Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CĨ ĐẶC TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ TÁC ĐỘNG ĐẾN BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG MẶN CỦA CÂY LÚA LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CÓ ĐẶC TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ TÁC ĐỘNG ĐẾN BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG MẶN CỦA CÂY LÚA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Nguyễn Huy Hoàng PGS TS Đỗ Hữu Nghị Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu tơi thực Các kết luận án đƣợc thể trung thực, phần kết luận án đƣợc cơng bố tạp trí khoa học chun ngành với đồng thuận xác nhận đồng tác giả Một phần kết lại chƣa đƣợc cơng bố tài liệu, tạp chí khác Tác giả luận án NCS Vũ Văn Dũng i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin đƣợc gửi lòng biết ơn đến hai ngƣời thầy GS.TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trƣởng Viện Nghiên cứu hệ gen PGS.TS Đỗ Hữu Nghị, Phó viện trƣởng Viện Hố học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận án Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn cán Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ hƣớng dẫn tận tình trình học tập thực luận án Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi mặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để hoàn thành chƣơng trình học luận án Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, tập thể cán giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập thực luận án Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Đảng uỷ, Lãnh đạo Viện Hố họcVật liệu Phịng Hố học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hoá học- Vật liệu, Viện Khoa học Công nghệ quân cho phép, tạo điều kiện thời gian, thiết bị nghiên cứu động viên tinh thần suốt thời gian thực luận án Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gia đình, ngƣời thân bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ trình học tập thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Vũ Văn Dũng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1 Tổng quan vi sinh vật k ch th ch sinh trƣởng thực vật 1.1.1 Khái niệm vi sinh vật k ch th ch sinh trƣởng thực vật 1.1.2 Đặc điểm vi sinh vật k ch th ch sinh trƣởng thực vật 1.1.2.1 Khả cố định nitơ 1.1.2.2 Khả hòa tan phosphate 1.1.2.3 Khả sinh tổng hợp IAA .8 1.1.2.4 Khả sinh ACC deaminase 10 1.1.2.5 Khả sinh siderophores 11 1.2 Vi sinh vật chịu mặn chế hỗ trợ thực vật chịu mặn nhờ PGPB 12 1.2.1 Vi sinh vật chịu mặn .12 1.2.2 Cơ chế hỗ trợ thực vật chịu mặn nhờ PGPB 13 1.2.2.1 T ch l y chất th m thấu 14 1.2.2.2 Cải thiện hấp thu chất dinh dƣỡng 14 1.2.2.3 Sinh tổng hợp IAA .15 1.2.2.4 Sinh tổng hợp ACC deaminase 16 1.2.2.5 Exo-polysaccharide 16 1.2.2.6 Hoạt hóa hệ enzyme chống oxi hóa 17 1.2.2.7 Tăng cƣờng biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn 17 1.3 Sự đáp ứng với stress mặn lúa 18 1.3.1 Ảnh hƣởng stress mặn lên lúa 18 1.3.2 Cơ chế dung nạp muối lúa 19 1.3.2.1 Cân nội môi ion 19 1.3.2.2 Cân nội môi ion 21 1.4 Tình hình nghiên cứu PGPB hỗ trợ trồng chịu mặn .25 iii 1.4.1 Trên giới 25 1.4.2 Tại Việt Nam 31 1.5 Phƣơng pháp phân t ch hệ gen công nghệ giải trình tự gen hệ 32 CHƢƠNG V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P 35 2.1 Nguyên vật liệu 35 2.1.1 Nguyên liệu 35 2.1.2 Hóa chất, môi trƣờng thiết bị 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 387 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 38 2.2.2 Phân lập chủng vi khu n chịu mặn 38 2.2.3 Sàng lọc chủng vi khu n có khả sinh IAA 39 2.2.4 Sàng lọc chủng vi khu n có khả tổng hợp ACC deaminase 39 2.2.5 Sàng lọc chủng vi khu n có khả phân giải phosphate 40 2.2.6 Sàng lọc chủng vi khu n có khả cố định nitơ 40 2.2.7 Sàng lọc chủng vi khu n có khả phân hủy cellulose .40 2.2.8 Khả sinh siderophores 41 2.2.9 Phân loại vi sinh vật 41 2.2.9.1 Xác định số đặc điểm hình thái sinh hố 41 2.2.9.2 Phƣơng pháp giải trình tự 16S rRNA 42 2.2.10 Ảnh hƣởng số yếu tố đến sinh trƣởng tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 43 2.2.10.1 Ảnh hƣởng pH nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng vi khu n chọn lọc 43 2.2.10.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến sinh trƣởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc 43 2.2.10.3 Ảnh hƣởng nồng độ L-tryptophan đến sinh trƣởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc 43 2.2.10.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến sinh trƣởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc 44 2.2.10.5 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến sinh trƣởng tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 44 2.2.11 Phƣơng pháp xác định chlorophyll lúa 44 iv 2.2.12 Đánh giá khả làm giảm tác động stress mặn lúa chủng vi khu n chọn lọc 44 2.2.13 Đánh giá biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa dƣới hỗ trợ chủng vi khu n chọn lọc 45 2.2.13.1 Tách chiết RNA tổng hợp cDNA 46 2.2.13.2 Kỹ thuật RT-PCR .46 2.2.14 Phân tích hệ gen chủng vi khu n chọn lọc phƣơng pháp giải trình tự gen hệ .48 2.2.14.1 Tách chiết, tinh tạo thƣ viện DNA 48 2.2.14.2 Phân tích hệ gen vi khu n 49 2.2.15 Phân tích thống kê .50 2.2.16 Địa điểm nghiên cứu 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 51 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khu n có khả chịu mặn sinh chất k ch th ch sinh trƣởng thực vật .51 3.1.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khu n sinh IAA 51 3.1.2 Sàng lọc chủng vi khu n sinh ACC deaminase 53 3.1.3 Sàng lọc chủng vi khu n có hoạt tính cố định nitơ 55 3.1.4 Sàng lọc chủng vi khu n hoà tan phosphate 56 3.1.5 Sàng lọc chủng vi khu n phân giải cellulose 58 3.2 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh hố giải trình tự 16S rRNA 61 3.2.1 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái chủng vi khu n chọn lọc 61 3.2.2 Xác định số đặc điểm sinh hóa chủng vi khu n chọn lọc 65 3.2.3 Giải trình tự 16S rRNA chủng chọn lọc xây dựng phát sinh chủng loài 66 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng tổng hợp IAA số chủng vi khu n chọn lọc 71 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến khả sinh trƣởng chủng vi khu n chọn lọc 71 3.3.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh trƣởng tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 72 3.3.3 Ảnh hƣởng L-trytophan đến đến khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 74 v 3.3.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả sinh trƣởng tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 75 3.3.5 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp IAA chủng vi khu n chọn lọc 77 3.4 Đánh giá khả hỗ trợ lúa chịu mặn số chủng vi khu n chọn lọc 80 3.4.1 Lựa chọn nồng độ muối để gây stress mặn lúa 80 3.4.2 Đánh giá khả hỗ trợ lúa chịu mặn số chủng vi khu n chọn lọc 81 3.5 Nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa dƣới hỗ trợ chủng RL7 DM10 .86 3.5 Ảnh hƣởng chủng RL7 DM10 đến sinh trƣởng lúa bị nhiễm mặn86 3.5.1.1 Ảnh hƣởng chủng RL7 86 3.5.1.2 Ảnh hƣởng chủng DM10 88 3.5.2 Nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa dƣới hỗ trợ chủng RL7 DM10 91 3.5.2.1 Sự biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa dƣới hỗ trợ chủng RL7 91 3.5.2.2 Sự biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa dƣới hỗ trợ chủng DM10 .92 3.6 Giải trình tự hệ gen số chủng chọn lọc .96 3.6.1 Lắp ráp đoạn trình tự giải chức 96 3.6.2 Phân loại dựa số tƣơng đồng toàn hệ gen 96 3.6.3 Phân loại nhóm gen chức .97 3.6.4 Gen liên quan đến khả k ch th ch sinh trƣởng thực vật .99 3.6.5 Gen liên quan đến khả chịu mặn 103 3.6.6 Các gen liên quan đến hệ thống tiết 104 3.6.7 Các gen liên quan đến trình nội sinh 105 KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ 106 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO .108 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tên tiếng việt ABA Acid abscisic ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACCD ACC deaminase APX Ascorbate peroxidase AREB ABA-responsive element ATP Adenosine triphosphate BADH Betaine aldehyde dehydrogenase BZ8 Aba responsive bZIP protein CAT Catalase CDPK Ca2+ dependent protein kinase CDS Coding DNA sequence DM Dworkin and Foster salts media DNA Deoxyribonucleic acid DREB EPS Dehydration responsive element-binding protein Exo-polysaccharide EREBP1 Ethylene responsive element binding protein GIG Gigantea GPX Glutathion peroxidase GR Glutathion reductase GST Glutathion stranferase HDAC Histone deacetylases HKT K+/Na+ transpoter IAA 3-Indole acetic acid LB Luria Broth LEAP Late embryogenesis abundant proteins LYSO Lysophospholipase MAPK5 Mitogen activated protein kinase MYC Myelocytomatosis oncogenes vii NA Nutrien agar NADP-ME2 Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-malic enzyme NCED 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase NHX Sodium proton antiporter P5CS Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthas PBZ Probenazole PGPB Plant growth promoting bacteria Vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật POX Peroxidase PR Pathogenesis-related protein RLK Receptor-like kinases RNA Ribonucleic acid ROS Reactive oxygen species RT-PCR Realtime-Polymerase chain reaction SAPK Serine/threonine-protein kinase SERK Somatic embryogenesis receptor kinase SnRK sucrose non-fermentation-related protein Các chất oxi hoá kinase SOD Superoxide dismutase SOS Salt-overly-sensitive TF Transcription factor Nhân tố mã viii