TNU Journal of Science and Technology 228(01) 465 473 http //jst tnu edu vn 465 Email jst@tnu edu vn RESEARCH ON SOME CONDITIONS FOR CULTURING AND CARING FOR Dendrobium parishii IN VITRO Vu Thanh Sac,[.]
TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 RESEARCH ON SOME CONDITIONS FOR CULTURING AND CARING FOR Dendrobium parishii IN VITRO Vu Thanh Sac, Nguyen Thi Hai Yen* TNU - University of Sciences ARTICLE INFO Received: 02/10/2022 Revised: 30/01/2023 Published: 30/01/2023 KEYWORDS Dendrobium parishii In vitro Protocorm Planting material Plant nursery ABSTRACT Dendrobium is a genus of orchids with the second largest species diversity after the genus Bulbophyllum However, their value are much greater than that of the Orchid In the genus Dendrobium, there are many species that give beautiful and fragrant flowers One of these species, Hoang Thao Tram (Dendrobium parishii Rchb f (Orchidaceae)) is a species with a high attractive aroma which were confirmed by scientific studies on extracting the essential oil Currently, natural species D parishii in the forest is being seriously degraded due to overexploitation and uncontrolled exploitation while the quantity of industrially produced seed has not been effectively exploited The tissue of breeding to provide a source of plants for ornamental collection and essential oil extraction should be concerned In this study, some conditions for in vitro culture and care of D parishii seedlings at nursery stage were investigated The study results showed that the suitable clean seed protocorm generation medium of D parishii which was MS supplemented with BAP or kinetin 1.5 mg/l, the supplements included green banana, potato and carrot puree each 40 g/l The in vitro seedlings at the nursery stage are cared for in accordance with the following conditions: i) suitable in vitro seedling medium is coir; ii) planting density is tree/pot; iii) Initial watering with tap water and using 60% sun net to cover the plants NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NI CẤY VÀ CHĂM SĨC CÂY GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM LAN HOÀNG THẢO TRẦM (Dendrobium parishii) IN VITRO Vũ Thanh Sắc, Nguyễn Thị Hải Yến* Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên THÔNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 02/10/2022 Ngày hoàn thiện: 30/01/2023 Ngày đăng: 30/01/2023 TỪ KHĨA Hồng thảo trầm In vitro Protocorm Giá thể Vườn ươm TÓM TẮT Dendrobium (lan Hồng thảo) chi lan có độ đa dạng loài lớn thứ hai sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) có giá trị lớn lan Lọng nhiều Chi Hồng thảo có nhiều lồi cho hoa đẹp có hương thơm Hoàng thảo Trầm (lan Trầm - Dendrobium parishii Rchb f (Orchidaceae)) lồi có mùi thơm quyến rũ Vì vậy, có nhiều nghiên cứu tiến hành để tìm hiểu, tách chiết tinh dầu loại lan Hiện nay, Hoàng thảo rừng bị suy giảm nghiêm trọng khai thác mức khơng kiểm sốt; đó, lượng giống sản xuất công nghiệp chưa đáp ứng nhu cầu Vấn đề nhân giống để cung cấp nguồn giống cho sưu tầm làm cảnh chiết suất tinh dầu cần quan tâm Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát số điều kiện ni cấy in vitro chăm sóc D parishii giai đoạn vườn ươm Kết nghiên cứu cho thấy, môi trường phát sinh protocorm từ hạt phù hợp D parishii MS bổ sung BAP kinetin 1,5 mg/l, chất bổ sung gồm chuối xanh, khoai tây cà rốt nghiền loại 40 g/l Các điều kiện chăm sóc phù hợp với in vitro giai đoạn vườn ươm bao gồm: giá thể trồng in vitro phù hợp xơ dừa; mật độ trồng cây/bầu; tưới ban đầu nước máy ngày/lần sử dụng lưới 60% nắng để che cho DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.6579 * Corresponding author Email: yennth@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 465 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 Giới thiệu Dendrobium chi lớn thứ hai họ Lan (Orchidaceae), chi Lan có đa dạng hình thái Theo trang Thực vật giới trực tuyến (Plants of the World Online), có 1.556 lồi Dendrobium phân loại, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Sri Lanka, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Australia New Zealand [1] Ở Việt Nam, chi có 107 lồi thứ, phân bố rải rác từ Bắc vào Nam, vùng núi, số đảo vùng ven biển [2] Các loài chi Dendrobium có hoa đẹp ưa chuộng, ngồi nhiều lồi cịn có giá trị dược liệu.Theo tài liệu tham khảo trích dẫn thu thập từ năm 1970 đến năm 2020 từ website Internet Kiến thức Quốc gia Trung Quốc (Web of Science, China National Knowledge Internet - CNKI), SciFinder, Google Scholar…, người ta phát có 22 lồi Dendrobium Trung quốc có cơng dụng điều trị bệnh rối loạn da liễu 131 hợp chất từ Dendrobium báo cáo có tác dụng chống viêm nhiễm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống bệnh vẩy nến ức chế tyrosinase Các hợp chất có tính chất dược học tìm thấy lồi Dendrobium phenanthrenes, alkaloids, favonoid, phenylpropanoids lignans [3] Dendrobium parishii (Dendrobium parishii Rchb f (Orchidaceae) - Hoàng thảo trầm) loài lan biểu sinh, coi loài đặc hữu Thái Lan Đây lồi lan rừng có mùi thơm đặc biệt, Rchb.f mô tả khoa học năm 1863 Hồng thảo Trầm có nguồn gốc xuất xứ từ nhiều nơi chiếm số lượng chủ yếu vùng Đơng Nam Á, điển hình Lào Myama Ở Việt Nam, D parishii xuất chủ yếu Điện Biên, loài thuộc nhóm lan đa thân, thân mềm rủ xuống, thân nảy mầm từ gốc vào mùa xuân, hoa màu tím đậm, hoa vào mùa xuân - hạ thân năm trước đứng trút Lá mọc dạng so le cách từ – cm, dài – 10 cm rộng khoảng 2,5 - cm Đây loài lan đẹp thơm, ngồi D parishii cịn thu hái để sử dụng nguồn dược liệu có tác dụng mỹ phẩm chứa nhiều tinh dầu quý [4], [5] Hiện nay, D parishii rừng tự nhiên bị suy giảm số lượng nhanh chóng, có nguy cạn kiệt tuyệt chủng cao Tình trạng khai thác mức D parishii nói riêng lan rừng nói chung xảy khơng kiểm sốt nhiều nơi Hiện nay, tất loài lan rừng Việt Nam có tên danh mục sách đỏ, cần bảo vệ nghiêm ngặt [6] Do đó, việc bảo tồn nguồn gen tự nhiên nhân giống phục vụ nhu cầu người cần thiết Trong điều kiện tự nhiên, loài lan thường sinh sản thơng qua vơ tính cách tạo chồi, nhiên hệ số nhân giống thấp Sinh sản hữu tính xảy hạt lan khó nảy mầm tự nhiên khơng chứa nội nhũ, để nảy mầm hạt lan phải cộng sinh với số loại nấm phù hợp [7] Công nghệ sinh học ngày phát triển, việc nhân giống in vitro tỏ có hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều lồi thực vật nói chung lồi lan nói riêng Trên giới có nhiều cơng bố vi nhân giống lồi chi Dendrobium, điển hình loài Thạch hộc dùng làm thuốc (D candidum, D officinale) số loài lan rừng làm cảnh D lituiflorum, D primulinum, D crumenatum, D densiflorum [8] D chrysanthum [9] Ở Việt Nam, số công bố ghi nhận nhân giống số loài như: D officinale Kimura et Migo [10]; D lituiflorum [11], D heterocarpum Lindl [12] Các nghiên cứu chủ yếu tiến hành quy mơ phịng thí nghiệm, chưa cung cấp giống phục vụ thương mại bảo tồn Trong phạm vi nghiên cứu này, số điều kiện nuôi cấy in vitro chăm sóc giai đoạn vườn ươm loài lan Hoàng thảo Trầm (Dendrobium parishii Rchb f (Orchidaceae)) tiến hành với mục tiêu tìm điều kiện phù hợp nhân giống lan Hoàng thảo Trầm in vitro nhằm xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh để phục vụ bảo tồn phát triển loài lan rừng quý Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu http://jst.tnu.edu.vn 466 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 Quả Hồng thảo Trầm (Dendrobium parishii) có nguồn gốc từ huyện Mường Nhé - Điện Biên thu sau tháng kể từ có hoa (khoảng tháng 10 – 11) Quả sau thu thập bảo quản điều kiện thống mát với nhiệt độ khơng q 25oC lưu giữ ngăn mát tủ lạnh, sử dụng khoảng 10 ngày 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khử trùng tạo mẫu sạch bệnh đưa vào nuôi cấy Sử dụng dung dịch xà phịng lỗng để rửa bề mặt mẫu quả, sau đưa vào box cấy Tiến hành khử trùng theo bước: (1) lắc cồn 70% 30 giây; (2) lắc thủy ngân clorua 0,07% (HgCl2) với thời gian từ 10 phút; (3) Tráng lại nhiều lần nước cất vô trùng 2.2.2 Nghiên cứu phát sinh protocorm tạo hoàn chỉnh Quả sau khử trùng tách lấy hạt cấy lên môi trường tạo protocorm Môi trường nuôi cấy sử dụng thí nghiệm MS có bổ sung đường, aga số chất cần thiết khác (kích thích sinh trưởng, chất bổ sung) theo mục đích thí nghiệm [13] Nghiên cứu ảnh hưởng BAP kinetin đến khả phát sinh protocorm: Môi trường nuôi cấy sử dụng MS + 20 g/l saccharose + 8,0 g/l agar + g/l than hoạt tính (THT) bổ sung thêm BAP kinetin với công thức nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l tương ứng với chất Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng chất hữu bổ sung đến phát sinh protocorm - Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng chuối xanh nghiền đến phát sinh protocorm mẫu ni cấy Lấy kết tốt từ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng BAP kinetin đến phát sinh protocorm, sau bổ sung chuối xanh nghiền với hàm lượng khác nhau: CT1: 20 g/l; CT2: 30 g/l ; CT3: 40 g/l; CT4: 50 g/l - Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoai tây nghiền đến phát sinh protocorm Lấy kết tốt từ thí nghiệm bổ sung khoai tây nghiền với hàm lượng khác nhau: CT1: 30 g/l; CT2: 40 g/l; CT3: 50 g/l - Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng cà rốt nghiền đến phát sinh protocorm Lấy kết tốt từ thí nghiệm bổ sung cà rốt nghiền với hàm lượng khác nhau: CT1: 30 g/l; CT2: 40 g/l; CT3: 50 g/l; CT4: 60 g/l Tạo hoàn chỉnh từ chồi phát sinh: Các chồi phát sinh từ protocorm tách riêng lẻ cấy lên môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ 0,5 mg/l 2.2.3 Ra vườn ươm khảo sát điều kiện chăm sóc Cây sau ni cấy đạt đủ tiêu chuẩn (về chiều cao, số lá, số rễ) đưa điều kiện ngồi phịng ni cấy (1 tuần) Sau lấy khỏi bình, rửa rễ trồng vào giá thể thí nghiệm xử lý với chất diệt nấm Cây chăm sóc với điều kiện khác tùy thuộc mục đích thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng giá thể tới lan in vitro giai đoạn vườn ươm: Các giá thể thí nghiệm bố trí là: dớn, xơ dừa, rêu, than củi, vỏ thông Theo dõi sinh trưởng 30 ngày Các tiêu theo dõi bao gồm tỉ lệ sống trạng thái sinh trưởng - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng mật độ đến sinh trưởng lan in vitro giai đoạn vườn ươm: Cây bố trí trồng ngồi vườn ươm với mật độ cây/bầu; cây/bầu; cây/bầu; cây/bầu Theo dõi tỉ lệ sống trạng thái sinh trưởng - Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nước tưới đến lan in vitro giai đoạn vườn ươm: Bố trí thí nghiệm tưới với dung dịch nước dung dịch MS với công thức Nước máy; Nước máy + MS (tỷ lệ 2:1); Nước máy + MS (tỷ lệ 3:1); Nước máy + MS (tỷ lệ 4:1); Thí nghiệm tiến hành với trồng giá thể xơ dừa, với mật độ cây/bầu Theo dõi kết 30 ngày với tiêu bao gồm tỉ lệ sống trạng thái sinh trưởng http://jst.tnu.edu.vn 467 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến phát triển in vitro giai đoạn vườn ươm: Thay đổi chế độ chiếu sáng khác nhau: ánh sáng khuếch tán phòng; ánh sáng khuếch tán bóng râm (lưới 60% nắng); ánh sáng tự nhiên Thí nghiệm tiến hành với trồng giá thể xơ dừa, với mật độ cây/khóm, tưới nước máy ngày/lần Theo dõi kết 60 ngày với tiêu bao gồm tỉ lệ sống trạng thái sinh trưởng Xử lý số liệu: Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên lặp lại tùy thí nghiệm Số liệu thu thập xử lý Microsoft excel dạng giá trị trung bình độ lệch chuẩn Kết thảo luận 3.1 Kết khử trùng tạo mẫu bệnh tái sinh protocorm Quả lan sau thu giữ tươi tiến hành khử trùng theo bước trình bày mục 2.2.1 Theo dõi hạt mơi trường thí nghiệm sau gieo nhận thấy, tỉ lệ mẫu nhiễm (có thể HgCl2 có hiệu cao diệt nấm, khuẩn phù hợp với mẫu lan nuôi cấy) Quan sát nảy mầm hạt nhận thấy, tỷ lệ hạt nảy mầm khoảng thời gian khử trùng phút 15/19 bình thí nghiệm (chiếm 84,2%), với thời gian khử trùng 10 phút, bình mẫu khơng nhiễm đạt 10/14 (chiếm 78,57%) Sau gieo hạt khoảng 20 đến 30 ngày, hạt chuyển dần sang màu xanh nhanh sau tồn khối mẫu bình ni cấy chuyển sang màu xanh Tuy nhiên, Hồng thảo trầm, chúng tơi nhận thấy hạt nảy mầm có xu hướng tạo con, hạt tách rời tạo mầm nhỏ không kết dính thành khối số loại lan khác [12], [14] Kết nghiên cứu thể bảng 1, hình 1A1 Bảng Kết hình thành protocorm từ hạt Lan Hoàng thảo Trầm Thời gian khử trùng (phút) 10 Số bình ni cấy 19 14 Sau ngày 0 Số bình bị nhiễm Sau 10 Sau 14 Tổng 4 1 Tỷ lệ (%) 15,8 6,67 Số bình khơng nhiễm 15 13 Số bình có hạt nảy mầm 15 10 3.2 Kết nghiên cứu phát sinh protocorm từ mẫu thí nghiệm 3.2.1 Ảnh hưởng BAP kinetin đến phát sinh chồi từ protocorm Trong nghiên cứu vi nhân giống loài thuộc chi Dendrobium, việc bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin vào môi trường nuôi cấy thường tiến hành, phổ biến BAP, kinetin, NAA… Các hormone sinh trưởng sử dụng đơn lẻ kết hợp với nhóm khác nhóm [8] BAP kinetin hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trị quan trọng phân chia tế bào kích thích hình thành chồi Do đó, BAP kinetin thường sử dụng giai đoạn phát sinh protocorm nhân chồi Trong thí nghiệm này, nghiên cứu tác động riêng rẽ BAP kinetin đến phát sinh chồi từ protocorm lan Hoàng thảo trầm Bảng Ảnh hưởng BAP kinetin đến phát sinh protocorm Môi trường CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 Nồng độ BAP (mg/l) 0,5 1,5 http://jst.tnu.edu.vn - Nồng độ kinetin (mg/l) 0,5 1,5 Kích thước trung bình khối protocorm (cm) 0,45 ± 0,16 0,6 ± 0,25 0, 99 ± 0,12 0,67 ± 0,14 0,56 ± 0, 18 0, ± 0,22 1,05 ± 0,26 0,87 ± 0,31 468 Đặc điểm hình thái khối protocorm Xanh nhạt, mảnh Xanh lục, rời rạc Xanh lục, rời rạc Xanh lục, rời rạc Xanh lục, mảnh Xanh lục, mập Xanh lục, mập Xanh lục, mập Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 Để nghiên cứu ảnh hưởng cytokinin đến khả phát sinh protocorm, thí nghiệm sử dụng mơi trường MS có bổ sung đường 20 g/l; agar g/l; than hoạt tính g/l kích thích sinh trưởng BAP, kinetin nồng độ khác (bảng 2) Theo dõi tiêu thí nghiệm 30 ngày Kết thu bảng cho thấy, bổ sung BAP nồng độ thấp 0,5 - mg/l kích thước khối protocorm nhỏ đạt 0,45 - 0,6 cm Kích thước khối protocorm tăng lên tăng nồng độ BAP đạt 0,99 cm nồng độ 1,5 mg/l Tuy nhiên, tăng nồng độ lên mg/l BAP kích thước khối protocorm lại giảm (0,67 cm) Điều cho thấy nồng độ BAP cao gây ức chế sinh trưởng protocorm nuôi cấy in vitro Dendrobium parishii Ngoài ra, quan sát kết thí nghiệm cịn nhận thấy, mơi trường có bổ sung BAP, với nồng độ cao khả kết dính protocorm thấp trở nên rời rạc nằm rải rác bề mặt thạch Trên môi trường bổ sung kinetin, nồng độ 0,5 mg/l kích thước khối protocorm đạt 0,56 cm, tiếp tục tăng nồng độ chất kích thích sinh trưởng kích thước khối protocorm tăng lên đạt cao 1,5 mg/l với kích thước 1,05 cm Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ lên mg/l kích thước protocorm lại giảm xuống cịn 0,87 cm Kết thí nghiệm cho thấy, BAP kinetin có tác dụng lên q trình phát sinh protocorm, công thức môi trường CT3 CT7 cho khả phát sinh protocorm cao tương ứng với nồng độ BAP, kinetin 1,5 mg/l, mơi trường bổ sung kinetin có hình thái khối protocorm có màu xanh đậm, protocorm mập, khỏe (Hình 1A2, A3) 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng chất hữu bổ sung đến phát sinh protocorm Bên cạnh việc bổ sung hormone sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy in vitro, số nghiên cứu bổ sung thêm dịch nghiền từ số loại củ cà rốt, khoai tây, chuối xanh để thúc đẩy trình sinh trưởng nhanh mẫu nghiên cứu [12], [13] Dịch chiết củ thường chứa thành phần có tác dụng kích thích sinh trưởng mơ tế bào vitamin, hormone tự nhiên Trong nghiên cứu này, thí nghiệm bố trí trình bày mục 2.2.2 Kết thu bảng cho thấy, ảnh hưởng rõ rệt chất bổ sung lên phát sinh phát triển protocorm Khi bổ sung dịch chuối nghiền vào môi trường với hàm lượng tăng dần từ 20 – 40 g/l kích thước khối protocorm tăng lên 0,56 cm, 0,72 cm đạt cao 1,36 cm mơi trường có bổ sung 40 g/l chuối xanh nghiền Tuy nhiên, tăng hàm lượng chuối xanh lên 50 g/l kích thước khối protocorm giảm xuống 1,19 cm Như vậy, hàm lượng chuối xanh nghiền thích hợp cho giai đoạn phát sinh protocorm Dendrobium parishii 40 g/l (Hình 1B1) Đối với mơi trường bổ sung khoai tây nghiền 30 g/l, 40 g/l kích thước khối protocorm đạt 0,65 cm 1,24 cm, tăng hàm lượng khoai tây nghiền lên 50 g/l gây ức chế khả phát sinh protocorm, kích thước khối protocorm giảm cịn 1,03 cm (Hình 1B2) Bảng Ảnh hưởng chất bổ sung lên phát triển protocorm Chất bổ sung Chuối xanh nghiền Khoai tây nghiền Cà rốt nghiền http://jst.tnu.edu.vn Hàm lượng (g/l) 20 30 40 50 30 40 50 30 40 50 60 Kích thước TB khối protocorm (cm) 0,56 ± 0,11 0,72 ± 0,15 1,36 ± 0,13 1,19 ± 0,17 0,65 ± 0,13 1,24 ± 0,17 1,03 ± 0,14 0,46 ± 0,12 0,83 ± 0,16 0,55 ± 0, 14 0,48 ± 0,11 469 Đặc điểm hình thái khối protocorm Xanh, mập Xanh , mập Xanh, mập Xanh, mập Xanh, mập Xanh, mập Xanh, mập Xanh, mảnh Xanh, mảnh Xanh, mảnh Xanh, mảnh Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 Mơi trường có bổ sung cà rốt nghiền, hàm lượng 30 g/l 40 g/l cho kích thước khối protocorm 0,46 cm 0,83 cm Tuy nhiên, tăng hàm lượng lên 50 g/l 60 g/l gây ức chế khả phát sinh protocorm, kích thước khối protocorm giảm xuống 0,55 cm 0,48 cm, khối protocorm sinh trưởng môi trường bổ sung cà rốt nghiền có hình thái xanh mảnh (Hình 1B3) Kết thu cho thấy, môi trường bổ sung dịch nghiền củ/quả, hình thành phát triển protocorm tích cực so với mơi trường khơng bổ sung, điều phù hợp với nghiên cứu trước đối tượng lan Jaime cộng tổng hợp nghiên cứu vi nhân giống Dendrobium cho thấy chất phụ gia thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy Dendrobium nước dừa, than hoạt tính, chiết suất chuối, peptone số chất khác [8] Các dịch chiết tự nhiên thường chứa niacin số vitamin có tác dụng kích thích nảy mầm sinh trưởng lan [12]-[15] Trong nghiên cứu này, so sánh phát sinh protocorm môi trường chứa chất bổ sung gồm chuối xanh, khoai tây cà rốt nghiền nhận thấy, môi trường bổ sung chuối nghiền với hàm lượng 40 g/l tốt cho phát sinh protocorm lan D parishii, cụm protocorm có kích thước lớn với hình thái xanh đậm, to mập Điều khác biệt với nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Yến cộng (2021) Dendrobium nobile Lind, nhóm tác giả kết luận bổ sung khoai tây nghiền với hàm lượng 50 g/l vào môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ phát sinh chồi Dendrobium nobile Lind tốt [14] Điều cho thấy chất bổ sung thực có tác dụng tốt nghiên cứu nhân giống loài lan chi Dendrobium loài khác thích hợp với loại củ nghiền khác 3.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chăm sóc đến sinh trưởng phát triển lan P parishi in vitro vườn ươm Do điều kiện thời gian, thí nghiệm khơng khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất kích thích sinh trưởng lên hình thành rễ D parishii in vitro Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu nhân giống, lựa chọn NAA với nồng độ 0,5 mg/l để tiến hành rễ cho chồi lan D parishii in vitro, nồng độ thích hợp khảo sát ảnh hưởng IAA, IBA NAA (nồng độ từ – 1,5 mg/l) đến q trình ni cấy in vitro D heperocapum Lind [12] Các chồi phát sinh từ protocorm tách riêng lẻ cấy lên môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ 0,5 mg/l để kích thích tạo rễ Khi in vitro đạt đủ tiêu chuẩn (cao từ – cm, mang lá, rễ từ trở lên, cứng cáp), tiến hành đưa vườn ươm Các thí nghiệm tiến hành trình bày mục 2.2.3 nhằm khảo sát ảnh hưởng điều kiện chăm sóc giá thể, phân bón, ánh sáng… đến trình sinh trưởng in vitro Với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng giá thể D parishii in vitro nhận thấy, giá thể khác ảnh hưởng lớn tới tỉ lệ sống/chết Tỷ lệ chết cao giá thể than củi, 75% bị chết sau 15 ngày (Hình 1C1), tiếp đến giá thể vỏ thơng với tỉ lệ sống sót đạt 35% (Hình 1C2) Các sống sót loại giá thể có màu xanh nhạt, phát triển Như vậy, than củi vỏ thông không phù hợp làm giá thể D parishii in vitro than củi sử dụng phổ biến để trồng loài lan thu hái từ rừng Khi sử dụng giá thể dớn, tỷ lệ sống sót thu 50%, nhiên phát triển kém, có màu xanh nhạt (Hình 1C3) Trên giá thể rêu, tỷ lệ sống sót tăng lên đáng kể đạt 62,5%, có màu xanh, phát triển tốt Tuy nhiên, sau 20 ngày có biểu chậm phát triển, xanh nhạt dần (Hình 1C4) Ngun nhân độ thống rễ chưa đảm bảo, rễ tích nước nên có tượng bị úng Tỷ lệ sống sót cao sử dụng giá thể xơ dừa, đạt 87,5%, sinh trưởng phát triển tốt, mập màu xanh đậm (Hình C5) Với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng mật độ trồng D parishii in vitro nhận thấy, trồng với số lượng cây/bầu cho tỷ lệ sống cao 90,11% (bảng 4) tỷ lệ giảm xuống tăng số cây/bầu lên - cây/bầu (Hình D2 - D4), điều trái ngược với đặc điểm sinh trưởng tự nhiên loài Dendrobium loại đa thân, thường sống thành cụm Có http://jst.tnu.edu.vn 470 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 thể giải thích in vitro có sức đề kháng kém, trồng mật độ cao dễ nhiễm bệnh nấm, khuẩn dẫn đến giảm tỉ lệ sống sót Thí nghiệm Giá thể Mật độ Dung dịch tưới Bảng Ảnh hưởng giá thể, mật độ dung dịch tưới đến phát triển lan D parishii in vitro giai đoạn vườn ươm Công thức Tỷ lệ sống (%) Trạng thái sinh trưởng Dớn 50 ± 1,48 Cây sống phát triển Than củi 25 ± 1,49 Sức sống Rêu 62,5 ± 3,15 Cây sinh trưởng phát triển tốt Xơ dừa 87,5 ± 2.33 Cây sinh trưởng phát triển tốt, xanh Vỏ thông 35 ± 2,32 Cây sinh trưởng chậm cây/bầu 90,11 ± 0,92 Cây phát triển tốt xanh đậm cây/bầu 84,09 ± 1,12 Cây phát triển chậm hơn, xanh đậm cây/bầu 65,44±2,59 Cây phát triển chậm, xanh nhạt cây/bầu 51,67±2,18 Cây phát triển, xanh nhạt Nước máy 87,35 ± 2,78 Cây sinh trưởng tốt 49,15 ± 1,42 Nước máy : MS (4:1) Lá có màu xanh nhạt Nước máy : MS (3:1) 41,38 ± 3,11 Lá vàng Nước máy : MS (2:1) 10,25 ± 1,15 Cây héo úa Bảng Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến phát triển lan P parishii in vitro sau Chế độ ánh sáng Trong phòng Che lưới 60% nắng Ánh sáng tự nhiên Ban đầu ± 0,5 ± 0,97 ± 0,5 Chiều cao (cm) Sau 20 Sau 40 8,1 ± 6,9 ± 1,8 2,05 6,1 ± 7,8 ± 2,10 1,16 5,5 ± 1,34 ± 1,97 Sau 60 ngày 11,5 ± 3,17 9,3 ± 2,39 8,1 ± 3,06 Trạng thái Sinh trưởng Cây vươn cao, nhỏ, màu nhạt Thân cao vừa, to, màu xanh đậm Thân thấp, vàng, có vết nhăn khơ, mép có xu hướng cụp vào Với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng dung dịch tưới lên D parishii in vitro nhận thấy, dung dịch MS ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển lan in vitro Mức độ ảnh hưởng phụ thuộc tỉ lệ dung dịch MS Khi sử dụng nước máy tưới sinh trưởng phát triển bình thường, tỷ lệ sống cao, đạt 87,35% (Hình 1E4) Khi sử dụng dung dịch nước máy pha MS theo tỷ lệ 4:1, 3:1 2:1 nhận thấy khả sống sót giảm tương ứng với tăng lên tỉ lệ MS, tỷ lệ sống sót là: 49,15%; 41,38% 10,25% (Hình F1 – E3) Như vậy, dung dịch MS làm ức chế sinh trưởng in vitro Hiện tượng giải thích MS khơ tạo thành muối đọng bám giá thể làm giảm khả hút nước cây, gây ảnh hưởng đến sinh trưởng lan Với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ chiếu sáng lên D parishii in vitro nhận thấy, chế độ chiếu sáng có ảnh hưởng quan trọng đến phát triển Khi để phòng, thân vươn cao đạt 6,9 cm sau 20 ngày theo dõi, sau 40 ngày đạt 8,1 cm 11,5 cm sau 60 ngày, cao vượt trội hẳn chế độ chiếu sáng khác, nhiên lại nhỏ nhạt màu, biểu sức sống yếu (Hình F1) Với sinh trưởng điều kiện che lưới 60% nắng chiều cao đạt 6,1 cm sau 20 ngày theo dõi, sau 40 ngày đạt 7,8 cm đạt 9,3 cm sau 60 ngày, phát triển tốt (Hình 1F2) Đối với chế độ chiếu sáng trực tiếp, có chiều cao thấp hẳn đạt 5,5 cm sau 20 ngày, cm sau 40 ngày 8,1 cm sau 60 ngày, đanh, màu xanh nhạt ngả vàng, có vết nhăn, khơ mép cụp (Hình F3) http://jst.tnu.edu.vn 471 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 Hình Nhân giống in vitro Dendrobium parishii A1 Protocorm hình thành từ hạt; A2,A3 protocorm môi trường bổ sung BAP 1,5 mg/l (A2) kinetin 1,5 mg/l (A3); B1-B3 Protocorm môi trường bổ sung chuối 40 g/l (B1), khoai tây 40 g/l (B2) cà rốt 40 g/l (B3); C1-C4 Cây sinh trưởng giá thể khác nhau: Than củi (C1); Vỏ thông (C2); Dớn (C3); Rêu (C4) xơ dừa (C5); D1-D4 Ảnh hưởng mật độ cây/bầu lên sinh trưởng con: cây/bầu (D1); cây/bầu (D2); cây/bầu (D3); cây/bầu (D4); E1-E4 Ảnh hưởng chế độ tưới: MS/2 nước máy (E1); MS/3 nước máy (E2); MS/4 nước máy (E3); nước máy (E4); F1-F3 Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến in vitro: Trong phòng (F1); Che lưới 60 % nắng (F2); Nắng trực tiếp (F3) Kết luận Trong nghiên này, khảo sát số điều kiện ni cấy in vitro chăm sóc giai đoạn vườn ươm mơi trường phát sinh protocorm từ hạt phù hợp D parishii MS bổ sung BAP kinetin 1,5 mg/l Bổ sung chuối xanh nghiền với hàm lượng 40 g/l vào môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ phát sinh protocorm tốt Cây in vitro giai đoạn vườn ươm chăm sóc phù hợp với điều kiện bao gồm: giá thể trồng in vitro phù hợp xơ dừa; mật độ trồng cây/bầu; tưới ban đầu nước máy ngày/lần sử dụng lưới 60% nắng để che cho http://jst.tnu.edu.vn 472 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 465 - 473 TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] POWO, "Plants of the World Online Facilitated by the Royal Botanic Gardens, Kew” Retrieved 24 November 2022 [Online] Available: http://www.plantsoftheworldonline.org/ [Accessed March 2022] [2] D H Duong, Vietnamese flora Science and Technology Publishing House, 2007 [3] W Yue‑Hu, “Traditional Uses and Pharmacologically Active Constituents of Dendrobium Plants for Dermatological Disorders: A Review,” Natural Products and Bioprospecting, vol 11, pp 465-487, 2021, doi: 10.1007/s13659-021-00305-0 [4] J Jakaphun, S Thanapat, K Chalermpol, C Aueporn, and C Sunee, “Chemical composition of the Essential Oils from Cell Culture of Dendrobium parishii Rchb f.,” CMU J Nat Sci., vol 12, no 2, 2013, doi: 10.12982/CMUJNS.2013.0008 [5] G Seidenfaden, “Orchid genera in Thailand 12 Dendrobium Sw,” Opera Bot., vol 83, pp 26-57, 1985 [6] Ministry of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology, VietNam red book Part II Plant Natural Science and Technology Publishing House, 2007 [7] H Tran, Viet Nam orchid Ha Noi Agriculture Publishing House, 1988 [8] A Jaime, S D Teixeira, C C Jean, J Dobra ́nszki, and Z Songjun, “Dendrobium micropropagation: a review,” Plant Cell Rep, vol 34, pp 671-704, 2015 [9] S Rao and B Barman, “In vitro micropropagation of Dendrobium chrysanthum Wall ex Lindl A threatened orchid,” SAJB, vol 2, pp 39-42, 2014 [10] T S Nguyen, B T Tu, T N Dang, T L A Nguyen, T N Hoang, and Q T Nguyen, “In vitro propagation of Dendrobium officinale Kimura et Migo,” Journal of Science and Development, vol 12, pp 1274-1282, 2014 [11] V V Nguyen, “Using in vitro culture techniquie for the propagation of Dendrobium lituiflorum LindLey,” Journal of Forestry Science and Technology, vol 4, pp 39-45, 2017 [12] T T Dang, N B H’Yon, T T H Nguyen, V K Dinh, V D Nong, T V Tran, V H Quach, and K C Vu, “Micropropagation of Dendrobium heterocarpum Lindl.,” Journal of Biotechnology, vol 16, pp 127-135, 2018 [13] T Murashige and F Skoog, "A Revised Medium for Rapid Growth and BioAssays with Tobacco Tissue Cultures," Physiologia Plantarum, vol 15, pp 473-497, 1962 [13] Y Li, D H Zhu, H T Pan, and Q X Zhang, “In vitro propagation of three Dendrobium species from stems,” J Northeast Forest Univ, vol 41, pp 77-81, 2013 [14] T H Y Nguyen and N N Tran, “Study on in vitro progation of Dendrobium nobile Lindl.,” TNU Journal of Science and Technology, vol 225, no 11, pp 68-75, 2020 [15] M O Islam, S Matsui, and S Ichihashi, “Effect of complex organic additives on seed germination and carotenoid content in Cattleya seedlings,” Lindleyana, vol 15, pp 81-88, 2000 http://jst.tnu.edu.vn 473 Email: jst@tnu.edu.vn ... ảnh hưởng mật độ đến sinh trưởng lan in vitro giai đoạn vườn ươm: Cây bố trí trồng vườn ươm với mật độ cây/ bầu; cây/ bầu; cây/ bầu; cây/ bầu Theo dõi tỉ lệ sống trạng thái sinh trưởng - Thí nghiệm... đến in vitro: Trong phòng (F1); Che lưới 60 % nắng (F2); Nắng trực tiếp (F3) Kết luận Trong nghiên này, khảo sát số điều kiện nuôi cấy in vitro chăm sóc giai đoạn vườn ươm mơi trường phát sinh... sung BAP kinetin 1,5 mg/l Bổ sung chuối xanh nghiền với hàm lượng 40 g/l vào môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ phát sinh protocorm tốt Cây in vitro giai đoạn vườn ươm chăm sóc phù hợp với điều kiện bao