Nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben

Nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN ĐINH NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CÂY THUỐC KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH LANG BEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN ĐINH NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CÂY THUỐC KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH LANG BEN CHUYÊN NGÀNH: ĐÔNG DƯC VÀ THUỐC NAM MÃ SỐ: 3.02.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. NGUYỄN KHẮC QUỲNH CỨ 2. PGS.TS. TRẦN XUÂN MAI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN ĐINH NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CÂY THUỐC KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH LANG BEN Chuyên ngành: ĐÔNG DƯC VÀ THUỐC NAM Mã số : 3.02.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2006 Công trình được hoàn thành tại: Đại Học Y Dược TP. HCM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 2. PGS.TS. Trần Xuân Mai Phản biện 1: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ Trường Đại học Dược Hà Nội Phản biện 2: GS.TSKH. Hoàng Tích Huyền Trường Đại học Y Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS. Trần Hùng Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại: Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Vào hồi 8 giờ, ngày 15 tháng 12 năm 2006. Có thể tìm luận án tại: - Thư Viện Quốc Gia Việt Nam - Thư Viện Khoa Học Tổng Hợp TP. Hồ Chí Minh - Thư Viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Bệnh lang ben do những vi nấm ưa chất béo thuộc chi Malassezia gây ra. Bệnh thường chiếm tỉ lệ cao ở các nước có khí hậu nóng ẩm, có thể chiếm từ 40-50% dân số. Lang ben thường phát triển trên diện rộng, dai dẳng nên việc điều trò phải mất nhiều thời gian. Hơn nữa, miễn dòch quần thể hiện đang có khuynh hướng suy giảm, ở những cá thể sử dụng corticoid bừa bải, người bệnh suy giảm miễn dòch, lang ben có khuynh hướng lan nhanh, tái phát, vi nấm gây bệnh còn có thể xâm nhập vào cơ quan nội tạng. Người dân Việt Nam đã sử dụng nhiều cây thuốc theo kinh nghiệm để trò lang ben và bệnh nấm da như củ Riềng, Rau răm, Muồng trâu Vì vậy, thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben” chúng tôi mong muốn đạt các mục tiêu sau: 1. Sàng lọc một số cây thuốc kháng M. furfur từ đó chọn một đến hai cây có tác dụng mạnh để nghiên cứu sâu. 2. Nghiên cứu đặc điểm thực vật kết hợp với tác dụng kháng nấm để đưa ra tiêu chuẩn chọn nguyên liệu. 3. Nghiên cứu chiết xuất phân đoạn có hoạt tính, phân lập và xác đònh cấu trúc hoá học của hoạt chất kháng M. furfur có trong các cây thuốc được chọn nghiên cứu làm cơ sở cho việc kiểm đònh nguyên liệu. 4. Xác đònh hoạt lực và cơ chế tác động của các phân đoạn có hoạt tính và hoạt chất trên quần thể vi nấm Malassezia spp., được ly trích từ vẩy da của một số người Việt Nam tình nguyện và đònh danh theo phân loại mới. 5. Khảo sát tính kích ứng da và liều tác dụng của phân đoạn có hoạt tính kháng Malassezia spp. 2 2. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh lang ben rất phổ biến ở Việt Nam nhất là ở người lao động. Trên thò trường tuy sẵn có các thuốc điều trò lang ben nguồn gốc tổng hợp, nhưng đa số dân lao động vẫn quen dùng các cây thuốc để trò lang ben. Hiệu quả điều trò của những cây thuốc này, cho đến nay vẫn chưa được chứng minh hoặc giải thích. Mặc khác, theo xu hướng hiện nay, để đối phó với bệnh do vi nấm, nhất là vi nấm kháng thuốc, song song với việc tổng hợp hoá học những thuốc mới, các nhà nghiên cứu rất quan tâm tìm kiếm các chất kháng nấm từ thiên nhiên. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben nhằm có thể: Chứng minh hiệu quả điều trò, cơ chế tác động kháng vi nấm gây bệnh lang ben của các cây thuốc đang được người dân sử dụng, giải thích một cách khoa học kinh nghiệm trò liệu của cha ông. Làm phong phú thêm nguồn thuốc trò bệnh da do vi nấm từ những nguyên liệu quen thuộc với người dân, đã được người dân sử dụng nhưng tiện lợi, dễ sử dụng, có hiệu quả hơn, cũng như có thể ngăn chặn sự lây lan bệnh lang ben trong cộng đồng và khống chế vi nấm ở mức độ không nguy hiểm. 3. Những đóng góp mới của luận án - Tìm hiểu phân bố của các loài thuộc chi Malassezia trên da bệnh lang ben, gàu và da bình thường của một số người Việt Nam theo phân loại mới. - Áp dụng kỹ thuật hiện hình sinh học vào phân biệt dược liệu, chiết xuất và phân lập hoạt chất có tác dụng kháng M. furfur từ Riềng nếp và Bông móng tay. - Thay đổi thành phần chất bổ sung vào môi trường RPMI (qui đònh của NCCLS) thích hợp cho sự phát triển và tạo dạng sợi giống như ở vết thương lang ben của M. furfur (RPMI-S1 và RPMI-S2). 3 - Chứng minh được Alpinia galanga Willd. (Riềng nếp) và Impatiens balsamina L. (Bông móng tay hoa trắng) kháng Malassezia mạnh hơn một số dược liệu đã dùng theo kinh nghiệm dân gian. Giải thích cơ chế tác động của các chất chiết xuất từ 2 cây này trên sự chuyển dạng, sự tăng trưởng và cấu trúc tế bào vi nấm gây bệnh lang ben. Tìm được phối hợp cộng lực in vitro giữa Riềng nếp và Bông móng tay trên vi nấm gây bệnh lang ben. - Phân lập và xác đònh được cấu trúc hoá học của hoạt chất kháng Malassezia từ Riềng nếp và Bông móng tay trắng Việt Nam là galangal acetat và 2-methoxy-1,4-naphthoquinon. Sử dụng Galangal acetat như chất đặc trưng cho tác dụng kháng nấm của Riềng nếp làm chất chuẩn đònh lượng. - Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thân rễ Riềng nếp để có thể chọn nguyên liệu khi Dược Điển Việt Nam chưa qui đònh. - Xác đònh tác dụng trò bệnh lang ben rõ rệt ở lâm sàng và cận lâm sàng của Riềng nếp. 4. Bố cục của luận án: luận án gồm 137 trang, bao gồm phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 32 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả 66 trang, bàn luận kết quả và kết luận - kiến nghò 15 trang. Có 57 bảng, 2 biểu đồ, 5 sơ đồ, 34 hình và 141 tài liệu tham khảo gồm 12 tài liệu tiếng Việt, 115 tài liệu tiếng Anh và tiếng Pháp, 14 tài liệu từ internet. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi nấm Malassezia spp. Malassezia là nhóm nấm men ưa chất béo, sống hoại sinh ở da người và động vật máu nóng. Chúng có thể gây ra bệnh nhiễm ở lớp ngoại biên của biểu bì như lang ben, viêm nang lông, viêm da tăng tiết bã, gàu, nhiễm trùng huyết ở những cá thể cần phải đặt 4 ống thông hoặc trẻ sơ sinh được nuôi qua đường tónh mạch với dòch truyền có hàm lượng lipid cao. Theo phân loại của Guillot, Gueho và cs. (1996), chi Malassezia gồm 7 loài, 6/7 loài cần lipid bắt buộc cho sự phát triển. 3 loài thường gây bệnh lang ben là M. furfur, M. sympodialis và M. globosa. Một số loài trong chi Malassezia đã được biết về khả năng chuyển dạng từ nấm men, sống hoại sinh ở da, sang dạng sợi có khả năng xâm nhập vào lớp sừng và gây bệnh. 1.2. Thuốc trò bệnh lang ben Để trò bệnh lang ben có thể dùng thuốc được tổng hợp nhằm làm tiêu sừng, bong da như antimycose, BSI; làm giảm sự hoạt động của tuyến bã như selenium sulfid, natri thiosulfat hoặc kháng sinh kháng nấm như ketoconazol, miconazol, itraconazol, fluconazol. Theo y học cổ truyền dân tộc, bệnh lang ben có thể được điều trò có hiệu quả bằng các cây thuốc như thân rễ Riềng, lá Muồng trâu, lá Rau răm… Qua kết quả sàng lọc cây thuốc, chúng tôi đã xác đònh được Bông móng tay và Riềng nếp kháng M. furfur mạnh. - Riềng nếp (Alpinia galanga Willd. Zingiberaceae). Thân rễû Riềng nếp được nhân dân dùng làm gia vò, thuốc trò bệnh ngoài da, dạ dày, ho…Trong Riềng nếp chứa hai nhóm hoạt chất chính là tinh dầu và hợp chất phenolic. Cả 2 nhóm chất này đều cho tác dụng kháng nấm da, nấm mốc và Candida. Galangal acetat (acetoxychavicol acetat) đã được chứng minh là hoạt chất chính của cây cho tác dụng kháng nấm, kháng khối u và kháng viêm. - Cây Bông móng tay (Impatiens balsamina L. Balsaminaceae) Cây Bông móng tay (BMT) được người dân các nước như Thái Lan, Trung Quốc sử dụng để trò bệnh nấm da và nấm nôi tạng. Hoạt chất chính trong cây là 2-methoxy-1,4-naphthoquinon đã được chứng minh có tác dụng kháng nấm da và Candida. 5 Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Cây thuốc: 19 cây thuốc, 11 loại tinh dầu, 12 mẫu riềng (khác nơi thu hái),14 mẫu Riềng nếp, 4 mẫu BMT khác màu hoa (BMT-T: hoa trắng, BMT-H: hoa hồng, BMT-Đ: hoa đỏ, BMT-t: hoa tím) được dùng để sàng lọc cây thuốc, chiết xuất và đònh lượng hoạt chất kháng M. furfur. Vi nấm: M. furfur ATCC 44344 (Mf A), Malassezia spp. chủng M1- M75 ly trích từ vẩy da lang ben, gàu, da bình thường của một số người Việt Nam. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Đã sử dụng một số phương pháp sau đây: 2.2.1. Thực vật: mô tả đặc điểm hình thái, phân tích hoa, khảo sát đặc điểm vi học bộ phận dùng của các cây thuốc. 2.2.2. Hoá học Sử dụng một số phương pháp chiết xuất thông dụng, chưng cất, kết tinh lại, sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký cột, kỹ thuật hiện hình sinh học, GC, GC-MS, HPLC, 1 H và 13 C NMR. 2.2.3. Sinh học - Phương pháp pha loãng và vi pha loãng theo NCCLS M27-A2 (2002), sử dụng môi trường chuẩn qui đònh RPMI 1640 và môi trường YPD (Yeast extract, pepton, dextrose) bổ sung các chất béo cần thiết cho sự phát triển của Malassezia spp. (S1, S2) và môi trường m-Dixon. - Khảo sát đường cong tăng trưởng của M. furfur dưới ảnh hưởng của chất thử. 6 - Khảo sát tác động của các chất nghiên cứu trên cấu trúc tế bào M. furfur ở kính hiển vi điện tử (Thin-section electron microscopy, TEM) - Khảo sát hiệu lực kháng M. furfur khi phối hợp 2 chất kháng nấm bằng Phương pháp pha loãng theo hình bàn cờ. - Tác dụng dược lý-lâm sàng-cận lâm sàng của phân đoạn có hoạt tính: Khảo sát tính kích ứng da thỏ (dùng phẩm xanh Evans), thử sơ bộ tính kích ứng da người theo Schwartz – Peck, khảo sát tính kích ứng da người tình nguyện, hiệu quả lâm sàng và cận lâm sàng khi bôi thuốc theo phác đồ điều trò. Các kết quả được phân tích theo phương pháp thống kê Fisher chính xác và Wilcoxon sau khi mã hoá điểm của các biến số. Chương 3. KẾT QUẢ 3.1. Sàng lọc dược liệu kháng M. furfur 3.1.1. sàng lọc cây thuốc và tinh dầu Đã xác đònh được 10/19 cây thuốc kháng M. furfur ATCC 44344. Thân rễ riềng và BMT tác dụng mạnh hơn những cao chiết còn lại. Tinh dầu Quế kháng M. furfur mạnh, nhưng theo Jan Hunter tinh dầu này khi dùng ngoài có thể gây kích ứng da mạnh (bảng 3.13). 3.1.2. Xác đònh loại cây và bộ phận dùng của BMT Tác dụng kháng M. furfur ATCC 44344 và M1 của cao chiết BMT theo màu hoa và bộ phận dùng khác nhau được xác đònh bằng phương pháp pha loãng (xác đònh MIC) và kỹ thuật hiện hình sinh học (xác đònh vết kháng nấm: VKN) (bảng 4,14). 7 Bảng 3.13. Tác dụng kháng M. furfur của cao chiết dược liệu và các loại tinh dầu MIC của các cao chiết từ dược liệu (mg dược liệu/ml) Cây thuốc Cao CHCl 3 Cao EtOH Cao nước 1.Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) 100 100 > 100 2. BMT (Impatiens balsamina L) 12,54 2,5 25 3.Muồng trâu (Cassia alata L.) 50 80 > 100 4. Na (Annona squamosa L.) 100 100 > 100 5. Nghệ* (Curcuma longa L.) 25 50 > 100 6. Đòa liền (Kaempferia galanga L.) 50 50 > 100 7. Rau răm (Polygonum odoratum Lour.) 100 63 > 100 8. Riềng** (Alpinia galanga Willd.) 1,56 1,56 > 100 9. Sâm đại hành (Euleutherine subaphylla Gagnep) 40 40 > 100 10. Kiến cò (Rhinacanthus nasuta (L.) Kurz.) 100 100 >100 Tinh dầu MIC (μl/ml) Tinh dầu MIC (μl/ml) 11. Bạc hà 1,25 16. Tersol 1,25 12. Bưởi 0,6 17. Tràm trà Úc 0,25 13.Eucalyptol 0,5 18. Tràm Trà Việt Nam 0,25 14. Quế 0.06 19. Tràm 0,6 15. Sả 1,25 * Nghệ 4,0 **Riềng 5,0 8 Bảng 3.14. Tác dụng kháng M. furfur của cao BMT MIC trung bình (mg cao/ml) BMT-T BMT-H BMT-Đ BMT-t Bộ phận dùng Mf A M1 MfA M1 Mf A M1 MfA M1 Lá 0,78 0,78 5,01 5,01 5,46 5,46 12,48 12,48 Hoa 0,48 0,48 1,45 1,45 0,96 0,96 2,4 2,4 Vỏ quả 0,07 0,07 0,05 0,05 0,05 0,05 0,03 0,03 Hạt 0,43 0,43 3,65 3,65 4,58 4,58 6,30 6,30 Thân 2,49 2,49 - - - - - - Toàn cây 0,19 0,19 0,83 0,83 1,34 1,34 1,35 1,35 VKN +++ ++ + +/- Cao chiết từ vỏ quả và toàn cây trên mặt đất của BMT-T kháng M. furfur mạnh hơn các cao chiết còn lại. Sắc ký đồ SKLM của cao chiết từ các loại BMT, triển khai với hệ dung môi CHCl 3 , đều cho VKN ở Rf = 0,48. Cao BMT-T cho VKN to, rõ hơn VKN của BMT hoa màu. 3.1.3. Xác đònh loài riềng kháng M. furfur mạnh Bảng 3.16. Tác dụng kháng M. furfur của các mẫu Riềng MIC trung bình (mg dược liệu /ml) MfA M1 Mẫu Tên khoa học CHCl 3 EtOH CHCl 3 EtOH VKN R BD A. galanga 3,12 3,12 1,56 1,56 +++ R BT A. galanga 7,8 5,0 5,0 5,0 +++ R HM A. galanga 3,12 3,12 1,56 1,56 +++ R TV A. galanga 7,8 4,96 4,96 4,96 +++ R TN A. conchigera 50 39,7 25 31,5 + R ĐL A. chinensis 12,5 10,0 10,0 10,0 + R KD A. purpurata > 100 > 100 > 100 > 100 - Re C. latilabre > 100 > 100 > 100 > 100 - R CT Alpinia sp 1 39,7 39,7 25 25 + R HN Alpinia sp2 6,25 6,25 4,96 3,12 +++ R TH Alpinia sp 3 50 50 25 25 + R TL Alpinia sp 4 6,25 4,96 4,96 3,12 +++ 9 Dựa vào kết quả xác đònh loài, MIC và VKN chúng tôi đã xác đònh được Riềng nếp (Alpinia galanga) kháng M. furfur mạnh hơn các mẫu riềng còn lại. Riềng nếp có VKN rõ trên bản mỏng sắc ký, triển khai với Benzen-EtOAc (9:1), Rf = 0,57 và n-hexan-EtOAc (9:1), Rf = 0,45. VKN là đònh hướng sinh học và hoá học dùng trong chiết xuất và phân lập hoạt chất kháng Malassezia từ Riềng nếp và BMT-T. 3.2. Khảo sát cây Bông móng tay trắng Tên khoa học Impatiens balsamina L. Balsaminaceae 3.2.1. Đặc điểm nhận dạng BMT-T Để chọn BMT-T, kháng Malassezia mạnh, tốt nhất nên thu hái cây tươi để dễ phân biệt màu hoa. Bột thực vật của BMT-T có chung đặc điểm với BMT hoa màu gồm: tinh thể calci oxalat hợp thành bó dài 60 -82 μm và bó ngắn 25-32,5 μm, hoặc riêng rẽ từng tinh thể; hạt phấn hoa hình bầu dục bề mặt có vân (20-32,5 μm); hạt tinh bột với tễ rõ; lông che chở đầu tà có vân dọc và lông che chở phân nhánh. Sắc ký đồ SKLM của BMT-T triển khai với hệ CHCl 3 (2 lần) phải có vết cho Rf = 0,48 to, rõ. 3.2.2. Chiết xuất cao BMT-T Bột toàn cây trên mặt đất của BMT-T được chiết xuất với các dung môi khác nhau như CHCl 3 , MeOH, EtOH 96%, EtOH 70%, EtOH 50%, EtOH 25% bằng soxhlet, đun hồi lưu, ngâm hoặc ngấm kiệt. Hiệu suất chiết của các cao BMT-T tính theo lượng cao chiết (A%) và hoạt lực kháng M. furfur (X%). Kết quả: Cao BMT-T chiết với các dung môi MeOH, EtOH 96%, EtOH 25% đều cho hiệu suất và tác dụng kháng M. furfur tương đương nhau (bảng 3.17). 10 Bảng 3.17. Hiệu suất chiết cao BMT-T với dung môi và phương pháp khác nhau Dung môi/PP chiết Dược liệu (g) Cao (mg) MIC (μg cao/ml) A% X% CHCl 3 / soxhlet 18,00 158,3 13,7 0,88 64,2 MeOH / soxhlet 18,06 140,2 12,1 0,78 64,46 EtOH 96% / soxhlet 18,00 203,5 17,6 1,13 64,20 EtOH 96%/ngâm 100,00 735,6 11,5 0,74 64.3 EtOH 70%/ĐHL 20,00 469,5 146,7 2,35 16,0 EtOH 50%/ĐHL 20,00 275,2 43,0 1,38 32.1 EtOH 50%/ NK 59,76 531,3 27,8 0,89 32,0 EtOH 25%/ĐHL 20,00 163,5 12,8 0,82 64,06 EtOH 25%/NK 59,31 343,6 9,1 0,58 63,74 EtOH 25%/ngâm 100,00 735,0 11,5 0,735 63,9 ĐHL: Đun hồi lưu, NK: Ngấm kiệt. 3.2.3. Phân lập và xác đònh cấu trúc hoá học hoạt chất kháng M. furfur Hoạt chất kháng Malassezia từ BMT-T được phân lập bằng sắc ký cột, hệ dung môi CHCl 3 , kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, gộp các phân đoạn có cùng tính chất thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 4 kết tinh cho tinh thể hình kim, chỉ cho 1 vết trên sắc ký đồ SKLM, vết này cho đường kính vòng kháng nấm (ĐKVKN) từ 24- 30 mm (thử với M. furfur ATCC 44344). Tinh thể hình kim ở phân đoạn 4 được kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim dài, màu vàng chanh, nhẹ và tơi xốp, được gọi là IB1. Kiểm tra đònh tính IB 1 - Sắc ký lớp mỏng: triển khai với 3 hệ dung môi CHCl 3 , CHCl 3 - n-hexan - EtOAc (8:1:1), EtOAc - CHCl 3 – MeOH -H 2 O (4:2:2:1): IB1 chỉ cho 1 vết duy nhất, với Rf tương ứng là 0,26; 0,43 và 0,69. - Sắc ký khí: máy sắc ký khí SHIMADZU 14B. Cột OV 17, kích thước 2,1 m x3,2 mm. Khí mang N2, 80 Kpa. Detector FID. Đo đẳng nhiệt: 11 t o cột: 255 o C; t o detector: 275 o C, t o injector: 175 o C. Trên sắc ký đồ chỉ cho 1 đỉnh duy nhất ở thời gian lưu 1,091 Xác đònh cấu trúc hoá học IB 1 IB1 được xác đònh cấu trúc hoá học bằng MS, 1 H NMR và 13 C NMR. Phổ khối, phân mảnh MS (m/z) và dòch chuyển hoá học của IB 1 phù hợp với 2-methoxy-1,4-naphthoquinon công bố trong tài liệu và thư viện phổ. Tác dụng kháng vi nấm gây bệnh lang ben của IB1: IB1 Kháng M. furfur ATCC 44344 với MIC = 4 μg/ml. IB1 chính là 2-methoxy-1,4- naphthoquinon với: ▫ Công thức nguyên là C 11 H 8 O 3 , Trọng lượng phân tử là 188. ▫ Là hoạt chất kháng M. furfur trong cây BMT-T. O O OCH 3 2-methoxy-1,4-naphthoquinon 3.3. Khảo sát thân rễ cây Riềng nếp Tên khoa học: Alpinia galanga (L.) Willd. Zingiberaceae Nhận dạng thân rễ Riềng nếp dựa vào đường kính, màu, hình dạng hạt tinh bột và vết kháng nấm (bảng 3.21). 3.3.1. Chiết xuất phân đoạn kháng M. furfur 3.3.1.1. Qui trình chiết xuất: phân đoạn kháng M. furfur từ thân rễ Riềng nếp được chiết xuất theo 2 qui trình sau: - Qui trình 1 (QT 1) chiết xuất với n-hexan bằng soxhlet. - Qui trình 2 (QT 2) chiết xuất với 2 dung môi: chiết dầu thô với cồn ethanol 96% bằng ngâm lạnh hoặc ngấm kiệt. Lắc phân bố dầu thô với n-hexan hoặc CHCl 3 để có PĐDR. So sánh tác dụng kháng M. furfur của các PĐDR bằng phương pháp pha loãng trên 2 vi nấm M. furfur ATCC 44344 và M1. Thể chất và MIC trung bình của PĐDR được trình bày trong bảng 3.22. 12 Bảng 3.21. Đặc điểm nhận dạng thân rễ Riềng nếp Đặc điểm phân biệt Loài 1. Đường kính thân rễ ≥ 2 cm 1.1. Thân rễ vàng nhạt đến trắng ngà Hạt tinh bột hình chiếc giày (+ + +) VKN (+ + + +) Mùi thơm đặc trưng Alpinia galanga (Riềng nếp) Hạt tinh bột hình chiếc giày (-) VKN (-) Mùi hăng nồng Catimbium latilare (Ré) 1.2. Thân rễ màu đỏ Nâu đỏ VKN (+ + + +) Hạt tinh bột hình chiếc giày (+) Alpinia sp 2 Alpinia sp 4 Hồng đỏ VKN (+) Hạt tinh bột hình chiếc giày (-) Alpinia chinensis 2. Đường kính thân rễ < 2 cm 2.1. Thân rễ vàng nhạt VKN (+) Hạt tinh bột hình chiếc giày (-) A. conchigera (Riềng rừng) Alpinia sp1 (R CT ) VKN (-) Hạt tinh bột hình chiếc giày (-) A. purpurata (Riềng tía) 2.2. Thân rễ đỏ nâu A. officinarum Bảng 3.22. MIC của các PĐDR chiết với dung môi hữu cơ MIC (μl/ml) PĐDR Thể chất M. furfur M1 QT 1 Dầu vàng nâu, thơm, nóng. 0,32 0,16 QT 2/n-hexan Dầu vàng nâu, thơm, nóng. 0,32 0,20 QT 2/CHCl 3 Dầu nâu đen, hăng, nóng 0,37 0,185 QT1 và QT2/n-hexan kháng M. furfur và có thể chất tương đương. 13 3.3.1.2. Hàm lượng PĐDR chiết theo QT2/n-hexan Bột thân rễ 11 lô Riềng nếp thuộc 4 mẫu (R BD , R BT , R CM , R CL ) và 1 mẫu Riềng có vỏ màu hồng tím (R BMT ) có độ ẩm từ 6,7-10%, xác đònh bằng phương pháp chiết với dung môi, độ tro toàn phần từ 6- 6,5% và độ tro không tan trong HCl Từø 0,6%-0,8%, được chiết xuất PĐDR theo QT2/n-hexan-ngấm kiệt, mỗi lô được chiết 6 lần, mỗi lần 30 g. Bảng 3.23. Hiệu suất chiết PĐDR từ các lô Riềng Lô Riềng Hiệu suất (%) Ghi chú R CM -L1→ L2 4,2 - 4,8 Củ màu vàng nhạt R CL -L1→ L4 4,6 - 6,1 Củ màu vàng nhạt R CL -L5 2,26 Củ xơ cứng R BD -L3 4,3 12 tháng tuổi R BD -L4 3,31 5 tháng tuổi R BMT 1,24 Củ màu hồng tím R BD -L2 7,5 3 năm tuổi, chiết 1,7 kg R BT 6,4 Chiết 2,9 kg Hiệu suất chiết PĐDR thay đổi theo màu và tuổi của thân rễ. 3.3.1.3. Đặc tính lý hoá của PĐDR - PĐDR có thể chất lỏng sánh, màu vàng nâu nhạt, nóng, tan trong MeOH, EtOH, cloroform, n-hexan. Không tan trong nước. Không bền trong các dung dòch acid acetic 2%; acid - benzoic 4%; acid salicylic 4%. - Tỉ trọng tương đối của PĐDR = 1,05± 0,003 (xác đònh bằng picnomet, n = 6, P = 95%). - Chỉ số khúc xạ của PĐDR từ 1,493-1,503 (n=12), (xác đònh bằng máy khúc xạ kế ở nhiệt độ 20 ± 0,5 o C với tia D màu vàng của đèn Natri có bước sóng bằng 589,3 mm). 14 3.3.1.4. Thành phần hoá học của PĐDR Thành phần hoá học của PĐDR xác đònh bằng GC-MS ở máy Fisons GC 8000. Cột DB 5 MS 30 mx 0,25 mm, 0,25 μm; khí mang Helium. Chế độ SC 43, áp suất khí 20 PSI, t o detector là 350 o C, t o injector = 250 o C. Chương trình nhiệt: khởi đầu 60 o C, gia nhiệt 10 o C / 1 phút đến 150 o C giữ trong 5 phút, sau đó gia nhiệt với tốc độ 5 o C / 1 phút đến 260 o C, giữ ở 260 o C /10 phút. So sánh các phân mảnh MS của các hợp chất trong PĐDR với thư viện phổ đã xác đònh được 19/29 chất gồm terpenoid (7 chất), hợp chất có khung hydrocarbon mạch thẳng (10 chất), khung hydrocarbon mạch vòng (2 chất) và 10 chất chưa xác đònh do không có trong thư viện phổ. Trong 10 chất chưa xác đònh tên có 1 chất cho phổ khối tương tự galangal acetat, chiếm tỉ lệ 61,14%. 3.3.2. Phân lập và xác đònh cấu trúc hoá học hoạt chất kháng M. furfur từ PĐDR 3.3.2.1. Phân lập hoạt chất bằng sắc ký cột Cột sắc ký Silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 40-63 μm (45 g), 2,5 cm x 40 cm. Hệ dung môi: n-hexan – EtOAc (8:2). Gộp những phân đoạn có tính chất giống nhau, thu được tổng cộng 9 phân đoạn (từ phân đoạn A đến phân đoạn I), kiểm tra các phân đoạn bằng cảm quan, SKLM triển khai với hệ dung môi n-hexan- EtOAc (8:2) và đònh tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán (vi nấm M. furfurATCC 44344, tẩm 1 μl phân đoạn G/ đóa giấy). Kết quả: Phân đoạn G: chỉ cho 1 vết ở SKLM (VKN); Rf = 0,32. Kháng M. furfur với ĐKVKK = 25 mm. 3.3.2.2. Đònh tính phân đoạn G Sắc ký khí: trên sắc ký đồ GC, phân đoạn G chỉ cho 1 đỉnh duy nhất ở thời gian lưu 12,45. [...]... chế phẩm điều trò bệnh lang ben Kết luận Qua thời gian nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben chúng tôi thu được một số kết luận sau: 1 Vỏ quả của cây Bông móng tay hoặc toàn cây trên mặt đất của Bông móng tay trắng (Impatiens balsamina L Balsaminaceae) và thân rễ Riềng nếp (Alpinia galanga (L.) Willd.) kháng vi nấm gây bệnh lang ben mạnh hơn các cây thuốc khảo cứu 2 Đề nghò được... được tiếp tục nghiên cứu, chúng tôi kiến nghò một số vấn đề sau: 1 Nghiên cứu phối hợp giữa PĐDR và cao BMT-T, PĐDR và một số chất khác về tác dụng kháng vi nấm Malassezia spp để giảm được tính kích ứng da nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính 2 Nghiên cứu chế phẩm từ PĐDR, PĐDR và BMT-T để điều trò bệnh lang ben ở giai đoạn lâm sàng 3 Tiếp tục nghiên cứu hoạt chất kháng Malassezia spp của Bông móng tay: bán tổng... Hiệu quả lâm sàng Thuốc chứa PĐDR 1,25% và 0,6% giúp cải thiện về lâm sàng rõ rệt Sau 1 tuần bôi thuốc vết lang ben hết bong vẩy, vết lang ben mờ sau 2 tuần bôi thuốc và hết bệnh sau 3 tuần Cận lâm sàng Không còn ổ nấm trên vẩy da bệnh chỉ sau 1 tuần bôi thuốc, lượng tế bào nấm trên vẩy da giảm dần đến bình thường sau 3 tuần bôi thuốc Sự khác biệt về lâm sàng và cận lâm sàng sau khi bôi thuốc so với ban... qui Nếu xét kết quả in vitro, cao BMT-T, PĐDR và hoạt chất kháng vi đònh giới hạn đònh lượng GA% trong thân rễ Riềng nếp chúng tôi nấm gây bệnh lang ben yếu hơn ketoconazol, nhưng tiêu chuẩn dựa trên 2 cơ sở: hàm lượng PĐDR chiết được theo QT 2/n-hexan hàng đầu để lựa chọn một chất kháng nấm đưa vào sử dụng là hiệu và lượng GA% có trong PĐDR Giới hạn mức hàm lượng GA% quả ở in vivo và lâm sàng PĐDR... được chúng tôi sử dụng để thử nấm và hàm lượng PĐDR và GA% trong riềng nếp Vi t Nam khá tính kích ứng và hiệu quả điều trò bệnh lang ben cao; PĐDR và cao BMT-T tác dụng bổ sung trên 2 dạng phát triển 4.3 Tác dụng kháng Malassezia spp của PĐDR, cao BMT-T và men và sợi của M furfur là tiền đề để nghiên cứu sử dụng các cây hoạt chất này làm nguyên liệu điều chế thuốc trò lang ben, ngoài ra còn giúp Để xác... kháng được khảo sát gồm: (1) Nồng độ tối thiểu ức chế sự chuyển dạng PĐDR + acid benzoic Đối kháng của Malassezia từ nấm men sang nấm sợi (MT), ở môi trường PĐDR + cao BMT-T Riêng rẽ đến PĐDR ức chế dạng sợi, cộng lực cao BMT-T ức chế dạng RPMI đã được thay đổi thành phần chất bổ sung để vi nấm phát men của M furfur triển dưới dạng sợi như ở vẩy da lang ben (2) Tác động trên sự tăng trưởng của vi nấm. .. Kindo AJ và cs kháng Malassezia ly trích được từ BMT-T Vi t Nam là 2-methoxy- (nghiên cứu trên vẩy da lang ben người n) và của Christina M 1,4- naphthoquinon và Riềng nếp Vi t Nam là galangal acetat Gemmer (trên vẩy da gàu của người Hà lan), sự khác biệt này có Đây là các hợp chất chính cho tác dụng kháng Candida, nấm da và thể do mỗi loài Malassezia có nôi sinh thái, đặc tính di truyền và nấm mốc của... vi nấm (3) Tác động trên cấu trúc tế bào M furfur quan sát ở kính hiển vi điện tử (TEM) (bảng 3.46) 3.6 Phối hợp tác động của PĐDR PĐDR được khảo sát hiệu lực kháng Malassezia spp khi phối hợp với một số chất kháng nấm khác như acid salicylic, acid benzoic và cao BMT-T Sử dụng phương pháp pha loãng theo hình bàn cờ, trên một số vi nấm gồm M furfur ATCC44344, M1, M8 và M9 (bảng 3.48) Ghi chú 3.7 Thăm... được nồng độ tối thiểu ức chế sự chuyển dạng của M furfur từ dạng nấm men sang dạng nấm sợi của PĐDR, GA, cao BMT-T và IB1 ở môi trường RPMI-S2 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1 Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Trần Xuân Mai (2002), “Khảo sát tác dụng kháng vi nấm gây bệnh lang ben của một số loài Riềng”, Y học TP Hồ Chí Minh Tập 6, Phụ bản 4, tr 299-303... bôi thuốc) có ý nghóa thống kê (test Wilcoxon, P < 0,01 sau 1 tuần bôi thuốc và P < 0,05 sau 3 tuần bôi thuốc) Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Sàng lọc dược liệu kháng M furfur - Kết hợp các phương pháp phân tích đặc điểm thực vật, thử hoạt tính kháng Malassezia spp in vitro và kỹ thuật hiện hình sinh học chúng tôi đã xác đònh Riềng nếp và cây Bông móng tay kháng M furfur mạnh Những cây này đã được người Vi t . vậy chúng tôi nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben nhằm có thể: Chứng minh hiệu quả điều trò, cơ chế tác động kháng vi nấm gây bệnh lang ben của các cây thuốc đang được. theo kinh nghiệm để trò lang ben và bệnh nấm da như củ Riềng, Rau răm, Muồng trâu Vì vậy, thực hiện đề tài Nghiên cứu một số cây thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben chúng tôi mong muốn. PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN ĐINH NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CÂY THUỐC KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH LANG BEN CHUYÊN NGÀNH: ĐÔNG DƯC VÀ THUỐC NAM MÃ SỐ: 3.02.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC NGƯỜI