Virus free plant tissue culture

2. Kỹ thuật nuôi cấy meristem Qua nghiên cứu của các nhà khoa học White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952): Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia của các tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào phân chia càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.  Từ đây các ông đã đưa ra một kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh. Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, nó chứa nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi chất rất mạnh Kỹ thuật nuôi cấy meristem là phương pháp sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3 4 tiền phát khởi lá, tức lá đỉnh, có kích thước 0,10,5 mm tính từ chóp đỉnh sinh trưởng...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO HỌC KỲ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT ĐỀ TÀI: VIRUS-FREE-PLANT TISSUE CULTURE THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2022 MỤC LỤC Mở đầu I II Nuôi cấy meristem tạo bệnh virus Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy meristem Tại nuôi cấy meristem lại tạo bệnh III Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro Các cách nuôi cấy meristem Cách tiến hành nuôi cấy Ứng dụng vào cụ thể 11 IV V VI Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus 13 Các phương pháp ngăn chặn trình tái lây nhiễm virus đồng ruộng 16 Tài liệu tham khảo: 16 Mở đầu I Sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mở nhiều hướng ứng dụng khác sản xuất sinh khối chất có hoạt tính sinh học quy mơ lớn, nhân nhanh giống trồng phương pháp invitro, bảo tồn nguồn gen in vitro, Trong lĩnh vực bệnh cây, nay, có khoảng 2000 loại vi rút thực vật phát nghiên cứu, số khoảng n l lồi gây hại cho trồng Mứ độ thiệt hại bệnh virus gây cho trồng nghiêm trọng, ó thể l n tới 5-100% Sự thiệt hại dừng mứ độ su giảm suất mà ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm thu hoạch Các ví dụ thiệt hại bệnh virus gây nướ t lúa đồng sơng ó thể kể đến như: dịch virus vàng lùn xoắn u ong năm vừa qua, gần đâ l dịch lúa lùn sọ đ n uất tỉnh phía bắ , đ dọa nghiêm trọng đến sản lượng lương thực Bệnh virus hại thực vật l loại bệnh ngu hiểm,dễ lan truyền qua nhân giống vơ tính (do tồn mô sống), qu m giới tru ền bệnh (các loại nhện,v.v) qua tiếp n trùng rệp, bọ phấn, giới (vết cắt, xây xát, v v ) Tác hại củ virus l v lớn ó l m ảnh hưởng trực tiếp tới suất phẩm chất nông sản ột số hình ảnh bệnh virus trồng: ùng  Do đó, việc tạo giống bệnh vô cần thiết biện pháp bắt buộc cho tất nhân giống v tính v ũng l biện pháp để phục tráng giống cho giống bị thoái hóa nhiễm virus - Kỹ thuật tạo bệnh virus - Hiện n ó phương pháp hính l :  Kỹ thuật RNA interference (RNAi – RNA can thiệp)  Kỹ thuật làm sạ h virus invitro : phương pháp  Nuôi cấ m phân sinh đỉnh  Nuôi cấ m phân sinh đỉnh kết hợp l nhiệt độ  Nuôi cấ m phân sinh đỉnh kết hợp l hó  Vi ghép II Ni cấy meristem tạo bệnh virus Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật hất o - Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật, tr n m i trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ hữu hiệu để tạo trồng bệnh Để tạo bệnh người ta dùng phương pháp s u:  Dùng phương pháp huẩn đoán bệnh virus để lọc mẫu nhiễm bệnh trướ đư v o nu i ấy, s dụng biện pháp nhân nh nh in vitro để nhân nhanh mẫu  Làm virus mẫu bị nhiễm, s u tạo mẫu tiếp tục s dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu Kỹ thuật nuôi cấy meristem Qua nghiên cứu nhà khoa học White (1934), Limasset Cornuet (1950), Morel Martin (1952): Nồng độ virus bị bệnh phụ thuộc vào tố độ phân chia tế bào khả sinh trưởng tế bào Tế bào phân chia mạnh nồng độ virus thấp, nghĩ l tế bào gần đỉnh sinh trưởng virus  Từ đâ ng đư r kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo hoàn toàn virus từ â nhiễm bệnh Đỉnh sinh trưởng phần chóp búp hoặ thân â nơi ó thể sinh phần từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu mẫn cảm với ánh sáng, chứa nhiều Au in, nơi diễn r tr o đổi chất mạnh Kỹ thuật nuôi cấ m rist m l phương pháp s dụng phần mô phân sinh với - tiền phát khởi lá, tứ đỉnh, ó kí h thước 0,1-0,5 mm tính từ hóp đỉnh sinh trưởng Tại ni cấy meristem lại tạo bệnh Virus di chuyển chủ yếu nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống khơng có m phân sinh đỉnh Trong q trình phân chia, tế b o m phân sinh đỉnh không cho phép chép thông tin di truyền virus Nồng độ auxin, cytokinin cao đỉnh sinh trưởng ngăn q trình s o hép thơng tin di truyền virus Hệ thống vơ hiệu hóa vùng meristem mạnh vùng â III Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro Các cách nuôi cấy meristem - Ni cấ đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)  Tách xác meristem ó kí h thước < 0,3mm  Ni cấ tr n m i trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh thành hoàn chỉnh  Kiểm tr độ tái sinh biện pháp nh u để thu bệnh - Nuôi cấy meristem kết hợp x lý nhiệt Ở nhiệt độ cao từ 36°C - 37°C số loại virus khơng có khả nhân l n Lợi dụng đặc tính kết hợp phương pháp nu i meristem với x lí nhiệt độ để tẩy virus khuôn mẫu Biện pháp cho phép tách meristem kí h thước lớn (0 - 1mm) giúp cho việc tách tái sinh thuận lợi so với phương pháp tá h kí h thước 0.1 - 0.2mm - Ni cấy meristem kết hợp x lý hóa chất  Có ni cấy meristem với kí h thước lớn (0.5 - 1mm) kết hợp với việc bổ sung v o m i trường nuôi cấy chất kháng virus để tạo bệnh  Các chất kháng virus như: 2-thiour il, rib virin, vid r bin l m tăng khả đề kháng tế bào, mô thực vật ức chế nhân virus  Phương pháp n áp dụng việc tạo virus thuốc lá, kho i tâ , ho lo kèn v th nh - Vi ghép ng Là kĩ thuật ghép m phân sinh đỉnh lên gốc kháng bệnh điều kiện in vitro Thường áp dụng thân gỗ đặc biệt họ cam, chanh meristem chúng khơng thể sinh trưởng tái sinh chồi nuôi cấy trực tiếp tr n m i trương nhân tạo Cách tiến hành:  Từ mẹ bị nhiễm bệnh ta vặt hăm só bình thường khoảng tuần cho mọc chồi  Đồng thời ta tiến hành gieo hạt ống nghiệm đợi phát triển hoàn chỉnh  Tiến hành ghép chồi bị bệnh với nuôi ống nghiệm  Tiếp tục cho phát triển bình thường ta có tỉ lệ bệnh virus cao Cách tiến hành ni cấy 2.1 Mụ đí h - h trùng mẫu đỉnh chồi - Khảo sát tái sinh trực tiếp từ nuôi cấ đỉnh chồi - Khảo sát thành lập protocorm từ nuôi cấ đỉnh chồi 2.2 Nuôi cấy phát triễn thành trực tiếp Nguyên vật liệu: Đoạn thân non cam chanh i trường nuôi cấ : i trường MS bổ sung BA ppm NAA 0,2 ppm Cách tiến hành:  Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm cắt bỏ hết lá, cắt th nh đoạn – 3cm, cho vào bécher  cành mẫu nướ ph ng lỗng, s u r nướ má nhiều lần v i nướ  Đư xà phòng hảy mạnh nh mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm cồn 70% – phút  cồn nướ  l mẫu ất vô trùng lần (O l)2 6% 10 ph t s u th dung dịch Ca(OCl)2 5% phút  mẫu nướ ất vô trùng – lần cho hết mùi Javel  Cành mẫu cắt bỏ cuống v đầu phần thân bị chất kh trùng tẩy trắng Chia cành mẩu th nh đốt 1cm  Cắm đốt v o m i trường nuôi cấ huẩn bị, cho phần cuống hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm mặt thoáng củ m i trường  Nuôi mẫu điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày 25 độ 2.3 Nuôi cấy phát triễn â th ng qu gi i đoạn protocorm Nguyên vật liệu: đoạn chồi Dendrobium cao 10cm i trường nuôi cấ đỉnh sinh trưởng ( ho m i trường):  hoáng đ lượng Knudson 100mL  Khoáng vi lượng Heller 5mL  Skoog II MS: 2mL  Vitamin Morel: 2mL  Glycin: 2mL  Inositol: 5mL  Vitamin B1: 5mL  Đường: 30g  ướ dừa: 150mL  Khoai tây: 60g  Than hoạt tính: 0,25g  pH: 5,5  Agar: 6g  hoáng đ lượng Knudson C (Morel, G.M, 1965) + NH4NO3: 500mg/L + NH4(SO4)2: 500mg/L + Ca(NO3)2: 241,3mg/L + KCl: 250 mg/L + KH2PO4: 250 mg/L + MgSO4: 122,15mg/L  hoáng vi lượng Heller (1953) + AlCl3.6H2O: 0,054 mg/L + CuSO4.5H2O: 0,03 mg/L + H3BO3: 6,2 mg/L + KI: 0,01 mg/L + MnSO4.H2O: 0,08 mg/L + NiCl2.6H2O: 0,03 mg/L + ZnSO4.7H2O: 1,0 mg/L bướ tiến hành:  chồi D ndrobium v i nướ non bao xung quanh chồi ho đến để lộ r  Ngân chồi nướ cho sạ h hảy Dùng dao mổ lột hết hồi bên chồi ph ng loãng v dùng g n l u nhẹ lên thân chồi ph ng v i nướ hảy  Lắc chồi cồn 70% ph t u l với dung dí h j v l thương phẩm theo tỉ lệ : vòng 25 – 30 phút  Trong tủ cấy, dùng kẹp vơ trùng cho chồi vào bécher có nướ ất vô trùng lắ – lần cho hết mùi javel  Đặt chồi lên giấy vô trùng.dùng dao cắt riêng chồi bên chồI khỏi chồi mẹ b n đầu hớ bỏ hết mô chết bị chất kh trùng l m trắng phần gốc chồi Cấy chồi vào ống nghiệm có m i trường chuẩn bị  Ni phịng sáng  Ghi rõ tên nhóm, ngày cấy, giống vào tất ống nghiệm Ứng dụng vào cụ thể Tạo khoai tây bệnh virus ột trạng sản xuất khoai tây dễ bị nhiễm virus qua trình nhân giống vơ tính.Vì cần tạo giống khoai tây bệnh virus Đó l l m ng n kho i tâ đ nhân giống phương pháp in vitro phổ biến Để nhân giống in vitro khoaitây cần thực bướ s u: - ướ 1: họn giống đủ tiêu chuẩn â đủ tiêu chuẩn lấy mẫu có chiều cao 710cm, có từ 8-10 lá, phải sinh trưởng khỏe, thân mập th ng thường ni cấy 8-0 bình 250ml - ướ : rót m i trường tạo củ v o bình 250ml họn v 12% s - ros i trườn tạo củ gồm ượng m i trường cho vào bình 50-70ml ướ : Tiến hành nuôi cấy giống điều kiện tối hoàn toàn nhiệt độ 20-22 độ - ướ 4: u tháng â hình thành củ Lúc tiến hành thu hoạch củ in vitro hư vậ tạo củ bệnh virus IV Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus - Phương pháp chuẩn đoán mắt phương pháp hẩn đoán dựa việc quan sát, nhận biết triệu chứng bệnh  Ưu điểm: đơn giản; tốn kém; dễ thực  hượ điểm: phải có kinh nghiệm; khó áp dụng nhiễm tổ hợp virus; phụ thuộc ngoại cảnh, tuổi â , đặ điểm giống - Phương pháp chuẩn đoán thị Dùng dịch ép thực vật cần xét nghiệm để lây nhiễm thị thích hợp hoặ dùng phương pháp ghép ó thể định bệnh virus Cây thị bị nhiễm virus biểu nhiều triệu chứng đặ trưng  Ưu điểm: nhạy, xác; phát nồng độ virus thấp  hượ điểm: Thời gian chuẩn đoán d i, ần thời gian ủ bệnh, phụ thuộc v o điều kiện thí nghiệm, phương pháp lâ nhiễm phức tạp, tốn ng hăm sóc thị, môi giới truyền bệnh, số bệnh virus không tiến hành (bệnh lá) - Phương pháp chuẩn đốn kính hiển vi điện tử Kính hiển vi mang lại kết đáng tin ậ xét nghiệm hàng loạt  Ưu điểm: xác; tin cậy  hượ điểm: Chi phí cao, số lượng mẫu hạn chế phương pháp lấy mẫu, x lý mấu phức tạp, không áp dụng với số bệnh virus - Phương pháp huyết Phương pháp n dựa trộn lẫn huyết th nh đặc hiệu cho loại virus với dịch cần chẩn đoán bệnh Có nhiều phương pháp hu ết th nh nh u phương pháp kết tủa giọt, phương pháp ét nghiệm miễn dị h hướng tâm…  Ưu điểm: nhạ , đặc hiệu (kết thu 48h), chi phí thấp; khơng cần có nhà cách ly ni cấy thị  hượ điểm: Có thể lẫn với số dạng kết tủa khác; phản ứng khó xảy với nồng độ dịch bệnh thấp - Phương pháp phân tích DNA định trực tiếp có mặt ARN lõi virus hính , đắt tiền đồ nguyên lý: ARN virus => cDNA virus => phản ứng lai với ARN virus => nhận biết cDNA gắn phản xạ enzyme - Phương pháp ELISA Nguyên lý chung: Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể đâ kháng thể liên kết với enzyme (enzyme linked) Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết qua phản ứng mầu hính mz m tác  Enzyme thơng dụng photphataza kiềm  hất phản ứng nitrophenylphosphat bị tách phosphate thành α-nitro phenol có màu vàng  Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân t khuế h đại rõ  Có thể định tính, định lượng Phân loại: loại  E I A th ng thường  ELISA bắt kháng nguyên - Phương pháp E I A th ng thường  ước 1: Gắn kháng nguyên vào nhựa  ước 2: Che chắn phần trống protein  ước 3: Bổ xung kháng thể đặc hiệu hất nên tín hiệu -  ước 4: Bổ xung cộng hợp enzyme  ước 5: Bổ ung hất  ước 6: Phản ứng chuyển màu củ hất xúc tác enzyme Phương pháp ELISA bắt kháng nguyên  ước 1: Cho kháng thể vào lỗ th ủ 370C 2-4h, s u r a  ước 2: Cho dịch mẫu th vào lỗ th ủ 40C 12h, đ m r a lại  ước 3: Bổ xung kháng thể gắn với enzyme ủ 370C h  ước 4: Bổ ung hất phản ứng chờ vài  ướ 5: Đọ tr n má so m u v đánh giá kết V Các phương pháp ngăn chặn trình tái lây nhiễm virus đồng ruộng Nên trồng nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) khơng chứa nguồn bệnh vetor truyền bệnh (rệp) hay nơi kh ng ó m ng virus Cần loại trừ thường xuyên nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ vật mang bệnh (côn trùng tuyến trùng…), dọn cỏ thường xuyên Phòng tránh lây nhiễm giới q trình hăm só â trồng Thường xun chọn lọc, mắt qua phân tích chuẩn đốn Để hồn tồn chắn, nên trì vật liệu bệnh in vitro VI Tài liệu tham khảo: https://pdfcoffee.com/ky-thuat-nuoi-cay-meristem-va-tao-cay-sach-benh-viruspdf-free.html https://123docz.net//document/3064726-ky-thuat-nuoi-cay-meristem-va-tao-caysach-benh-virus.htm ... chất kháng virus để tạo bệnh  Các chất kháng virus như: 2-thiour il, rib virin, vid r bin l m tăng khả đề kháng tế bào, mô thực vật ức chế nhân virus  Phương pháp n áp dụng việc tạo virus thuốc... Phương pháp phân tích DNA định trực tiếp có mặt ARN lõi virus hính , đắt tiền đồ nguyên lý: ARN virus => cDNA virus => phản ứng lai với ARN virus => nhận biết cDNA gắn phản xạ enzyme - Phương pháp... di truyền virus Hệ thống vơ hiệu hóa vùng meristem mạnh vùng â III Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro Các cách nuôi cấy meristem - Nuôi cấ đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)