Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus hiv

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THỊNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN CỬU KHOA TS HỒ VIỆT ANH Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Cơng trình thực Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn khoa học GS TS Nguyễn Cửu Khoa TS Hồ Việt Anh Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực, hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận án cấp khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thịnh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Cửu Khoa TS Hồ Việt Anh định hướng khoa học, giúp đỡ tận tình động viên suốt trình thực luận án Xin gửi đến Thầy Cô lời biết ơn chân thành Tôi xin cảm ơn đến Học Viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện cho suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn hỗ trợ Anh Chị Em Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam q trình thực luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi PGS.TS Trần Việt Hùng toàn thể Anh Chị, Em đồng nghiệp Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Sau cùng, tơi xin cảm ơn thực quên giúp đỡ tận tình gia đình, bạn bè, anh em xa gần động viên, tạo điều kiện suốt trình tơi hồn thành luận án Tác giả Nguyễn Thị Thịnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ x DANH MỤC PHỤ LỤC xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu luận án Đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN Virus HIV/AIDS thuốc điều trị 1.1 1.1.1 Virus HIV/AIDS 1.1.2 Lịch sử phát triển liệu pháp điều trị HIV/AIDS 1.1.3 Cơ chế tác động thuốc điều trị HIV 1.1.3.1 Lamivudin 1.1.3.2 Zidovudin 1.1.3.3 Tenofovir disoproxil fumarat 1.1.3.4 Ritonavir 1.1.4 Liệu pháp điều trị ARV kết hợp 10 1.1.5 Những tồn liệu pháp kháng HIV thông thường 12 1.2 Giải pháp thuốc phóng thích kéo dài 15 1.2.1 Ưu điểm phóng thích kéo dài 17 1.2.2 Nhược điểm phóng thích kéo dài 17 Các chiến lược điều trị HIV hướng đến 17 1.3 1.3.1 Thuốc hướng đích 17 1.3.2 Thuốc có tác dụng kéo dài 20 1.3.3 Vacccin điều trị 24 1.4 Dendrimer PAMAM biến tính tiềm mang thuốc 24 1.5 Các tác nhân biến tính 26 1.5.1 Poly(ethylen glycol), PEG dẫn xuất methoxy poly(ethylen glycol), mPEG 26 1.5.2 Pluronic 30 iii 1.6 Tình hình nghiên cứu thuốc ARV sử dụng chất mang nano 32 1.6.1 Thế giới 32 1.6.2 Trong nước 33 2.1 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2 Nguyên liệu - hóa chất, dụng cụ - thiết bị 37 2.1.1 Nguyên liệu - hóa chất 37 2.1.2 Dụng cụ - thiết bị 38 2.3 Tổng hợp dendrimer PAMAM 39 2.3.1 2.3.1.1 Tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 39 Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5, G0.5, G1.5 G2.5 40 41 2.3.1.2 2.3.2 Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0, G1.0, G2.0 G3.0 41 Biến tính PAMAM dendrimer 43 2.3.2.1 Chuẩn bị tác nhân biến tính 43 2.3.2.2 Tổng hợp PAMAM dendrimer biến tính 47 2.4 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định ARV 49 2.4.1 Xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF VÀ RTV 50 2.4.1.1 Xác định AZT, 3TC xác định đồng thời AZT, 3TC 50 2.4.1.2 Xác định TDF, RTV xác định đồng thời TDF RTV 51 2.4.2 Thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF RTV 52 2.4.2.1 Tính tương thích hệ thống HPLC 53 2.4.2.2 Tính đặc hiệu, LOD LOQ 53 2.4.2.3 Tính tuyến tính 54 2.4.2.4 Độ 54 2.4.2.5 Độ xác 54 2.4.2.6 Khoảng xác định 55 2.5 Tạo hệ dẫn truyền thuốc nano 55 2.5.1 Chuẩn bị dung dịch hoạt chất 56 2.5.2 Chuẩn bị dung dịch hệ G3.0@mPEG G3.0@F127 56 2.5.3 Dẫn truyền hoạt chất 56 2.5.4 Loại hoạt chất tự 57 2.5.5 Đông khô 57 2.6 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro thử hoạt tính sinh học 57 2.6.1 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất 57 2.6.2 Thử hoạt tính sinh học 58 2.6.2.1 Thử độc tính tế bào 58 2.6.2.2 Thử hoạt tính ức chế pepsin 59 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 62 iv 3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM THẾ HỆ G-0.5 - G3.0 62 3.1.1 Phổ hồng ngoại FTIR 62 3.1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 63 3.1.3 Phổ khối lượng MS sắc ký lọc gel GPC 65 3.1.4 Tính tốn khối lượng phân tử dendrimer PAMAM phổ 1H-NMR 67 3.1.5 Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM 69 3.2 BIẾN TÍNH PAMAM DENDRIMER G3.0 VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127 69 3.2.1 Hình thái, kích thước 69 3.2.2 Phổ hồng ngoại FTIR 71 3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 72 3.3 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 75 3.3.1 Tính tương thích hệ thống sắc ký 75 3.3.2 Tính đặc hiệu 75 3.3.3 Tính tuyến tính 76 3.3.4 Độ xác 77 3.3.4.1 Độ lặp 77 3.3.4.2 Độ xác trung gian 78 3.3.5 3.4 Độ 78 KẾT QUẢ DẪN TRUYỀN HÓA HOẠT CHẤT 80 3.4.1 Kết dẫn truyền hóa hoạt chất tạo hệ dẫn truyền thuốc đơn 80 3.4.1.1 Hình thái, kích thước 80 3.4.1.2 Phổ hồng ngoại FTIR 82 3.4.1.3 Kết dẫn truyền hoạt chất đơn 85 3.4.2 3.5 Kết dẫn truyền hóa hoạt chất kết hợp 88 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG HOẠT CHẤT 90 3.5.1 Kết giải phóng hoạt chất hệ dẫn truyền thuốc đơn 90 3.5.2 Kết giải phóng hoạt chất hệ dẫn truyền thuốc kết hợp 94 3.6 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 99 3.6.1 Kết thử độc tính tế bào 99 3.6.2 Kết thử hoạt tính ức chế pepsin 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 KẾT LUẬN 107 KIẾN NGHỊ 108 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC 122 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Từ viết tắt ART Anti-retroviral therapy, Liệu pháp kháng virus 3TC Lamivudin, thuốc điều trị HIV AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome, Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ARV Antiretroviral, Thuốc kháng HIV AZT Zidovudin, thuốc điều trị HIV CM Chất mang d4T Stavudine, Thuốc điều trị HIV DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium, môi trường DMEM DLS Dynamic Light Scattering EDA Ethylene diamin EI&FI Entry/fusion inhibitor, Nhóm ức chế hịa màng/xâm nhập FDA Food and Drug Administration, Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ FTIR Fourier transform infared spectroscopy, Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier GHO Global Health Observatory, Đài Quan sát sức khỏe toàn cầu GPC Gel permeation chromatography, Sắc ký lọc gel HIV Human Immunodeficiency Virus, Virus suy giảm miễn dịch người HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1, Virus suy giảm miễn dịch người loại HPLC High-performance liquid chromatography, sắc ký lỏng hiệu cao IC50 Half maximal inhibitory concentration, Nồng độ ức chế 50 % INSTI Integrase inhibitor resistance, Nhóm ức chế enzyme tích hợp MA Methylacrylat mPEG Methoxy poly(ethylen glycol) NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân vi NNRTI Tenofovir disoproxil fumarat, thuốc điều trị HIV NPC p-nitrophenyl cloroformat NRTI Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitors, Nhóm ức chế enzym chép ngược tương tự nucleotid PAMAM Polyamidoamin PEG Polyethylen glycol PI Protease inhibitor, Nhóm ức chế men protease PR Protease, Enzyme protease RT Reverse transcriptase, Men chép ngược RTV Ritonavir, thuốc điều trị HIV T-BĐ Thuốc ban đầu TDF Tenofovir disoproxil fumarate, thuốc điều trị HIV TGA Thermal Gravimetry Analysis T-NH Thuốc dẫn truyền hóa T-TD Thuốc tự USP United State Pharmacopeia, Dược điển Mỹ WHO World Health Organization, Tổ chức Y tế Thế giới vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loại thuốc PEG hóa FDA chấp thuận 28 Bảng 1.2 Đặc tính chất đồng trùng hợp khối pluronic 31 Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 37 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ - thiết bị 38 Bảng 2.3 Tổng hợp dendrimer PAMAM hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5) 40 Bảng Tổng hợp dendrimer PAMAM hệ lẻ (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0) 41 Bảng 2.5 Thành phần khối lượng chất tham gia phản ứng tổng hợp G3.0-PEG 49 Bảng 2.6 Thành phần khối lượng chất tham gia phản ứng tổng hợp G3.0@F127 49 Bảng 2.7 Trình tự thực thử hoạt tính ức chế pepsin 61 Bảng 3.1 Tần số hấp thụ phổ FTIR dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến G3.0 62 Bảng Dữ liệu phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến G3.0 64 Bảng 3.3 Khối lượng phân tử PAMAM theo MS 66 Bảng 3.4 Khối lượng phân tử PAMAM theo GPC 66 Bảng 3.5 Khối lượng phân tử PAMAM tính theo 1H-NMR 67 Bảng Khối lượng phân tử PAMAM tổng hợp so với cấu trúc PAMAM theo lý thuyết 68 Bảng 3.7 Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 69 Bảng 3.8 Tần số hấp thụ phổ FTIR dendrimer PAMAM G3.0, mPEG-NPC, G3.0@mPEG, NPC-F127-OH G3.0@F127 72 Bảng 3.9 Tính tương thích hệ thống sắc ký xác định AZT, 3TC 75 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính tuyến tính AZT 76 Bảng 3.11 Kết khảo sát tính tuyến tính 3TC 77 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp AZT, 3TC 77 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ xác trung gian AZT, 3TC 78 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ AZT 78 139 PHỤ LỤC PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM BIẾN TÍNH VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127 Phổ 1H-NMR mPEG-NPC 140 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@mPEG 141 Phổ GPC dendrimer PAMAM G3.0@mPEG 142 Phổ 1H-NMR HO-F127-NPC 143 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@F127 144 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TDF, RTV VÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TDF, RTV Tính tuyến tính Kết khảo sát tính tuyến tính TDF Nồng độ C (µg/ml) 2,72 67,93 135,87 271,74 407,61 Diện tích pic S 13989 309796 738331 1468549 2167338 (mAu.s) 2500000 ŷ = 5385,8396x – 14622,2039 y = 5385.840x - 14622.204 R² = 00.999 2000000 Diện tích pic Phương trình hồi qui 1500000 1000000 500000 Hệ số tương quan r = 0,9995 - 100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml) Kết khảo sát tính tuyến tính RTV Nồng độ C (µg/ml) 2,63 65,67 131,34 262,68 394,02 Diện tích pic S 16839 469233 942161 1881293 2827375 (mAu.s) ŷ = 7178,0380x - 1983,4253 3000000 y = 7178.038x - 1983.425 R² = 01.000 2500000 2000000 1500000 Diện tích pic Phương trình hồi qui 1000000 Hệ số tương quan r = 1,0000 500000 - 100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml) Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ chất phân tích diện tích pic đáp ứng khoảng nồng độ khảo sát hợp chất nghiên cứu Kết sử dụng làm sở cho nghiên cứu dẫn truyền hóa thuốc phóng thích thuốc in vitro 145 Độ xác Kết khảo sát độ lặp TDF RTV TDF Thử RTV Lượng cân Diện tích Hàm lượng Diện tích Hàm lượng g Pic (mAu.s) % Pic (mAu.s) % 0,0621 533105 8,04 943024 10,57 0,0630 549955 8,18 977888 10,81 0,0625 550793 8,26 977767 10,89 0,0628 550419 8,21 975882 10,82 0,0635 550231 8,12 976029 10,70 0,0620 549625 8,31 976219 10,96 Trung bình 8,19 10,79 RSD (%) 1,16 1,29 Kết khảo sát độ xác trung gian TDF RTV TDF Thử RTV Lượng cân Diện tích Hàm lượng Diện tích Hàm lượng g Pic (mAu.s) % Pic (mAu.s) % 0,0627 529766 7,99 936398 10,41 0,0632 529812 7,85 938480 10,36 0,0612 529294 8,10 938897 10,70 0,0615 529180 8,06 936405 10,62 0,0621 528635 7,98 938411 10,54 0,0628 529619 7,90 936538 10,40 Trung bình 7,98 10,50 RSD (%) 1,18 1,30 Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy phương pháp đạt độ xác có RSD < 2,0 % (n=12): TDF có RSD 1,18 % RTV có RSD 1,30 % 146 Độ Kết khảo sát độ TDF Diện tích Mức 80 % 100 % 120 % RSD Lượng Nồng pic Nồng độ Tỷ Trung chuẩn độ (mAu.s) chuẩn lệ bình thêm chuẩn tìm lại phục hồi mg µg/ml µg/ml % 10,85 107,96 589592 109,47 101,40 10,80 107,46 589229 109,40 101,81 10,91 108,55 589562 109,47 100,84 13,60 135,32 738154 137,05 101,28 13,58 135,12 740101 137,42 101,70 13,61 135,42 738387 137,10 101,24 16,32 162,38 883469 164,04 101,02 16,35 162,68 883046 163,96 100,78 16,37 162,88 883208 163,99 100,68 % % 101,35 0,48 101,41 0,25 100,82 0,17 RSD Kết khảo sát độ RTV Mức 80 % 100 % 120 % Lượng Nồng Diện tích Nồng độ Tỷ Trung chuẩn độ pic chuẩn lệ bình thêm chuẩn tìm lại phục hồi mg µg/ml µg/ml % 10,50 105,00 755329 105,23 100,22 10,55 105,50 753794 105,01 99,54 10,57 105,70 754826 105,16 99,49 13,20 132,00 945840 131,77 99,82 13,22 132,20 941420 131,15 99,21 13,25 132,50 942419 131,29 99,09 16,00 160,00 1129909 157,41 98,38 15,96 159,60 1130985 157,56 98,72 15,90 159,00 1130813 157,54 99,08 % % 99,75 0,41 99,37 0,40 98,73 0,35 147 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN AZT TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 148 149 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN 3TC TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 150 151 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN TDF TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 152 153 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN RTV TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127