusii) vườn ươm Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 3960 – 3968 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Thông trồng Lâm nghiệp, gây trồng hầu khắp tỉnh trung du miền núi nước ta Cây thông coi loại trồng chủ yếu, với diện tích đứng thứ ba sau bạch đàn keo Theo định số 3135/QĐ-BNN-TCLN ngày 06/8/2015 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn công bố số liệu trạng rừng toàn quốc năm 2014, diện tích rừng trồng thơng loại khoảng 400.000 (chiếm gần 12% tổng diện tích rừng trồng nước) Lồi thơng trồng chủ yếu Thơng nhựa (Pinus merkusii), Thông nhựa mang lại giá trị lớn mặt kinh tế, xã hội Các loài hạt trần nói chung thơng nói riêng, lơng hút rễ phát triển, nên tự nhiên có trình cộng sinh bắt buộc với nấm Sợi nấm giúp trồng hấp thụ nước dinh dưỡng khoáng tốt Quy trình kỹ thuật gieo ươm thơng Bộ Lâm nghiệp Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn ban hành năm 1983 quy định tiêu chuẩn, chất lượng thông xuất vườn phải có nấm rễ Để đạt điều sở sản xuất phải sử dụng 10% đất mặt rừng thông khép tán trộn với thành phần ruột bầu, để có nguồn nấm cộng sinh Việc làm gây nên nhiều bất lợi : nấm cộng sinh không tuyển chọn; mang theo mầm sâu, bệnh đặc biệt bệnh lở cổ rễ bệnh rơm thông; hệ sinh thái rừng thông khép tán bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chi phí lớn Ở nước ta gieo ươm thơng vườn ươm cịn mắc nhiều bệnh như: bệnh vàng cịi thơng khơng có nấm cộng sinh, bệnh thối cổ rễ nấm Fusarium spp Tỷ lệ bị chết vườn ươm nấm Fusarium spp gây ước tính từ 40% đến 50% Không suất rừng trồng thơng cịn hạn chế, thơng sinh trưởng phát triển kém, kéo theo sức đề kháng yếu, dễ bị bệnh cơng nhiều lồi sâu bệnh Trên giới nước ta, sử dụng sản phẩm có nguồn gốc vi sinh vật (VSV) để bổ xung vào bầu ươm con, trồng rừng thông, việc làm mang lại lợi ích kinh tế cao thân thiện với môi trường, nhằm tăng suất giá trị trồng làm giảm tượng thối hóa đất Hiện thị trường phân bón nước ta, có số thương hiệu phân vi sinh chủ yếu phục vụ cho phát triển Nông nghiệp ăn quả, loại phân VSV riêng cho lâm nghiệp cịn hạn chế Phát triển Lâm nghiệp cải tạo đất thoái hoá cần thiết quan trọng việc phát triển kinh tế, xã hội, bảo vệ môi trường đặc biệt phát triển nghề rừng Để khắc phục tồn tiến hành nghiên cứu luận án “Nghiên cứu sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng để gieo ươm trồng Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh Et de Vriese) đất thoái hoá Miền Bắc Việt Nam” MỤC TIÊU 2.1 Mục tiêu tổng quát - Xác định sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng (gồm nấm ngoại cộng sinh, vi khuẩn sinh IAA đối kháng nấm gây bệnh, vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan cố định nitơ tự do) để gieo ươm, gây trồng thông nhựa nhằm tăng sinh trưởng, hạn chế bệnh thối cổ rễ cải tạo đất thoái hoá 2.2 Mục tiêu cụ thể -Tuyển chọn chủng nấm ngoại cộng sinh, thuộc loài Pisolithus tinctorius, phân lập tuyển chọn vi khuẩn nội sinh Thơng nhựa, có khả sinh tổng hợp IAA đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ Thông nhựa; phân lập tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan cố định nitơ tự có hiệu lực cao - Xác định đặc điểm sinh học chủng VSV tuyển chọn - Xác định sở khoa học tạo chế phẩm VSV đa chủng - Sản xuất chế phẩm VSV đa chủng có khả tăng sinh trưởng, hạn chế bị bệnh Thông nhựa vườn ươm rừng trồng, cải tạo đất thối hố, bạc màu ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Lần phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis nội sinh Thơng nhựa, có khả sinh tổng hợp IAA vừa có khả đối kháng với nấm F.oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông - Lần phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Burkholderia cenocepacia, Azotobacter beijerinskii có khả phân giải phốt phát khó tan vừa có khả cố định nitơ tự - Tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng cho Thơng nhựa có khả kích thích sinh trưởng, cố định đạm, phịng trừ nấm gây bệnh thối cổ rễ cải tạo đất thoái hoá bạc màu, thay việc sử dụng 10% đất mặt rừng thông gieo ươm thay việc sử dụng phân NPK bón lót trồng rừng CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NGỒI NƯỚC 1.1.1 Nghiên cứu nấm cộng sinh Nấm cộng sinh nhà nghiên cứu vi sinh vật quan tâm từ sớm, Venezuela, người ta lấy lớp đất mặt rừng trồng thông khép tán trộn với đất vườn ươm để tạo ruột bầu gieo ươm con, nấm cộng sinh chủ yếu loài Thelephora terrestric Từ năm 1980, bào tử nấm Pisolithus tinctorius bang Georgia Mỹ nhiễm cho thông vườn ươm Marx đồng tác giả (1982) nghiên cứu, chế phẩm P tinctorius sản xuất bán rộng rãi thị trường, hầu hết gieo ươm nhiễm chế phẩm quy mô lớn Theo Marx đồng tác giả (1989) bào tử nấm P tinctorius thu từ thể nấm nhiều vùng sinh thái khác nhau, cộng sinh với nhiều loài chủ, tạo cho chế phẩm bào tử có tính đa dạng mặt sinh học chế phẩm hệ sợi Hơn tám triệu con, nhiễm chế phẩm hệ sợi nhiều triệu nhiễm chế phẩm bào tử, cho kết sinh trưởng vượt trội 1.1.2 Nghiên cứu VSVNS sinh IAA kích thích tăng trưởng thực vật Các chất kích thích tăng trưởng thực vật chất tự nhiên sản xuất VSV nội sinh Chúng có tác dụng kích thích ức chế số q trình sinh lý, sinh hóa thực vật vi sinh vật Brakel Hilger (1965) cho rằng, vi khuẩn Azotobacter sản sinh axit indol-3-acetic (IAA) chất tăng trưởng thực vật Chandramohan Mahadevan (1968b) phân lập vi khuẩn sinh IAA tăng trưởng thực vật từ Bông Những năm trước nhiều nhà khoa học cho IAA sản suất vi sinh vật chất chuyển hóa thứ cấp Nhưng gần nhà nghiên cứu Stijn Jos (2010) cho rằng, VSV nội sinh nhà máy khổng lồ, sản xuất IAA tăng kích thính sinh trưởng thực vật Ruben đồng tác giả (2012) cho rằng, có mặt vi sinh vật sinh IAA làm tăng sản lượng trồng cách rõ rệt 1.1.3 Nghiên cứu vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan Johri đồng tác giả (1999), phân lập mơ tả đặc điểm khoảng 4.800 chủng VSV có khả phân giải phốt phát khó tan Tuy nhiên, tác giả dừng mô tả đặc điểm chủng, mà chưa ứng dụng chủng vi sinh vật phân giải phốt phát vào sản xuất phân vi sinh Alan (2000) cho rằng, vi sinh vật đất đóng vai trị quan trọng việc hấp thụ trình biến đổi chất dinh dưỡng đất Đối với phốt pho, vi sinh vật đất có ảnh hưởng nhiều đến q trình biến đổi phốt pho, đặc biệt vi sinh vật phân giải phốt từ hợp chất phốt có đất José đồng tác giả (2001) nghiên cứu, chủng vi khuẩn phân giải phốt phát phân lập từ nguồn khác có hiệu lực phân giải phốt phát khác nhau.Việc sử dụng vi sinh vật phân giải phốt phát, khơng có tác dụng cải tạo đất, mà làm tăng lượng phốt cho trồng đem lại kết tốt cho mùa vụ 1.1.4 Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh Alecxander Fleming (1928), tình cờ phát quan hệ đối kháng nấm Penicillinum notatum với khuẩn Staphylococus aureus tìm chất kháng sinh penicillin Hiện nay, giới có khoảng 13.000 chất kháng sinh tự nhiên, có 3.000 chất thực vật tạo ra, 9.000 chất kháng sinh VSV tổng hợp hàng ngàn dẫn chất kháng sinh bán tổng hợp Chanway (1996) cho rằng, VK nội sinh thúc đẩy trình sinh trưởng chủ, tạo hàng rào kiểm soát sinh học việc tiêu diệt trực tiếp mầm bệnh xâm nhiễm vào chủ Joseph đồng tác giả (1997) ứng dụng VSV đối kháng nấm gây bệnh, cách tiêm chủng VK vào cây, Cà chua Dưa chuột đem lại hiệu ức chế số loại mầm bệnh giảm mức độ bị bệnh Yuparet (1999) phân lập tuyển chọn, số loài VK sống mơ cỏ có khả sản xuất chất kháng sinh L-Asparaginase 1.1.5 Nghiên cứu vi sinh vật cố định nitơ tự Các tác giả Maryenko (1964) Arun (2007) nghiên cứu cho rằng, mật độ vi khuẩn Azotobacter vùng gần rễ trồng có mật độ cao vùng đất hoang Họ phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật cố định nitơ tạo phân bón sinh học bón cho trồng lúa, ngơ, mía rau thúc đẩy tăng trưởng loại trồng Ngồi ra, tác giả cịn khẳng định rằng, loại phân bón sinh học có khả tổng hợp nitơ ổn định, không gây hại cho môi trường đảm bảo chất lượng nông sản Theo Timmusk (1999) vi khuẩn Paenibacillus phân lập rễ đất có khả cố định nitơ tự do, thúc đẩy kích thích tăng trưởng thực vật sản xuất enzym thuỷ phân, sản xuất thuốc kháng sinh chống lại vi sinh vật gây hại cho người gây bệnh thực vật 1.1.6 Sử dụng chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp De đồng tác giả (1988) sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh dạng viên nén bào tử loại nấm P tinctorius Scleroderma spp, để nhiễm cho loài kim lồi thơng, kết rõ đường kính nhiễm chế phẩm tăng so với đối chứng 75% sau 16-18 tháng tuổi Nhà nghiên cứu người Nam Phi Lubanza đồng tác giả (2012) cho chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp bao gồm Azospirillum Rhizobium có khả thúc đẩy phát triển tăng sản lượng trồng Olubukola Bernard (2012) hai nhà khoa học người Mỹ nghiên cứu chế phẩm hỗn hợp loài vi sinh vật khác tạo phân bón Phân bón hỗn hợp vi sinh vật gồm vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật, vi sinh vật đối kháng bệnh vi khuẩn chống lại xâm hại sâu bệnh 1.1.7 Nghiên cứu gieo trồng Thơng nhựa Thơng nhựa có vùng phân bố rộng, từ miền Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Phillippin đến Indonesia miền Đông Myanmar Chúng trồng từ lâu nhiều nước thuộc khu vực Đông Nam Á Việt Nam, Lào, Campuchia, Philippines, Malaysia Indonesia Các nghiên cứu cho rằng, biện pháp xử lý lập địa khác loại trồng khác có ảnh hưởng khác đến độ phì đất, xử lý lập địa để trồng thơng nhựa khác độ phì đất rừng Thông nhựa khác nhau, suất rừng trồng Thông nhựa phụ thuộc lớn vào biện pháp lâm sinh xử lý lập địa khác Ngoài nhân giống gây trồng Thông nhựa nhiều nước sử dụng loại nấm cộng sinh P tinctorius, Boletus granulatus, Scleroderma spp., Thelephora terrestris, Cenoccocum graniforme, Amantita spp., Rhizopogon spp.… gây nhiễm vào đất ươm hạt, có rễ tốt sinh trưởng nhanh 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƯỚC 1.2.1 Nghiên cứu nấm cộng sinh Quy trình kỹ thuật gieo ươm thông Lâm nghiệp Nông nghiệp Phát triển nông thôn ban hành năm 1983 quy định tiêu chuẩn, chất lượng thông xuất vườn phải có nấm rễ Khi gieo ươm thông vườn ươm, sở sản xuất sử dụng lớp đất mặt rừng trồng thơng khép, tán trộn với đất đóng bầu nhằm lấy nguồn nấm cộng sinh có tự nhiên Phạm Quang Thu (2004), chế phẩm nấm cộng sinh thử nghiệm cho thông con, bạch đàn, keo, phi lao vườn ươm cho thông rừng trồng bước đầu có kết tốt Nhưng chế phẩm cịn dạng thơ chưa tổng hợp nhiều chủng vi sinh vật có ích Phạm Quang Thu Đặng Như Quỳnh (2007), điều tra thu thập 33 lồi nấm ngoại cộng sinh với thơng bạch đàn đó: có 16 lồi cộng sinh với thơng; 14 loài cộng sinh với bạch đàn loài cộng sinh với thông bạch đàn 1.2.2 Nghiên cứu VSVNS sinh tổng hợp IAA kích thích tăng trưởng Nguyễn Kim Anh đồng tác giả (2008), nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Azotobacter từ 30 mẫu đất Trong có chủng có hoạt tính sinh tổng hợp IAA Đỗ Kim Nhung Vũ Thành (2011) phân lập vi sinh vật nội sinh từ mía có khả sinh IAA, số 12 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 14 dòng vi khuẩn Gluconacetobacter sp khảo sát có dịng vi khuẩn A1 G10 vừa có khả tổng hợp IAA vừa có khả cố định đạm đạt mức cao Trần Thanh Phong Cao Ngọc Điệp (2011) phân lập 49 dòng vi khuẩn nội sinh Dứa, tuyển chọn dịng có đặc tính tốt cố định đạm, khả phân giải lân sinh tổng hợp IAA Nguyễn Thị Huỳnh Như đồng tác giả (2013) nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi sinh vật nội sinh chuối có khả sinh IAA 1.2.3 Nghiên cứu vi sinh vật phân giải phốt phát Phạm Văn Toản đồng tác giả từ năm 1996 đến năm 1998, phân lập 100 chủng có hoạt tính phân giải lân Bón phân hữu vi sinh vật làm sinh trưởng tốt hơn, làm tăng suất lúa 21,6% lạc 23,7% Nguyễn Thị Thúy Nga Phạm Quang Thu (2009) với 30 mẫu đất rừng thu tỉnh miền Bắc Việt Nam phân lập 30 chủng vi sinh vật có khả phân giải lân Trong có 15 chủng có hiệu lực phân giải lân cao, chiếm 50% tổng số chủng phân lập Các chủng PGL RH3,, P9.2, P1.4, P1.1, có đường kính vịng phân giải phốt phát cao (có đường kính vòng phân giải> 2,2 cm) 1.2.4 Nghiên cứu VSV đối kháng với nấm gây bệnh Nguyễn Thị Thúy Nga Phạm Quang Thu (2006), phân lập 56 chủng vi khuẩn khác từ 10 loài gỗ tuyển chọn 12 chủng VK có khả sinh kháng sinh ức chế phát triển nấm gây bệnh sọc tím Luồng Phạm Quang Thu Nguyễn Thị Thúy Nga (2007) phân lập 113 chủng VK từ 15 mẫu bạch đàn không bị bệnh, có 22 chủng có đặc điểm hồn tồn khác Tuyển chọn chủng VK có khả đối kháng với nấm Cryptosporiopsis eucalypti gây bệnh đốm bạch đàn Lê Như Kiểu đồng tác giả (2010), phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh lạc vừng để sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng ứng dụng sản xuất lạc vừng 10 chủng vi khuẩn phân lập tuyển chọn có hoạt tính đối kháng với  vi khuẩn R solanacearum, an toàn trồng động vật máu nóng 1.2.5 Nghiên cứu vi sinh vật cố định nitơ tự Lai Chí Quốc đồng tác giả (2012) tuyển chọn nhận diện vi khuẩn cố định đạm (có khả hồ tan phốt phát kali) phân lập từ vật liệu phong hoá vùng núi đá hoa cương núi cấm, tỉnh An Giang Trần Thanh Phong Cao Ngọc Điệp (2012), phân lập mơtả đặc điểm hình thái 31 chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh rễ ngơ mơi trường khơng có đạm Nfb Cả 31 chủng phân lập được đều có khả sinh tổng hợp IAA, tuyển chọn được chủng có phản ứng tốt với sự sinh trưởng 1.2.6 Sử dụng chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp Phạm Quang Thu (2004) nghiên cứu chế phẩm hỗn hợp bao gồm bào tử hữu tính nấm P tinctorius số vi sinh vật chức khác Phạm Quang Thu Nguyễn Thị Thuý Nga (2011) nghiên cứu sử dụng vi sinh vật che phủ nhằm nâng cao suất Keo lai cải tạo đất sau luân kỳ bạch đàn, kết bón lót 20g vi sinh + trồng cốt khí, cho đường kính 1,3m tăng 22% chiều cao vút Keo lai tăng khoảng 12%, tỷ lệ sống đạt 98% Lê Như Kiểu đồng tác giả (2011) nghiên cứu, tổ hợp chủng VSV để sản xuất phân hữu vi sinh đa chức cho chè Kết thu chủng vi sinh vật có ích an tồn sinh học, chủng A11, chủng KT7, chủng PI6, chủng ĐK 14, chế phẩm vi sinh vật đa chủng làm giảm tỷ lệ chết chè lên đến 50,6% Phạm Quang Thu đồng tác giả (2010) sản xuất chế phẩm viên nén MF1 MF2, bón 40g MF1cho thơng rừng trồng kết tăng chiều cao 16% đường kính 40% so với đối chứng, bón 40g chế phẩm MF2 cho bạch đàn rừng trồng kết tăng chiều cao 55% đườn kính 38% so với đối chứng Ở loại chế phẩm giảm tỷ lệ bị bệnh trồng 1.2.7 Nghiên cứu gieo trồng Thông nhựa Ở nước ta Thông nhựa phân bố từ Bắc vào Nam, thực tế gieo Thông nhựa sở sản xuất phải sử dụng 10% đất mặt rừng thông khép tán để trộn với thành phần ruột bầu để có nguồn nấm cộng sinh, gây nên nhiều bất lợi sau: nấm cộng sinh không tuyển chọn, mang theo sâu, bệnh đặc biệt bệnh lở cổ rễ bệnh rơm thông, hệ sinh thái rừng thông khép tán bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chi phí lớn Theo Nguyễn Sỹ Giao, (1996) tỷ lệ bị chết vườn ươm nấm Fusarium spp, gây ước tính từ 40% đến 50% Theo Nguyễn Xuân Quát, (1985) tiêu chuẩn yêu cầu chất lượng Thông nhựa đem trồng, áp dụng tiêu chuẩn Bộ Lâm nghiệp, đem trồng đất có trảng bụi, trảng cỏ cao trảng cỏ thấp, hay trọc trụi vùng có chế độ mưa mùa khác nhau, cho tỷ lệ sống cao sinh trưởng phát triển tốt Bốn đặc điểm môi trường yêu cầu dinh dưỡng Thông nhựa tuổi vườn ươm thành phần giới, mùn, độ chua lân đất hay hỗn hợp ruột bầu Cây Thông nhựa 1- 1,5 tuổi, đạt chiều cao 20-25 cm đưa trồng, thời vụ trồng thơng nhựa tỉnh phía Bắc thích hợp vào khoảng cuối mùa đông, đầu mùa xuân, lúc nhiệt độ ấm dần có mưa phùn 1.2.8 Nghiên cứu đất thoái hoá, bạc màu Thoái hoá đất đai dấu hiệu chung suy giảm thời thường xuyên khả sản xuất đất đai (UNEP, 1992) Hoặc định nghĩa thối hố đất q trình thay đổi tính chất lý, hoá, sinh học đất dẫn đến đất giảm khả thực chức Những loại đất xấu, đất bạc màu, đất thối hoá thường mang nhược điểm gây hại cho trồng đất bị tầng canh tác, nghèo kiệt dinh dưỡng, đặc biệt nghèo chất hữu cơ, bị khô hạn, chai cứng bị ngập úng nước, bị chua hoá, mặn hoá mà hiệu sản xuất thấp Để tiếp tục canh tác vùng đất bạc màu đưa lại hiệu kinh tế cần phải cải tạo đất bạc màu biện pháp tổng hợp luân canh trồng, thâm canh hợp lý, phân bón, thuỷ lợi Nhận xét Vi sinh vật có vai trị quan trọng hệ sinh thái Nông lâm nghiệp, bao gồm nhóm sau: nhóm VSV đất cố định nitơ tự cung cấp cho trồng dinh dưỡng khoáng cho đất, nhóm VSV tạo chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA cho cây, nhóm VSV phân giải hợp chất phốt phát khó tan thành dễ tan, nhóm VSV đối kháng với nấm gây bệnh Qua kết nghiên cứu hiệu sử dụng chế phẩm vi sinh vật Việt Nam nước cho thấy, phân bón hữu vi sinh có tác dụng tốt đến sinh trưởng, phát triển, suất trồng, giảm giá thành, nâng cao hiệu trồng trọt cải tạo môi trường đất canh tác Tuy nhiên, theo chuyên gia, nghiên cứu triển khai chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp nước ta hạn chế sở thực nghiệm cơng nghệ sinh học cịn nhỏ hẹp, tản mát, số lượng ỏi, hầu hết nghiên cứu dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm hay sản xuất thử cho mơ hình thương mại hóa Ngồi ra, sản phẩm lưu hành thị trường chưa đảm bảo mật độ hoạt lực chủng vi sinh VSV tế bào sống cần có điều kiện thích hợp chất mang, điều kiện ngoại cảnh Các chế phẩm VSV chưa chọn lọc tập hợp nhiều chủng VSV có ích, khơng chủng VSV hầu hết có cơng dụng định Mặc dù chế phẩm VSV nước ta chủ yếu phục vụ cho phát triển Nông nghiệp ăn Để phát triển Lâm nghiệp cải tạo đất thoái hoá Lâm nghiệp cần thiết quan trọng việc phát triển kinh tế, xã hội bảo vệ môi trường đặc biệt phát triển nghề rừng Để đáp ứng yêu cầu cần sản xuất chế phẩm VSV đa chủng gồm nấm ngoại cộng sinh với thông, phân lập tuyển chọn vi sinh vật nội sinh Thơng nhựa có khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA, phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải lân, vi sinh vật có khả đối kháng vi sinh vật gây bệnh thối cổ rễ thông vi sinh vật cố định nitơ Chế phẩm vi sinh vật đa chủng nhằm tăng sinh trưởng hạn chế bệnh Thông nhựa, đáp ứng nhu cầu tạo chất lượng cao cho công tác trồng rừng, tạo rừng Thông nhựa sinh trưởng phát triển tốt bị sâu bệnh hại Chế phẩm cịn góp phần tăng độ ẩm đất, tăng mật độ vi sinh vật đất cải tạo đất bạc màu làm giảm q trình thối hóa đất, sa mạc hóa miền Bắc Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Cành Thơng nhựa đường kính – 2cm thu từ Thông nhựa khoẻ mạnh, sinh trưởng tốt - 30 mẫu đất rừng thu tỉnh miền Bắc Việt Nam - Tập đoàn nấm ngoại cộng sinh lưu trữ Trung tâm nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam - Apatis, mùn, đất sét 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng VSV 3.1.1 Kết tuyển chọn nấm cộng sinh có hiệu lực cao cho Thơng nhựa Sau 30 ngày nhiễm nấm phương pháp invitro tiến hành đo chiều cao Thông nhựa, kết cho thấy sinh trưởng chiều cao trung bình mẫu thí nghiệm so với đối chứng có khác biệt hồn tồn, mơi trường dinh dưỡng có nấm ngoại cộng sinh q trình chuyển hóa chất cho tốt hơn, nấm giúp rễ hút chất dinh dưỡng tốt chúng tăng trưởng chiều cao tốt khơng nhiễm nấm Chủng nấm Pt1 thuộc lồi Pisolithus tinctorius cộng sinh với Thông nhựa cho chiều cao 4.7 cm (tăng 55% so với đối chứng) cao loài nấm cộng sinh đưa vào thử nghiệm Chủng nấm Pt1 lựa chọn cho nghiên cứu để sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng phục vụ gieo ươm gây trồng Thông nhựa 3.1.2 Kết phân lập tuyển chọn VSV nội sinh Thơng nhựa có khả sinh tổng hợp IAA đối kháng nấm gây bệnh 3.1.2.1 Kết phân lập vi sinh vật nội sinh Thông nhựa Với 20 mẫu cành Thông nhựa phân lập 87 chủng VK nội sinh có 38 chủng vi khuẩn có hình thái khác đặc điểm khuẩn lạc chủng VSV phân lập có khác màu sắc phát triển chúng, tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp IAA cao hiệu lực lớn đối kháng với nấm gây bệnh thối cổ rễ tuyển chọn từ 38 chủng vi sinh vật 3.1.2.2 Kết tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh tổng hợp IAA Khả sinh tổng hợp IAA chủng VK kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Khả sinh IAA số chủng VKNS Thông nhựa STT Tên chủng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 QI1 CI2 CI3 CI4 CI5 CI6 CI7 CI9 CI10 CI11 CI12 CI13 QI8 QI9 QI10 QI11 QI12 QI13 QI14 QI15 QI16 QI17 QI19 QI20 Phản ứng với thuốc thử Salkowski + + + + + + + + + + + + + + + + + + 10 Hàm lượng IAA thu (mg/l) 11,872 0,64 0,576 1,952 5,344 2,944 0,48 0 0 15,328 0,064 0,48 0,48 1,792 0,64 4,416 4,784 1,696 0,832 1,76 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 QI21 QI23 QI24 QI25 QI26 QI27 QI29 QI30 QI31 QI32 QI33 QI34 QI35 QI36 + + + + + + + - 3,36 9,312 5,312 0,352 2,944 0,864 0 0 3,36 0 (+) Có phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowski, lên màu tím hồng nghĩa có sinh tổng hợp IAA (-) Khơng có phản ứng với thuốc thử Salkowski nghĩa không sinh tổng hợp IAA Qua kết Bảng 3.1, chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp IAA, có 25 chủng phản ứng dương tính với thuốc thử, đưa vào thử nghiệm chúng có khả sinh tổng hợp IAA, khả sinh tổng hợp IAA chủng khác Có chủng mạnh chủng QI8, chủng QI1, có khả tổng hợp 15,382 11,872 mgIAA/l, nhiên có chủng có khả tổng hợp IAA kết tổng hợp không đáng kể QI26 tổng hợp 0,352 mgIAA/l Chủng QI1 chủng QI8 chọn đưa vào cho nghiên cứu Khuẩn lạc chủng vi khuẩn sinh IAA với màu sắc khác (Hình 3.1-3.6) Hình 3.1: Chủng VK QI1 Hình 3.2: Chủng VK CI6 Hình 3.3: Chủng VK QI8 Hình 3.4: Chủng VK QI26 Hình 3.5: Chủng VK QI24 Hình 3.6: Chủng VK QI23 3.1.2.3 Kết tuyển chọn VSV nội sinh Thông nhựa đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ Trong 38 chủng vi khuẩn tìm thấy phân lập vi sinh vật nội sinh Thông nhựa, đưa vào thử nghiệm khả ức chế nấm F oxysporum kết thí nghiệm trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 : Hoạt tính kháng nấm F oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông VKNS STT Tên chủng QI1 CI2 CI3 CI4 CI5 CI6 CI7 Đường kính ức chế (mm) sau ngày 16,6 6,2 0 13,4 9,1 11 Đường kính ức chế (mm) sau 10 ngày 20,1 9,3 0 15,5 11,5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 CI9 CI10 CI11 CI12 CI13 QI8 QI9 QI10 QI11 QI12 QI13 QI14 QI15 QI16 QI17 QI19 QI20 QI21 QI23 QI24 QI25 QI26 QI27 QI29 QI30 QI31 QI32 QI33 QI34 QI35 QI36 12,5 10,4 8,2 2,3 11,4 14,2 0 5,2 0 12,5 5,2 0 10,2 13,6 12,3 8,1 4,2 13,2 15,3 14,3 12.5 0 14,6 13,3 9,1 4,5 17,7 15,2 0 10,3 5,13 19 20,5 0 18,5 19,3 17,3 22,1 9,4 17,1 18,2 18,5 14.3 0 Trong 38 chủng vi khuẩn (VK) nội sinh thơng có 23 chủng (chiếm 60% tổng số chủng phân lập) có khả ức chế nấm gây bệnh F oxysporum Chủng QI1 có khả sinh tổng hợp IAA mạnh đạt 11,872 mg/l chúng có khả kháng nấm bệnh thối cổ rễ thơng mạnh đạt vịng ức chế 20,1mm (Hình 3.10) Chủng QI8 có khả sinh tổng hợp IAA mạnh đạt 15,328mg/l IAA chúng cịn có khả kháng nấm bệnh thối cổ rễ thông mạnh đạt vịng ức chế 17,7mm (Hình 3.11) Chủng QI16 có khả kháng nấm bệnh thối cổ rễ thơng mạnh đạt vịng ức chế 20,5mm có khả sinh tổng hợp IAA đạt 4,784mg/l (Hình 3.8) Chủng QI24 có đường kính vịng phân giải lớn 22,1mm có khả sinh tổng hợp IAA đạt 9,312/l (Hình 3.7) Khi ni cấy chủng nấm gây bệnh thối cổ rễ Thông nhựa khơng có vi khuẩn kháng nấm, nấm gây bệnh mọc kín khơng có vịng đối kháng (Hình 3.12) Vì vi khuẩn QI1, QI8, QI16, QI24 lựa chọn cho nghiên cứu Hình 3.7: Chủng QI24 Hình 3.8: Chủng QI16 Hình 3.9: Chủng QI25 Hình 3.10: Chủng QI1 12 Hình 3.11: Chủng QI9 Hình 3.12: Nấm F đối kháng nấm đối kháng nấm đối kháng nấm F oxysporum F oxysporum F oxysporum đối kháng nấm F oxysporum đối kháng nấm F oxysporum oxysporum 3.1.3 Kết phân lập tuyển chọn VSV phân giải photphat khó tan 3.1.3.1 Phân lập vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan Từ 30 mẫu đất rừng thu tỉnh miền Bắc Việt Nam phân lập 35 chủng vi sinh vật có khả phân giải phốt phát khó tan Các chủng vi sinh vật phân lập, nuôi cấy khiết tuyển chọn chủng có hiệu lực cao 3.1.3.2 Tuyển chọn chủng VSV phân giải phốt phát khó tan +) Tuyển chọn thơng qua phương pháp, đo đường kính vịng phân giải khoảng thời gian khác kết trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3: Khả phân giải phốt phát khó tan vi khuẩn theo thời gian TT Ký hiệu chủng VSV 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 N1.1 N1.2 N1.3 N2.1 N2.3 N3.2 N4.2 N4.1 N5.1 N6.1 N9.2 N10.2 B1.1 B2.1 B3.1 B4.3 B5.1 B6.1 B7.1 B7.2 B8.1 B8.3 B9.1 B9.2 V1.1 V1.2 V2.2 V2.3 V3.2 V4.2 V5.1 V6.1 V7.3 V8.2 V9.1 Đường kính vịng phân giải tính theo thời gian (mm) ngày ngày 2,0 6,0 8,0 12,5 5,0 9,8 15,2 17,5 1,5 6,5 8,3 9,5 6,5 13,2 19,5 23,0 5,0 12,0 17,5 21,0 2,0 4,6 5,6 6,8 4,2 10,5 16,0 8,9 2,4 3,2 4,4 5,6 8,0 14,0 16,4 17,0 3,0 8,0 11,0 18,5 2,4 4,2 5,0 8,5 2,0 6,5 10,0 17,6 3,0 7,0 12,5 16,6 2,0 6,0 8,0 11,0 5,0 9,8 17,2 17,5 1,5 6,4 8,6 10,5 2,4 4,1 4,4 1,8 2,8 5,0 5,0 10,4 16,6 17,1 5,0 8,2 10,2 15,2 2,0 5,3 8,2 9,3 3,2 5,1 5,6 2.0 6,1 8,0 8,0 5,0 9,8 17,2 18,0 1,5 6,3 6,6 7,8 2,0 6,0 8,0 9,5 2,0 4,6 5,3 2,1 3,0 4,8 6,0 9,0 19,2 4,2 10,5 14,8 20,2 1,5 2,6 2,6 2,0 2,8 2,8 2,2 4,0 8,8 6,5 9,0 14,2 4,0 10,3 12,8 14,6 13 Trong số 35 chủng VSV có khả phân giải phốt phát khó tan, có 18 chủng có khả phân giải lân mạnh, có đường kính vịng phân giải > 10 mm, có 13 chủng có khả phân giải lân mạnh đường kính vịng phân giải >15 mm +) Kết so màu máy Quang phổ có bước sóng 430nm Lấy 13 chủng có đường kính vịng phân giải cao đưa vào nghiên cứu định lượng so màu máy Quang phổ có bước sóng 430nm, kết trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4: Khả phân giải phốt phát khó tan chủng VK ĐK vòng pg sau ngày(mm) STT Ký hiệu chủng 10 11 12 13 Mẫu đối chứng không cấy vi khuẩn N1.2 N2.1 N2.3 N5.1 N6.1 N10.2 B1.1 B3.1 B7.1 B7.2 B9.2 V3.2 V4.2 Nồng độ lân dễ tiêu (ppm) 43,95 17.5 23.0 21.0 17,0 18,0 17,6 16,6 17,5 17,0 15,2 18,0 19,2 20,2 367,62 420,13 427,75 288,00 202,37 271,32 344,00 305,63 346,62 374,00 243,63 335,26 410,03 Chủng N2.3, chủng N2.1 có đường kính vịng phân giải cao từ 2123mm nồng độ lân dễ tiêu > 420ppm gấp khoảng 10 lần so với đối chứng (Hình 3.18) Dựa đường kính vịng phân giải nồng độ lân dễ tiêu phân giải tuyển chọn chủng có hoạt tính phân giải lân cao nhất, chủng N2.3 chủng N2.1 (Hình 3.15) đưa vào thực nghiên cứu Hình 3.13: Chủng VK pg phốt phát Hình 3.14: Chủng VK N5.1 Hình 3.15: Chủng VK N2.1 Hình 3.16: Chủng VK N6.1 Hình 3.17: Chủng VK B7.1 Hình 3.18: Chủng VK N2.3 3.1.3.3 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ Với 35 chủng vi khuẩn phân giải lân phân lập từ đất thu thập tỉnh phía Bắc, tiếp tục thử nghiệm khả cố định nitơ Kết khả cố định nitơ chủng trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5: Khả cố định nitơ chủng vi khuẩn TT Ký hiệu chủng N1.1 N1.2 N1.3 N2.1 N2.3 Hàm lượng NH4+ (mg/ml) 2,05 1,08 3,12 3,04 14 Mức độ cố đinh nitơ Trung bình Khơng cố đinh N2 Yếu Mạnh Mạnh 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 N3.2 N4.2 N4.1 N5.1 N6.1 N9.2 N10.2 B1.1 B2.1 B3.1 B4.3 B5.1 B6.1 B7.1 B7.2 B8.1 B8.3 B9.1 B9.2 V1.1 V1.2 V2.2 V2.3 V3.2 V4.2 V5.1 V6.1 V7.3 V8.2 V9.1 0 1,76 0 1,32 2,12 1,02 2,08 2,14 1,34 0 0 2,14 1,34 3,05 2,76 1,08 2,14 3,34 4,18 1,46 0 3,21 Không cố đinh N2 Không cố đinh N2 Yếu Không cố đinh N2 Không cố đinh N2 Yếu Mạnh Không cố đinh N2 Mạnh Trung bình Trung bình Yếu Khơng cố đinh N2 Khơng cố đinh N2 Không cố đinh N2 Không cố đinh N2 Trung bình Yếu Khơng cố đinh N2 Mạnh Trung bình Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Khơng cố đinh N2 Yếu Không cố đinh N2 Không cố đinh N2 Mạnh Chủng N2.1 có khả phân giải phốt phát khó tan, đường kính vịng phân giải đạt 23 mm nồng độ lân dễ tiêu đạt 420,13ppm có khả cố định nitơ mạnh đạt 3,12 mg/ml NH4+(Hình 3.23) Chủng N2.3 có khả phân giải phốt phát khó tan, đường kính vịng phân giải đạt 21 mm nồng độ lân dễ tiêu đạt 427,75 ppm có khả cố định nitơ mạnh đạt 3,04 mg/ml NH4 +(Hình 3.24) Chủng V3.2 có khả cố định nitơ mạnh đạt 3,34 mg/ml NH4+ có khả phân giải phốt phát khó tan, đường kính vịng phân giải đạt 19,2 mm nồng độ lân dễ tiêu đạt 335,26 ppm (Hình 3.20) Chủng V4.2 có khả cố định nitơ mạnh đạt 4,18 mg/ml NH4 + có khả phân giải phốt phát khó tan, đường kính vịng phân giải đạt 20,2 mm nồng độ lân dễ tiêu đạt 410,03 ppm (Hình 3.21), chủng N2.1, N2.3, V2.3 V4.2 lựa chọn đưa vào nghiên cứu tiếp Hình 3.19: Chủng vi khuẩn B2.1 Hình 3.20: Chủng vi khuẩn V3.2 Hình 3.21: Chủng vi khuẩn V4.2 Hình 3.22: Chủng vi khuẩn B8.3 15 Hình 3.23: Chủng vi khuẩn N2.1 Hình 3.24: Chủng vi khuẩn N2.3 3.2 Đặc điểm hình thái sinh học chủng vi sinh vật có hiệu lực cao 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật có hiệu lực cao 3.2.1.1 Đặc điểm hình thái nấm cộng sinh có hiệu lực cộng sinh cao Đặc điểm lồi P tinctorius hình cầu gần cầu, có đường kính từ 2,9 -17,5 cm, bào tử có hình cầu, có gai xung quanh, kích thước bào tử 812µm (Hình 3.25) Nấm thường mọc tập trung 2- thể gần rừng thông, mọc cách gốc thông khoảng 1– 2m, rừng có độ tàn che tán 0,4 – 0,6 10 µm Hình 3.25 : Bào tử nấm P Hình 3.26: Thể nấm P.tinctorius tinctorius 3.2.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn hiệu lực cao Từ phương pháp trình bày chủng vi khuẩn thử nghiệm gram, nhuộm tế bào mơ tả hình ảnh đo kích thước kết trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6: Hình thái tế bào gram chủng vi khuẩn có ích STT Chủng Gram QI1 QI8 QI16 QI24 + - N2.1 - N2.3 V3.2 V4.2 + - Hình dạng tế bào Kích thước tế bào (µm) Hình que dài, có râu đầu, bên đầu nhọn 1,4 x 4,1 Hình hạt gạo dài, đầu bằng, đầu nhọn 1,6 x 2,7 Hình que ngắn, hai đầu tế bào 1,8 x 2,8 Hình que ngắn, có lớp dịnh nhày, hai đầu 0,9 x 2,2 Hình que dài, có lớp lông mịn bao phủ, bên đầu 1,1 x 3,1 nhọn, bên đầu Hình hạt gạo ngắn, hai đầu tế bào 1,8 x 2,8 Hình que cong cong, đầu nhọn 0,7 x 1,5 Hình que dài, hai bên đầu bằng, phình to 0,9 x 3,2 3.2.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật có hiệu lực cao 3.2.2.1 Ảnh hưởng môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Chủng QI1 đạt mật độ tế bào hữu hiệu cực đại 5,7 x 10 (CFU/ml) hàm lượng IAA sinh cao đạt 12,52mg/l nuôi cấy môi trường gỉ đường Tuy nhiên chủng QI8 phát triển tốt môi trường GPB 16 đạt mật độ tế bào tối ưu 4,1 x 10 (CFU/ml) hàmlượng IAA sinh cao đạt 12,52mg/l Tuy mật độ tế bào tối ưu chủng QI8 phát triển (đạt 72%) so với mật độ tối đa chủng QI1 3.2.2.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào chủng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ Chủng QI16 QI24 đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ thông đưa vào nghiên cứu, Chủng QI16, đạt mật độ tế bào 4,2 x 108 (CFU/ml) nuôi cấy môi trường PD Chủng QI24 phát triển tốt môi trường (PD) đạt mật độ tế bào 5,6 x 108 (CFU/ml), chủng QI16 QI24 phát triển tốt mơi trường PD chủng QI24 có khả phát triển vượt trội 3.2.2.3 Ảnh hưởng môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan Chủng N2.1 phát triển tốt môi trường, điều chứng tỏ chủng dễ nuôi cấy thích nghi với nhiều loại mơi trường khác Tuy nhiên chúng đạt mật độ tế bào đạt cực đại nuôi môi trường Pikoskaya, mật độ tế bào 16,7 x 10 CFU/ml, mật độ môi trường PD chúng đạt 9,4 x 108 CFU/ml (mật độ đạt khoảng 55% so với môi trường 3) 3.2.2.4 Ảnh hưởng môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào vi khuẩn cố định N2 Chủng V4.2 nuôi môi trường PD mật độ tế bào đạt 8,4 x 10 CFU/ml (chỉ 57%) nuôi cấy môi trường (Môi trường NFMN) mật độ tế bào tối đa 14,6 x 108 CFU/ml Chủng V3.2 đạt mật độ tế bào tối đa nuôi môi trường NFMN mật độ tế bào tối đa 80% tế bào tối đa chủng V4.2 3.2.2.5 Ảnh hưởng thời gian nhân sinh khối đến mật độ tế bào vi khuẩn Sau 72 có chủng đạt mật độ tế bào tối đa chủng QI16, QI24, V2.1, V2.3, với mật độ tế bào hữu đạt từ 4,8 – 9,8 x 108 CFU/ml, sau mật độ tế bào giảm nhẹ sau ngày thứ thứ (144 giờ) 3,8 – 7,2 x 107 CFU/ml 3.2.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào VK Chủng QI1 nhiệt độ tối thích 250C chúng phát triển gấp 200 lần so với nuôi 170C độ mật tế bào tối đa đạt 4,8 x 10 CFU/ml Chủng QI8 phát triển tốt đạt tế bào cực đại nuôi điều kiên 25 0C, nhiên mật độ tế bào thấp so với chủng QI1 Vì chủng QI1 lựa chọn tốt để đưa vào nghiên cứu sản xuất chế phẩm đa chủng VSV Chủng QI16 chủng QI24 phát triển tốt nuôi khoảng nhiệt độ 250C - 270C Chủng QI16 có số lượng tế bào tối đa cao chủng QI24, nhiên chủng QI24 lại có biên độ phát triển rộng, phát triển tốt chủng QI16 Chủng QI24 kháng nấm gây bệnh lựa chọn vào sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng Chủng N2.1 đạt mật độ tế bào tối thích chúng ni điều kiện mơi trường 270C Trong chủng N2.3 đạt mật độ tế bào tối đa chúng nuôi điều kiện mơi trường 250C Chủng V4.2 có biên độ nhiệt độ lớn, chúng phát triển tốt dải nhiệt độ từ 250C - 330C Trong chủng V3.2, phát triển tốt thấp chủng V4.2 Chủng V4.2 lựa chọn đưa vào sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng 17 3.2.2.7 Ảnh hưởng độ pH môi trường nhân sinh khối đếnmật độ tế bào VK Chủng QI1 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= – 7,5 mật độ tế bào đạt cực đại 5,8 – 6,2 x 108 CFU/ml, chủng QI8 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= – 7,5 mật độ tế bào đạt cực đại 5,5 – 5,8 x 108 CFU/ml, chúng có xu hướng phù hợp pH = 7,5 Chủng QI16 QI24 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= mật độ tế bào đạt cực đại 7,2 – 9,8 x 108 CFU/ml Tuy nhiên chủng QI24 có biên độ thích hợp với dải pH rộng Chủng N2.1 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= 6,5 mật độ tế bào đạt cực đại 6,7 x 107 CFU/ml Chủng N2.3 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= mật độ tế bào đạt cực đại 5,8 x 108 CFU/ml Chủng V2.3 V4.2 đạt mật độ tế bào cực đại nuôi độ pH= mật độ tế bào đạt cực đại 6,3 – 6,8 x 108 CFU/ml 3.2.3 Định danh đến lồi chủng VSV có hoạt tính cao Thí nghiệm thực phương pháp sinh học phân tử phịng thí nghiệm vi sinh, Viện Nghiên cứu Công nghệ Thực phẩm DNA chủng vi khuẩn (QI1, QI24, N2.1, V4.2) tách chiết, phân đoạn 16S rDNA vi khuẩn khuyếch đại PCR cặp mồi 16S-8F 16S1510R DNA phân đoạn 16S giải trình tự phương pháp ‘dideoxy chain termination’, chuỗi DNA chủng VSV so sánh độ tương đồng với chuỗi DNA chủng vi sinh vật khác ngân hàng Gen (Genbank) Bảng 3.7: Xác định tên chủng VSVdựa trình tự phân đoạn 16S rDNA Mã số Độ tương đồng Genbank TT Chủng Loài QI1 GU198115 100% (821/821 bp) QI24 EU557030 100% (793/793 bp) N2.1 CP000959 100% (795/795 bp) V4.2 EF100165 99.5% (791/795bp) Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Burkholderia cenocepacia Azotobacter beijerinskii Dữ liệu FIRI1 VT320 VT322 VT323 VT324 Qua Bảng 3.7 cho thấy, chủng QI1 có trình tự ADN tương đồng 100% với trình tự ADN mã số genbank GU198115 lồi Pseudomonas fluorescens Chủng QI24 có trình tự ADN tương đồng 100% với trình tự ADN mã số genbank EU557030 lồi Bacillus subtilis Chủng N2.1 có trình tự ADN tương đồng 100% với trình tự ADN mã số genbank CP000959 loài Burkholderia cenocepacia Chủng V4.2 có trình tự ADN tương đồng 99.5% với trình tự ADN mã số genbank EF100165 loài Azotobacter beijerinskii 18 Hình 3.27: KL chủng (QI1) P.fluorescens Hình 3.33: Khuẩn lạc chủng (N2.1) B.cenocepacia Hình 3.28:Tế bào chủng (QI1) P fluorescens Hình 3.29: Tế Hình 3.30: KL Hình 3.31: TB bào chủng chủng chủng (QI24) (QI1) (QI24) B subtilis P.fluorescens B subtilis Hình 3.34: Tế Hình 3.35: TB bào chủng (N2.1) (N2.1) B.cenocepacia B.cenocepacia Hình 3.36: Hình 3.37: Tế Khuẩn lạc bào chủng chủng (V4.2) (V4.2) A.beijerinskii A beijerinskii Hình 3.32: TB chủng (QI24) B subtilis Hình 3.38: Tế bào chủng (V4.2) A beijerinskii 3.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm đa chủng VSV 3.3.1 Kết nghiên cứu tương tác VK hỗn hợp Các chủng VSV tồn phát triển bình thường mơi trường ni cấy, đường kính khuẩn lạc chủng đạt mức độ cao sau ngày ni cấy Tuy nhiên, có chủng vi khuẩn phát triển mạnh chủng lại, chủng vi khuẩn cố định nitơ Azotobacter beijerinskii phát triển mạnh đường kính khuẩn lạc chúng lớn đạt 26,23 sau ngày nuôi cấy Các chủng vi khuẩn khác phát triển tốt cấy vạch trên mơi đĩa mơi trường (Hình 3.39) Hình 3.39 Hình ảnh chủng VK tồn phát triển môi trường 3.3.2 Kết nghiên cứu xác định giá thể tạo chế phẩm - Công thức chất mang phù hợp để sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng cho thông rừng trồng cơng thức 2: Với 10kg ngun liệu 35% bột apatit, 35% mùn, 10% potassium polyacrylamide, 20% tổng số loại VSV (trong 0,05% bào tử hữu tính nấm P tinctorius, 5% sinh khối dung dịch VSV sinh IAA QI1, 5% sinh khối dung dịch VSV phân giải phốt phát khó tan N2.1, 5% sinh khối dung dịch VSV đối kháng với nấm bệnh thối cổ rễ thông QI24 5% sinh khối dung dịch VSV cố định nitơ V4.2) - Chế phẩm vi sinh vật đa chủng dùng cho vườn ươm công thức 2: Với 10kg nguyên liệu 40% bột apatit, 40% mùn, 20% tổng số loại VSV (trong 0,05% bào tử hữu tính nấm P tinctorius, 5% dung dịch VSV sinh IAA QI1, 5% dung dịch VSV phân giải phốt phát khó tan N2.1, 5% dung dịch VSV đối kháng với nấm bệnh thối cổ rễ thông QI24 5% dung dịch VSV cố định nitơ V4.2) 3.3.3 Kết nghiên cứu hoạt tính chủng VSV chế phẩm Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn có hoạt lực giảm nhẹ dần theo thời gian Như chủng B cenocepacia (N2.1) phân giải phốt phát khó tan, sau tuần 19 đường kính vịng phân giải đạt 20,2 mm, nồng độ lân dễtiêu đạt 312,12 ppm chứng tỏ chúng có khả phân giải phốt phát khó tan mạnh Chủng vi khuẩn P.fluorescens (QI1) sinh tổng hợp IAA, có kết tổng hợp IAA cao đạt 9,718 mg/l, thời gian tháng, khả tổng hợp IAA chúng tốt 3.3.4 Kết nghiên cứu thời gian bảo quản chế phẩm Khi bảo quản chế phẩm đa chủng VSV hai thang nhiệt độ khác nhiệt độ phòng điều kiện nhiệt độ phòng từ 15 – 20 0C nhiệt độ phòng, mật độ tế bào hữu hiệu chủng vi sinh vật nhìn chung thay đổi sau thời gian bảo quản khác có giảm nhẹ sau tháng bảo quản Hình 3.40: Quy trình SX CP VSV đa chủng để gieo ươm trồng Thông nhựa Nguyên liệu thô Nguyên liệu thô NCS Chất giữ ẩm Chất giữ ẩm NCS P tinctorius P tinctorius Chủng QI1 Chủng QI24 Chủng N2.1 Chủng V4.2 Chủng QI1 Chủng QI24 Chủng N2.1 Chủng V4.2 Bước Bước Cân nghiền nguyên liệu thô Cân nghiền nguyên liệu thô Nhân sinh khối VK Nhân sinh khối VK Bước Bước Sấy bột thô nguyê n liệu Sấy bột nguyê n liệu Dung dịch sinh khối loại vi khuẩn Dung dịch sinh khối loại vi khuẩn thô Bước Phối trộn hỗn hợp Phối trộn hỗn hợp Bước Đóng gói bảo quản Đóng gói bảo quản Bước Hình 3.41: Chế phẩm đa CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐA CHỦNG chủng vi sinh vật 3.4 Kết ảnh hưởng CP VSV đa chủng tới Thơng nhựa đất thối hố 3.4.1 Hiệu chế phẩm vi sinh vật đa chủng tới Thông nhựa 3.4.1.1 Hiệu chế phẩm vi sinh vật đa chủng tới Thông nhựa vườn ươm CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐA CHỦNG Số liệu đo đếm chiều cao, đường kính gốc, tỷ lệ bị bệnh, tỷ lệ cộng sinh Thơng nhựa kết trình bày Bảng 3.8 Bảng 3.8: Hiệu CP VSV đến sinh trưởng Thông nhựa vườn ươm ST Cơng Sau tháng T thức thí Hvn Dg Sau tháng Hvn Dg Sau tháng Hvn Dg 20 Sau tháng Hvn Dg TLB TB TLCS TB nghiệm (cm) (mm) (cm) CT1 đ/c 5,95 1,22 CT 6,43 1,32 CT 7,14 1,74 CT 6,94 1,34 MF1 6,85 1,41 TB 6,66 1,41 Lsd 1,73 0,72 Fpr 0,050 0,080 7,88 9,88 11,58 10,05 10,15 9,91 1,50 0,05 (mm) 1,66 1,92 2,24 2,04 1,91 1,96 0,42 0,05 (cm) (mm) (cm) (mm) tháng tháng (%) (%) 12,28 2,26 17,43 2,95 22,2 23,5 16,78 2,92 20,63 3,12 4,62 89,5 18,38 3,57 22,54 4,12 3,10 90,0 16,55 3,06 19,85 3,59 4,21 85,6 16,65 3,11 19,78 3,48 3,42 85,1 16,13 2,99 20,05 3,45 7,51 40,6 0,17 0,12 0,27 0,32 1,72 2,36