Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen ở nấm sợi aspergillus bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn TS Trần Đức Long Hà Nội - 2017 z LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣởng Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời tận tình bảo, hƣớng dẫn ln tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Đức Long nhiệt tình góp ý, cố vấn cho em suốt trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Em vô biết ơn thầy cô Bộ môn Di truyền học Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ em trình học tập Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo thành viên Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất môi trƣờng làm việc để em hồn thành tốt nghiên cứu Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới học viên cao học Đỗ Thị Bình Xuân Lộc nhiệt tình giúp đỡ em q trình thực thí nghiệm Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè em, anh chị Phịng Genomic khích lệ, giúp đỡ em suốt trình học tập sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017 Học viên Trần Thị Phƣơng z DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA - fluoroorotic acid A awamori Aspergillus awamori A nidulans Aspergillus nidulans A niger Aspergillus niger A oryzae Aspergillus oryzae A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (biến nạp trung gian/nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) bp base pair CD Czapek Dox DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GRAS Generally Recognized As Safe (đƣợc cơng nhận an tồn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) kb kilo base pairs LB Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trƣờng LB) z NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PEG Polyethylen Glycol PSM Phytase-screening medium (môi trƣờng sàng lọc sinh phytase) RB Right border (biên phải) SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA T-DNA Transfer DNA Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u) ura Uracil uri Uridine Vir Virulence region (vùng độc lực) WT Wild-type (chủng tự nhiên) z MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Vai trò nấm sợi 1.1.3 Giới thiệu chung chi nấm sợi Aspergillus .5 1.2 Giới thiệu chung Aspergillus oryzae 1.2.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A oryzae .6 1.2.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae 1.2.3 Vai trò nấm sợi A oryzae 1.3 Giới thiệu chung A niger 10 1.3.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A niger 10 1.3.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A niger 12 1.3.3 Vai trò nấm sợi A niger 12 1.4 Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi 14 1.4.1 Chuyển gen xung điện (electroporation) 14 1.4.2 Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) 15 1.4.3 Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15 1.5 Hệ thống marker dùng cho chuyển gen nấm sợi 25 1.5.1 Hệ thống marker chọn lọc thể chuyển gen .25 1.5.2 Hệ thống marker thị dùng chuyển gen 28 1.6 Promoter biểu gen nấm sợi 30 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 33 2.1 Nguyên liệu .33 2.1.1 Chủng vi sinh vật 33 2.1.2 Thiết bị hóa chất 34 2.1.3 Các môi trƣờng sử dụng nghiên cứu .36 z 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Thu bào tử nấm .39 2.2.2 Tách chiết DNAtổng số 39 2.2.3 Thành phần phản ứng PCR 40 2.2.4 Xử lý enzyme giới hạn .41 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 43 2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens .44 2.2.7 Sàng lọc thể chuyển gen 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen 48 3.1.1 Chủng nấm A niger N402đƣợc lựa chọn để xóa gen .48 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm A oryzae VS1 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil 49 3.2 Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil .50 3.2.1 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG .51 3.2.2 Xóa thành cơng gen pyrG A niger N402 52 3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil 58 3.3.1 Tạo vector pEX2A 58 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ uridine/ uracil đến phục hồi sinh trƣởng chủng xóa gen pyrG 59 3.3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil 61 3.3.4 Đánh giá hiệu chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A niger N402 trợ dƣỡng 64 3.4 Biểu gen DsRed A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A 65 3.4.1 Mức độ tƣơng đồng gen pyrG chi Aspergillus .65 3.4.2 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae .66 3.5 Biểu gen huỳnh quang DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA từ A niger .72 z 3.5.1 Tạo vector pEX2C 72 3.5.2 Biểu gen DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA thông qua vector pEX2C .73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 Kết luận 79 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 z DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật vector dùng nghiên cứu 33 Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu 35 z DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái số lồi nấm mốc đĩa petri Hình 1.2 Hình thái cấu trúc hiển vi A oryzae Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc cấu trúc hiển vi nấm A niger 11 Hình 1.4 Cấu trúc Ti plasmid 17 Hình 1.5 Mơ hình vi khuẩn A tumefaciens với hệ thống vector nhị thể 20 Hình 1.6 Biểu gen huỳnh quang GFP nấm sợi A oryzae 29 Hình 1.7 Biểu gen DsRed chủng nấm sợi A oryzae AUT1-PlD 30 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm A niger 47 Hình 3.2 Hình thái cấu trúc hiển vi chủng A oryzae VS1 48 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.3 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG nấm Aspergillus niger 51 Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa 52 pyrG A1, A2, A3 Hình 3.5 Quy trình xóa gen pyrG nấm sợi A niger sử dụng phƣơng 53 pháp ATMT Hình 3.6 Kết xóa gen môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1% 53 uridine, 0,1% uracil 0,2% 5-FOA Hình 3.7 Kiểm tra khả sinh trƣởng chủng đột biến môi trƣờng khác z 54 Hình 3.8 Xác nhận chủng xóa gen pyrG 55 Hình 3.9 Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A 57 Hình 3.10 Ảnh hƣởng nồng độ uridine/uracil đến khả sinh 59 trƣởng chủng đột biến xóa gen pyrG Hình 3.11 Kết tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A niger N402 61 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.12 Quy trình tối ƣu chuyển gen vào nấm A niger N402 trợ dƣỡng 62 vi khuẩn A tumefaciens Hình 3.13 Biểu gen huỳnh quang DsRed chủng A niger N402 trợ 64 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.14 Sự tƣơng đồng pyrG lồi Aspergillus khác 65 Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil 66 Hình 3.16 Kết chuyển gen DsRed vào A oryzae chủng RIB40 VS1 67 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.17 Biểu gen huỳnh quang DsRed chủng RIB40 trợ dƣỡng 68 uridine/uracil Hình 3.18 Xác nhận chuyển gen DsRed vào A oryzae VS1∆pyrG sử 69 dụng vector pEX2A Hình 3.19 Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2C 72 Hình 3.20 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector 73 pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4 z Hình 3.21 Kết chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C vào A niger 73 N402 A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.22 Biểu gen DsRed chủng nấm A niger N402 trợ dƣỡng 75 uridine/uracil Hình 3.23 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil z 76 MỞ ĐẦU Aspergillus chi nấm sợi phổ biến tự nhiên có vai trị quan trọng sản xuất thực tiễn Một số loài nấm thuộc chi đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) cơng nhận an tồn (Generally Regarded as Safe, GRAS) dùng sản xuất công nghiệp nhƣ A oryzae, A niger, A awamori, A sojae, … Trong đó, hai loài A niger A oryzae với khả tiết mạnh enzyme vào môi trƣờng nuôi cấy nên đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất nhiều loại enzyme thƣơng mại dạng tự nhiên tái tổ hợp Gần đây, hệ gen A niger A oryzae đƣợc giải trình tự hoàn toàn tiền đề cho cải biến di truyền nâng cao hiệu suất biểu gen mong muốn hai loài nấm Hiện nay, hai phƣơng pháp chuyển gen phổ biến nấm sợi chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast) chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần phức tạp với chi phí cao hiệu không ổn định lần lặp lại Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT) lần đƣợc áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ thực hiện, chi phí thấp hiệu suất ổn định Tuy nhiên, phƣơng pháp chuyển gen ATMT chủ yếu sử dụng gen kháng kháng sinh nên khó áp dụng vào điều kiện sản xuất thực tế nguy phát tán gen kháng thuốc vào mơi trƣờng Chính vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dƣỡng (marker trợ dƣỡng) hƣớng tiếp cận an toàn, hiệu chi phí có tiềm ứng dụng vào sản xuất thực tiễn Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu cao cho nấm sợi Aspergillus sử dụng vi khuẩn A tumefaciens marker trợ dƣỡng, thực đề tài: “Nghiên cứu tạo số vector nhị thể dùng cho chuyển gene nấm sợi Aspergillus vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với nội dung nhƣ sau: z - Tạo chủng A niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil cách xóa gen pyrG - Tạo số vector nhị thể dùng để chuyển gen biểu gen hai loài nấm sợi A niger A oryzae - Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu cho nấm sợi A niger sử dụng chủng trợ dƣỡng uridine/uracil marker trợ dƣỡng pyrG - Đánh giá hiệu hệ thống chuyển gen sử dụng gen thị huỳnh quang đỏ DsRed z Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm sinh học Nấm sợi (nấm mốc) vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử sống hoại sinh nhờ khả tiết enzyme để phân hủy hợp chất hữu có mơi trƣờng Chúng phân bố rộng khắp trái đất đóng vai trị quan trọng tự nhiên nhƣ đời sống ngƣời Nấm thƣờng sinh trƣởng bề mặt chất tạo thành dạng sợi nhƣ lông tơ, mạng nhện sợi bơng đƣợc gọi hệ sợi [23] Hình 1.1 Hình thái số lồi nấm mốc điển hình (A) Aspergillus fumigatus (B) Penicillium rubens (C) Trichoderma sparsum (D) Aspergillus flavus (E) Aspergillus oryzae (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100] Từ bào tử nảy mầm, sợi nấm phát triển phân nhánh hình thành nên khuẩn lạc nấm Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trƣởng đỉnh sợi phân nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì nhƣ bơng Hệ sợi nấm phát triển từ đoạn sợi nấm sinh dƣỡng Phần lớn sợi nấm có dạng suốt Tuy nhiên, số lồi, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc đặc trƣng hệ sợi tiết sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển Một số lồi có tƣợng tiết hợp chất hữu tạo nên tinh thể bề mặt hệ sợi z [3] Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, đƣợc bao phủ lớp thành cứng, bên chứa nguyên sinh chất có khả di chuyển Chiều dài sợi nấm thƣờng không xác định, nhƣng đƣờng kính ống sợi tƣơng đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy thuộc vào lồi điều kiện sinh trƣởng Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa xung quanh, phủ bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên khuẩn lạc nấm dạng tròn, đồng thời ăn sâu vào chất [35] Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trình sinh trƣởng Tuy nhiên, số loài, ánh sáng lại yếu tố quan trọng q trình hình thành bào tử Nấm sợi có khoảng giới hạn nhiệt độ tƣơng đối rộng Giới hạn dƣới số loài nấm sợi từ 2oC - 5oC, giới hạn từ 47oC - 53oC Một số lồi nấm sống sót dƣới điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt 0oC 60oC Khoảng nhiệt độ tối ƣu cho phát triển nấm sợi từ 22oC - 37oC Nhìn chung, lồi nấm sợi phát triển mơi trƣờng axit Một số lồi phát triển tốt mơi trƣờng pH nhỏ 3, số lồi phát triển đƣợc điều kiện pH lớn 9, nhƣng hầu hết loài nấm sợi phát triển tốt khoảng pH từ - 6,5 Vì nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc nên ơxi yếu tố khơng thể thiếu trình sinh trƣởng phát triển nấm sợi [23, 35] Nấm sợi có hai hình thức sinh sản sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính Sinh sản vơ tính bao gồm sinh sản sinh dƣỡng đoạn sợi nấm sinh sản hình thành bào tử đính (conidia) Q trình sinh sản hữu tính số lồi với tham gia giao tử đực giao tử trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân, dung hợp tế bào chất trình giảm phân để hình thành bào tử đơn bội [3, 35] Ngoài ra, số lồi nấm sợi cịn có hình thức sinh sản cận hữu tính (parasexual) Năm 1956, hình thức sinh sản lần đƣợc mô tả nhà di truyền học ngƣời Ý Guido Pontecorvo nghiên cứu Aspergillus nidulans Chu trình sinh sản cận hữu tính đƣợc bắt đầu nhân đơn bội dung hợp vào tế bào sinh dƣỡng hệ sợi sau tiếp tục phân chia Trong chu trình sinh sản cận hữu tính xảy trao đổi chéo vùng tƣơng đồng nhiễm sắc thể (NST) z Đặc điểm đƣợc sử dụng để lập đồ gen gắn thêm gen vào nhóm gen liên kết lồi [18] 1.1.2 Vai trị nấm sợi Nấm sợi có ý nghĩa quan trọng tự nhiên đời sống ngƣời Nhờ khả sinh trƣởng tốt môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng khả tổng hợp hợp chất hữu quan trọng, nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu ứng dụng sản xuất công nghiệp Các sản phẩm tạo từ nấm sợi vô phong phú, từ axit hữu đến enzyme hay chất chuyển hóa phức tạp đƣợc ứng dụng nhiều mặt sống Nấm sợi đƣợc coi nhà máy tế bào lý tƣởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme Khoảng 40% enzyme thƣơng mại thị trƣờng có nguồn gốc từ nấm sợi Chúng đóng vai trị quan trọng ngành công nghiệp then chốt nhƣ công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15] Phần lớn enzyme đƣợc sản xuất từ lồi thuộc chi Aspergillus Trichoderma chúng có khả tiết lƣợng lớn enzyme, protein vào môi trƣờng Nhiều lồi nấm mốc đƣợc cơng nhận an toàn tiêu biểu nhƣ A oryzae, A niger, A awamori, A sojae [9, 15, 34] Ngoài enzyme, nấm sợi đƣợc dùng làm nhà máy sản xuất axit hữu Các axit hữu chủ yếu đƣợc sinh tổng hợp nấm sợi axit citric, axit gluconic, axit itaconic với sản lƣợng hàng nghìn năm Các axit đƣợc sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may y dƣợc [15] Trong hệ sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy hợp chất hữu thiếu chu trình chuyển hóa vật chất Ngồi ra, nấm cịn đƣợc sử dụng làm sinh vật mơ hình di truyền học, hóa sinh học nhiều lĩnh vực khác Bên cạnh đó, có số loài nấm gây hại nhƣ Aspergillus fumigatus gây bệnh hội ngƣời, Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay số loại nấm sợi gây hỏng rau sau thu hoạch gây bệnh trồng [14] 1.1.3 Giới thiệu chung chi nấm sợi Aspergillus Aspergillus chi nấm sợi phổ biến phân bố toàn cầu Hiện Aspergillus có khoảng 250 lồi với đại diện tiêu biểu nhƣ A niger, A z oryzae, A nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30] Các loài chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao hình thái nên khó để phân biệt cách xác có khả sinh sản vơ tính hình thành bào tử Bào tử Aspergillus nhẹ, xốp có khả phát tán dễ dàng khơng khí Khi gặp bề mặt chất rắn lỏng, chúng đƣợc giữ lại nảy mầm gặp điều kiện phù hợp Chính khả khiến chúng phân bố rộng khắp giới [14] Hai đại diện tiêu biểu chi Aspergillus A oryzae A niger A oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất tƣơng, soyu, rƣợu sake nƣớc Châu Á, đặc biệt Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippine Việt Nam A niger đƣợc sử dụng phổ biến sản xuất axit citric phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, dệt may với sản lƣợng 1,6 triệu năm Bên cạnh đó, A oryzae A niger đƣợc sử dụng để khai thác enzyme protease, amylase, phytase số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp quan trọng khác [14, 15] Các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus phù hợp cho nghiên cứu kiểm soát biểu gen trình tiết protein tế bào sinh vật nhân thực dễ dàng phân lập tạo chủng đột biến [16] 1.2 Giới thiệu chung Aspergillus oryzae 1.2.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A oryzae Aspergillus oryzae hay cịn có tên gọi khác nấm Koji Đây loài nấm phổ biến chi Aspergillus đƣợc sử dụng lâu đời ngành công nghiệp lên men nƣớc châu Á tiêu biểu Nhật Trung Quốc Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi chi Aspergillus họ Trichocomaceae A oryzae nuôi cấy mơi trƣờng thạch có dạng hệ sợi, màu trắng xám sau phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh Hệ sợi phát triển mạnh, bao gồm sợi mỏng, suốt, đƣờng kính - 7µm, phân nhánh nhiều Từ sợi nằm ngang hình thành nên sợi khí sinh mang cuống sinh bào tử (cơ quan sinh sản vơ tính) Cuống sinh bào tử A oryzae thƣờng dài từ - mm, phía đầu cuống sinh bào tử phình lên gọi thể bình, từ thể bình mọc lên tế bào nhỏ, thuôn dài z đƣợc gọi tế bào hình chai Đầu tế bào chai phân chia thành bào tử đính (conidia) Bào tử A oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau tạo thành màu đặc trƣng khuẩn lạc [43, 62] Hình thái cấu trúc khuẩn lạc nấm mốc A oryzae đƣợc mơ tả chi tiết Hình 1.2 Hình 1.2 Hình thái cấu trúc hiển vi A oryzae [41] (A, B) Hình thái khuẩn lạc đĩa CYEA, MEA (C) Cuống sinh bào tử (D, E) Hình thái cấu trúc hiển vi cuống sinh bào tử (F) Bào tử A oryzae A oryzae phân bố rộng khắp toàn giới, đặc biệt nƣớc nhiệt đới Vì sinh vật hiếu khí bắt buộc nên A oryzae thƣờng đƣợc tìm thấy nơi giàu ôxi, bề mặt nhiều loại chất cung cấp dinh dƣỡng cần thiết cho chúng Chúng sinh trƣởng phát triển dễ dàng nhiều loại chất nhƣ mảnh vụn thực vật, cây, gỗ mục, loại hạt… Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng, phát triển A oryzae 30oC - 40oC [49] z 1.2.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae Hệ gen đầy đủ chủng quốc tế A oryzae RIB40 đƣợc công bố năm 2005, gồm nhiễm sắc thể (NST) hệ gen ty thể, kích thƣớc ƣớc tính đạt 37,6 Mbp với khoảng 1207 gen, lớn 25% - 30% so với hệ gen số loài thuộc chi Aspergillus So với lồi chuẩn dùng nghiên cứu phịng thí nghiệm A nidulans lồi gây bệnh hội ngƣời A fumigatus hệ gen A oryzae lớn lần lƣợt 29% - 34% [63] Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen diễn lồi có quan hệ gần gũi với A oryzae A niger A flavus, đặc biệt A flavus có hệ gen tƣơng đồng với A oryzae đến 99,5% Hệ gen A oryzae lớn thu nạp thêm DNA q trình tiến hóa [62, 87] Theo nghiên cứu gần đây, loài A oryzae, A fumigatus A nidulans chứa lần lƣợt 135, 99, 90 gen mã hóa cho protease, chiếm khoảng 1% hệ gen (genome) Tất gen mã hóa cho protease có mặt hai lồi A fumigatus A nudilans có mặt A oryzae nhƣng có gen mã hóa cho số enzyme có mặt A oryzae mà khơng tồn hai lồi cịn lại Ngồi ra, A oryzae sở hữu số gen mã hóa cho protease có khả hoạt động môi trƣờng axit mà theo dự đốn chúng đƣợc hình thành q trình hóa ngƣời [62] 1.2.3 Vai trị nấm sợi A oryzae A oryzae đƣợc sử dụng phổ biến ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt công nghiệp thực phẩm lên men Ngay từ thời cổ xƣa, quốc gia châu Á nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản sử dụng chúng để tạo nên sản phẩm lên men tiếng nhƣ nƣớc tƣơng, miso, soyu, rƣợu sake nhiều sản phẩm khác [50, 104] A oryzae đƣợc sử dụng phổ biến công nghệ thực phẩm đặc tính sinh trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn enzyme thủy phân nhƣ amylase, glucoamylase, protease, … trình sinh trƣởng tạo mùi thơm dễ chịu cho sản phẩm Một ứng dụng đặc biệt A oryzae công nghệ lên men truyền thống Nhật công nghệ lên men chất rắn (gạo, đậu tƣơng cám gạo) tạo điều kiện cho phát triển hiếu khí A oryzae Độ ẩm thích hợp q trình lên men mơi z trƣờng rắn giúp tăng khả tiết enzyme chất chuyển hóa mà thƣờng khơng xảy trình lên men lỏng [50, 63] Ở Việt Nam, kỹ thuật làm tƣơng đƣợc hình thành từ xa xƣa ngày đƣợc sử dụng nhiều nơi đặc biệt tỉnh miền Bắc Phƣơng pháp lên men truyền thống sử dụng nấm mốc A oryzae đƣợc đánh giá an toàn so với phƣơng pháp lên men sử dụng hóa chất phân giải sinh nhiều độc tố đặc biệt 3-MCPD (3-monochoropropane-1,2diol) [5] Tuy nhiên, phƣơng pháp lên men truyền thống có mặt hạn chế q trình phơi mốc tự nhiên khơng đảm bảo an tồn Trong q trình phơi mốc, ngồi chủng mốc an tồn A oryzae ngun liệu có khả bị nhiễm mốc A flavus sinh độc tố aflatoxin - chất gây ung thƣ gan hàng đầu Hình thái A flavus gần nhƣ giống hệt với A oryzae nên khó để phân biệt hai loài tự nhiên Hơn nữa, giải trình tự hai chủng đại diện cho hai lồi, nhận thấy hệ gen hai chủng A oryzae RIB40 A flavus NRRL3357 có độ tƣơng đồng 99,5% DNA 98% protein [87] Nấm sợi A oryzae khác với A flavus việc khả sinh độc tố aflatoxin q trình tiến hóa tích lũy nhiều đột biến điểm đột biến đoạn số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin [20] Không đƣợc sử dụng công nghiệp thực phẩm, A oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp sản xuất enzyme, sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Các loại enzyme đƣợc sản xuất từ A oryzae nhƣ glucoamylase, α-amylase số protease với giá trị kinh tế cao đƣợc sử dụng công nghiệp sản xuất bánh kẹo đồ uống [98] Đây loài cung cấp enzyme protease sản lƣợng lớn phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất chất tẩy rửa [8] Hiện nay, hiểu biết hệ gen A oryzae với phát triển vƣợt bậc công nghệ sinh học đại, đặc biệt kỹ thuật di truyền, cho phép nghiên cứu chi tiết vai trò gen biểu chúng cách chủ động loài nấm sợi an toàn z 1.3 Giới thiệu chung A niger 1.3.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A niger Năm 1867 nấm sợi A niger lần đƣợc phân lập nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem A niger thuộc phân nhóm Nigri (cịn gọi phân nhóm Aspergillus đen) chi Aspergillus, họ Trichocomaceae Đây lồi điển hình phổ biến chi Aspergillus phân bố rộng khắp vùng địa lý giới [30] Nấm phát triển nhanh, chịu nhiệt, chịu lạnh tốt nên bắt gặp nơi đâu, từ đất, nƣớc, khơng khí, mảnh vụn thực vật, hoa thối rữa đến tƣờng nhà [93] Dƣới kính hiển vi quan sát thấy sợi nấm suốt, có vách ngăn, phân nhánh liên tục, đƣờng kính hệ sợi 2,5 - 8µm Cuống sinh bào tử dài 300 - 400µm, đƣờng kính 40 - 70µm, khơng màu, đầu gắn với bọng hình cầu có màu sẫm Bọng cầu đƣợc bao phủ thể bình sơ cấp có màu suốt tới nâu, có vách ngăn Trên tầng thể bình sơ cấp thể bình thứ cấp, đính bào tử hình cầu có gai nhọn với đƣờng kính 3,5 - 5µm Sợi nấm phát triển có màu trắng, sau đƣợc bao phủ bào tử có màu nâu đen tạo nên màu sắc đặc trƣng [23, 67] Hình thái khuẩn lạc cuống sinh bào tử nấm sợi A niger đƣợc mô tả chi tiết Hình 1.3 10 z Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc cấu trúc hiển vi nấm A niger [45, 53] (A) Hình thái khuẩn lạc đĩa mơi trƣờng Czapek-Dox, (B) Rìa ngồi khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi cuống sinh bào tử (E) Bào tử nấm sợi A niger Nấm sợi A niger sinh trƣởng tối ƣu nhiệt độ từ 28oC - 37oC, nhƣng có khả chịu lạnh xuống tới 6oC sống sót nhiệt độ lên đến 47oC Trong khoảng nhiệt độ tối ƣu, bào tử A niger dễ dàng nảy mầm phát triển mạnh Ở 30oC, bào tử trƣơng nở, kết hợp với vật liệu thành tế bào toàn bề mặt tập trung cực để hình thành nên đỉnh sợi nấm Sợi nấm tăng sinh đỉnh sợi, phát triển chiều dài phân nhánh tạo sợi nhỏ Các sợi nhỏ lại tiếp tục phân nhánh để tạo nên mạng hệ sợi lan khắp bề mặt chất Ở điều kiện bất lợi (> 40oC) bào tử không nảy mầm mà trƣơng nở tích nƣớc, đồng thời tập trung vật liệu thành tế bào khắp bề mặt tạo nên lớp thành vững 11 z để bảo vệ bào tử khỏi điều kiện bất lợi bên Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy chồi trực tiếp phát triển thành hệ sợi nấm Đặc điểm giúp cho bào tử A niger đƣợc bảo vệ lâu dài dƣới điều kiện khắc nghiệt [23] Ngồi khả chịu lạnh, chịu nóng tốt, A niger cịn có giới hạn pH rộng từ 1,5 - 9,8 Điều cho phép chúng sinh trƣởng tốt mơi trƣờng có độ axit thấp dƣới mức chuẩn nhiều loài pH tối ƣu cho loài nấm phát triển khoảng - 6,5 Độ ẩm tối thiểu cần thiết cho sinh trƣởng A niger 23% Nấm mốc A niger không cần ánh sáng cho sinh trƣởng phát triển [23] 1.3.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A niger Kích thƣớc hệ gen chủng A niger dao động khoảng 33,9 đến 38,5 Mb với khoảng 13000 gen, 6000 - 8000 gen hoạt động [24] Năm 2007, trình tự hệ gen A niger chủng CBS 513.88 đƣợc cơng bố Theo đó, kích thƣớc hệ gen CBS 513.88 33,9 Mb, với 14165 khung đọc mở có 55% gen tham gia mã hóa cho sản phẩm protein Trong số 14165 khung đọc mở có 3002 trình tự mã hóa cho sản phẩm liên quan đến chuyển hóa Dữ liệu cho thấy A niger nhà máy đầy tiềm cho ngành công nghiệp sinh học [82] 1.3.3 Vai trò nấm sợi A niger Nấm sợi A niger giữ vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp thực phẩm, đặc biệt cơng nghệ lên men [23] Nó đƣợc đánh giá vi sinh vật tiềm sản xuất amylase Amylase enzyme phổ biến chiếm 25 - 35% lƣợng enzyme thƣơng mại thị trƣờng đƣợc sử dụng cho trình thủy phân tinh bột sản xuất bánh mì, bia việc loại bỏ keo từ vải Có nhiều nguồn cung cấp enzyme nhƣ động vật, thực vật vi sinh vật nhƣng amylase có nguồn gốc từ nấm đƣợc ƣa chuộng có khả hoạt động mơi trƣờng pH thấp Ngồi ra, A niger cịn có khả sản xuất invertase xúc tác thủy phân sucrose tạo thành glucose fructose, pectinase đƣợc ứng dụng tiền xử lý loại nƣớc ép trái để loại bỏ cặn nhƣ làm giảm vẩn đục rƣợu vang, α- 12 z galactosidase chống đầy khó tiêu có thành phần thuốc dày Các enzyme protease có nguồn gốc từ nấm A niger đƣợc sử dụng để sản xuất phụ gia Clarity-FERM sử dụng ngành công nghiệp sản xuất bia để giảm hàm lƣợng gluten lúa mạch, sử dụng rã đông thịt giảm độ đàn hồi protein gluten bánh mì [84] Cellulase sản xuất A niger đƣợc sử dụng công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy bột giấy, đặc biệt công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh [6] Một enzyme khác có vai trị quan trọng công nghiệp thức ăn chăn nuôi đƣợc sản xuất thƣơng mại nấm mốc A niger enzyme phytase Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic (phytate) dạng khó tiêu có mặt ngũ cốc hạt chứa dầu thành dạng photpho vơ sử dụng đƣợc Bổ sung phytase vào thức ăn chăn ni giúp vật ni dày đơn dễ dàng hấp thụ phospho đồng thời làm giảm tiết phytate qua phân, từ hạn chế đƣợc nhiễm mơi trƣờng Phytase cịn giúp giải phóng canxi nguyên tố vi lƣợng khác, giảm lƣợng phospho vô sử dụng; giảm chi phí thức ăn cho vật ni [1, 102] Ngồi khả tiết phổ rộng loại enzyme công nghiệp, A niger đƣợc coi nhà máy tế bào chuyên sản xuất loại axit hữu A niger lần trở thành sinh vật sản xuất axit citric năm 1919 Axit citric chất phụ gia giúp tăng hƣơng vị, giảm độ sản phẩm ngành công nghiệp thực phẩm nƣớc giải khát Sắt citrate đƣợc sử dụng làm chất bảo quản máu cơng nghiệp dƣợc phẩm Ngồi ra, axit citric cịn đƣợc dùng thuốc tẩy, thuộc da, mạ điện nhiều ứng dụng khác Axit citric đƣợc sản xuất quy mô công nghiệp chủ yếu nhờ lên men loài Aspergillus đặc biệt A niger A wentiti chúng tạo lƣợng lớn axit citric tạo sản phẩm phụ không mong muốn Năm 2000, sản lƣợng axit citric toàn cầu đạt 900000 Đến năm 2007, sản lƣợng axit citric toàn cầu ƣớc đạt 1,6 triệu đƣợc sản xuất chủ yếu A niger Một axit hữu khác đƣợc sản xuất thƣơng mại nấm A niger axit 13 z gluconic Sản lƣợng axit gluconic ƣớc tính tồn cầu năm từ 50000 đến 100000 tấn, đƣợc sử dụng nhƣ phụ gia thực phẩm [14, 88] 1.4 Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi Chuyển gen kỹ thuật đƣa nhiều gen lạ đƣợc thiết kế dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ làm cho gen lạ tồn dạng plasmid tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Kỹ thuật chuyển gen đƣợc áp dụng để chuyển gen mong muốn vào thực vật, nấm, động vật nhằm nâng cao suất, kháng sâu bệnh nâng cao chất lƣợng sản phẩm Chuyển gen vào nấm sợi đƣợc thực từ năm cuối thập kỉ 80 đầu thập kỉ 90 [22, 26, 66] Có nhiều phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi Các phƣơng pháp đƣợc chia thành hai loại: chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp bao gồm chuyển gen xung điện chuyển gen tế bào trần nhờ CaCl2/PEG, chuyển gen súng bắn gen… Ngoài kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen thực cách gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) thu đƣợc nhiều thành tựu quan trọng 1.4.1 Chuyển gen xung điện (electroporation) Chuyển gen xung điện phƣơng pháp học đƣa trực tiếp phân tử DNA vào tế bào vật chủ qua màng tế bào Cơ chế phƣơng pháp tạo xung điện cao khoảng thời gian ngắn (vài phần nghìn giây) để làm rối loạn cấu trúc lớp màng phospholipid kép, tạo lỗ thủng tạm thời cho phép phân tử DNA ngoại lai xâm nhập vào bên tế bào Cơ sở phƣơng pháp tính thẩm thấu thuận nghịch màng tế bào Khi có xung điện, thụ thể màng tế bào tạm thời khả phục hồi, dẫn đến hình thành lỗ thuận nghịch tức thời màng tế bào với kích thƣớc đủ lớn cho phép phân tử DNA, protein, phức hợp DNA-protein qua [39, 90] Chuyển gen xung điện gồm ba pha Pha thứ tạo lỗ màng, diễn vòng vài micro giây Pha thứ hai mở rộng kích thƣớc lỗ màng xảy vài trăm micro giây đến vài mili giây Pha cuối đóng lại lỗ màng, diễn vòng vài phút 14 z sau kết thúc xung điện [47] Năm 1989, phƣơng pháp xung điện lần đƣợc áp dụng vào nấm Bào tử nấm nảy chồi sau đƣợc xử lý với enzyme tạo tế bào trần đƣợc trộn chung với DNA, đƣa vào máy xung điện để chuyển DNA vào tế bào nấm Phƣơng pháp áp dụng thành công với số lồi nấm sợi địi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho trình chuyển gen [19] 1.4.2 Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) Phƣơng pháp chuyển gen thông qua tế bào trần phƣơng pháp đƣa trực tiếp đoạn DNA vector vào tế bào nấm thực vật đƣợc xử lý enzyme loại bỏ thành tế bào Quy trình phƣơng pháp gồm bốn bƣớc bản: tạo protoplast, hấp thụ DNA, phục hồi tế bào trần chọn lọc thể chuyển gen Có thể sử dụng bào tử sợi nấm non để tạo tế bào trần Tế bào trần đƣợc giữ mơi trƣờng huyền phù với có mặt chất ổn định thẩm thấu DNA đƣợc chuyển vào tế bào trần dƣới có mặt Ca2+, sau bổ sung thêm polyethylene glycol (PEG) nồng độ cao, ủ nhiệt độ phịng 15-30 phút PEG có tác dụng tập hợp tế bào đƣợc xử lý lại tạo điều kiện giữ DNA Tế bào trần đƣợc phục hồi trì đƣợc ổn định tính thẩm thấu mơi trƣờng thành tế bào phục hồi Các chất giúp trì ổn định thẩm thấu gồm sorbitol, NaCl, sucrose, … Các thể chuyển gen đƣợc chọn lọc nhờ marker kháng kháng sinh marker trợ dƣỡng [26, 90] Phƣơng pháp chuyển gen đƣợc đánh giá hiệu quả, đặc biệt loài nấm mà phƣơng pháp chuyển gen khác thực đƣợc Tuy nhiên, trình tạo protoplast bƣớc chuyển gen phức tạp, tốn cơng sức, chi phí cao khơng ổn định, địi hỏi ngƣời thực phải có nhiều kinh nghiệm nên khó áp dụng rộng rãi phịng thí nghiệm vừa nhỏ nhƣ Việt Nam [59] 1.4.3 Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.4.3.1.Vi khuẩn A tumefaciens Trong tự nhiên, vùng cổ rễ loài thực vật hai mầm thƣờng xuất khối u gồm tế bào khơng phân hóa phát triển khơng có tổ chức 15 z Những tế bào phân chia cách liên tục khơng thể kiểm sốt nhƣ tế bào ung thƣ ác tính động vật Hiện nay, loại khối u đƣợc biết đến mụn loài vi khuẩn A tumefaciens gây nên A tumefaciens vi khuẩn Gram âm, có khả chèn gen vào tế bào vật chủ sau sử dụng máy vật chủ để biểu gen dƣới dạng hợp chất dinh dƣỡng cho chúng Vi khuẩn A tumefaciens tạo khối u thực vật gần điểm tiếp nối rễ thân, tạo nên mụn sần [70, 80] Cơ chế hình thành khối u cảm ứng đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm mang lại nhiều thành tựu quan trọng ứng dụng vi khuẩn A tumefaciens vào chuyển gen thực vật nấm [31, 37] Đến chất phân tử trình cảm ứng phát sinh khối u vi khuẩn A tumefaciens gây đƣợc làm sáng tỏ Các tế bào bị thƣơng tiết hợp chất polyphenolic thu hút tế bào vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên, vi khuẩn A tumefaciens không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chuyển đoạn DNA nhỏ (T-DNA: tranferred DNA) vào bên tế bào Đoạn DNA nằm plasmid đặc biệt gọi Ti plasmid (tumor inducing plasmid) [70] TDNA sau chèn vào hệ gen tế bào vật chủ gây khối u thực vật Sự phát triển khối u sau khơng cịn phụ thuộc vào có mặt vi khuẩn Agrobacterium [37, 81] 1.4.3.2 Ti plasmid Trong năm 1970, nhà khoa học tìm thấy chủng vi khuẩn A tumefaciens tạo khối u có plasmid lớn kích thƣớc từ 200 - 800 kb [22, 81] Từ thí nghiệm chủng A tumefaciens khơng có plasmid này, ngƣời ta kết luận plasmid nói cần thiết cho tạo khối u Vì vậy, chúng đƣợc gọi Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) Cấu trúc Ti plasmid đƣợc thể Hình 1.4 16 z Hình 1.4 Cấu trúc Ti plasmid [81] Trên Ti plasmid chứa yếu tố cần thiết cho trình chuyển gen: vùng gen vir - virulence genes (vùng độc lực) T-DNA Vùng gen vir chứa khoảng 25 gen mã hóa cho protein (virA, virG, virE số protein khác) có vai trị cắt, chuyển chèn vùng T-DNA vào hệ gen tế bào chủ Sự hoạt động vùng gen vir đƣợc cảm ứng hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật có tên acetosyringone (AS) [70] Một vài Ti plasmid có T-DNA, số khác lại có nhiều vùng T-DNA T-DNA đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 10 - 30 kb, chiếm tỷ lệ nhỏ 10% kích thƣớc Ti plasmid, đƣợc chuyển vào hệ gen tế bào chủ T - DNA đƣợc giới hạn vùng: biên trái (LB) biên phải (RB) chứa trình tự lặp lại 25 bp có độ tƣơng đồng cao vị trí nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA mang gen liên quan đến việc tạo khối u [69] Những gen sau đƣợc gắn vào hệ gen tế bào chủ tham gia vào trình tổng hợp auxin cytokinin Đây hợp chất gây nên phân chia tế bào liên tục dẫn đến hình thành khối u Nhờ đặc điểm này, ngƣời ta loại bỏ gen tạo khối u nằm hai đầu biên T-DNA thay vào gen mong muốn Khi gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào chủ mô thực vật chuyển gen phát triển bình thƣờng Nếu khơng có trình tự tƣơng đồng 17 z hệ gen tế bào chủ T-DNA đƣợc chuyển, T-DNA đƣợc chèn cách ngẫu nhiên vào hệ gen tế bào chủ Nếu đoạn gen có độ tƣơng đồng cao với hệ gen tế bào chủ, tái tổ hợp tƣơng đồng xảy Tần suất tái tổ hợp tƣơng đồng khác chuyển đoạn gen có kích thƣớc khác [31] Ngồi gen tạo khối u, T-DNA cịn chứa nhóm gen opine Những gen mã hóa cho enzyme giúp cho tế bào thực vật tổng hợp số axit amin đặc biệt mà vi khuẩn A tumefaciens có khả phân giải, đƣợc gọi opine Đây nhóm hợp chất hóa học đƣợc sử dụng nhƣ nguồn cấp nitơ cho A tumefaciens [107] 1.4.3.3.Cơ chế lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens Vi khuẩn A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua vết thƣơng Thực vật bị thƣơng tiết hợp chất có đƣờng axit vơ thu hút vi khuẩn xâm nhiễm theo chế hóa hƣớng động Khi tiếp cận đƣợc vết thƣơng, chúng công vào bề mặt tổng hợp nên sợi cellulose, đồng thời thực vất tiết hợp chất phenolic (acetosyringone) hoạt hóa vùng gen vir vi khuẩn Hệ thống điều hịa gen vir hoạt động thơng qua gen độc virA, virG VirA tổng hợp nên protein VirA nằm màng tế bào, đáp ứng với trao đổi chất vết thƣơng nhạy cảm với thay đổi môi trƣờng Với nồng độ AS thích hợp, có mặt đƣờng kích thích gen virA dẫn đến tự phosphoryl hóa VirA Sự tự phosphoryl hóa dẫn đến hệ protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hóa axit aspartic cịn lại từ phosphoryl hóa VirA kích hoạt tất mã gen vir Sau đƣợc kích hoạt, gen vir điều khiển tạo thành sợi đơn T-DNA vi khuẩn Quá trình đƣợc thực protein VirD1 VirD2 Sau đó, VirD2 gắn vào T-DNA tạo thành phức hợp sợi đơn T-DNA Phức hợp T-DNA-VirD2 VirE đƣợc chuyển vào tế bào thực vật nhờ hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hóa gen virB Operon virB gồm 11 gen mã hóa cho việc hình thành cầu nối pili, đƣờng vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Các protein vi khuẩn đƣa T-DNA vào nhân tế bào nhờ 18 z hỗ trợ số thành phần tế bào thực vật Ở nhân, T-DNA chèn cách ngẫu nhiên vào hệ gen vật chủ [70, 80, 22] 1.4.3.4 Phương pháp chuyển gen thơng qua vi khuẩn A tumefaciens Khi có mặt chất cảm ứng, vi khuẩn A tumefaciens chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Lợi dụng chế này, A tumefaciens đƣợc dùng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ năm 1980 Năm 1998, vi khuẩn lần đƣợc ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi Phƣơng pháp đƣợc đánh giá phƣơng pháp đơn giản để chuyển gen vào nấm sợi đƣợc thực thành công nhiều loại nấm sợi khác [22, 69, 70, 96] Chuyển gen thông qua A tumefaciens cần hệ thống vector nhị thể Hệ vector nhị thể đặc trƣng hai plasmid tái độc lập gồm vector nhị thể (binary vector) chứa T-DNA mang gen cần chuyển Ti plasmid cải biến mang vùng gen vir hỗ trợ cho việc chuyển T – DNA (còn gọi helper plasmid) Vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm thành phần: điểm khởi đầu chép hoạt động E coli A tumefaciens, MCS (multiple cloning site - vị trí cắt nối đa điểm), marker chọn lọc hoạt động đƣợc vi khuẩn vật chủ, biên trái biên phải TDNA Ti plasmid hỗ trợ (helper plasmid) đƣợc cải biến từ Ti plasmid bình thƣờng cách loại bỏ gen tạo khối u giữ lại vùng gen vir để trì chuyển DNA vào tế bào chủ [40] Hệ thống vector nhị thể đƣợc Michielse cộng mơ tả Hình 1.5 19 z Hình 1.5 Mơ hình vi khuẩn A tumefaciens với hệ thống vector nhị thể [69] Một hệ thống vector khác đƣợc sử dụng phƣơng pháp ATMT vector đồng tích hợp (co - integrated vector) Vector đồng tích hợp hoạt động dựa chế tái tổ hợp tƣơng đồng plasmid nhỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn Ti plasmid Ti plasmid đƣợc loại bỏ vùng gen tạo khối u giữ nguyên vùng gen vir hỗ trợ trình chuyển gen vào tế bào chủ Plasmid nhỏ vi khuẩn đƣợc thiết kế gắn gen cần chuyển vào vùng biên trái (LB) biên phải (RB) Khi hai vector có mặt vi khuẩn A tumefaciens, trình tái tổ hợp diễn khiến cho gen cần chuyển đƣợc tích hợp vào vùng T-DNA plasmid [72] Ngày nay, hệ thống vector đồng tích hợp trở nên phổ biến so với hệ thống vector nhị thể khó khăn q trình thiết kế [57] Hơn nữa, sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi vector đồng tích hợp khơng cần q trình tái tổ hợp in vivo Tốc độ chuyển gen sử dụng vector nhị thể nhanh hơn, - ngày chuyển gen sử dụng vector đồng tích hợp phải ngày Hơn nữa, hiệu chuyển gen sử dụng hệ thống vector nhị thể đƣợc chứng minh hiệu nhiều so với sử dụng vector đồng tích hợp [72] 1.4.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens 20 z Chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) phƣơng pháp đơn giản đƣợc sử dụng phổ biến nhờ ƣu điểm vƣợt trội Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen nhờ A tumefaciens nguyên liệu dùng chuyển gen Nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen thành công vào nấm đa dạng, bào tử, tế bào trần, hệ sợi, … [37, 69] So với hai phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần chuyển gen xung điện yêu cầu nguyên liệu đầu vào bắt buộc tế bào trần ƣu điểm bật trình tạo tế bào trần phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao chi phí đắt đỏ Thời gian bảo quản bào tử nấm ảnh hƣởng tới hiệu chuyển gen Nguyên liệu đƣợc bảo quản thời gian dài làm giảm hiệu chuyển gen trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn, giảm tỷ lệ nảy mầm bào tử chuyển gen so với bào tử [69] Sự thành công phƣơng pháp ATMT đƣợc định chủng vi khuẩn A tumefaciens Các chủng vi khuẩn A tumefaciens đƣợc sử dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi đa dạng nhƣ AGL1, LBA4404, EHA105, LBA1100, Hiệu suất chuyển gen dùng chủng vi khuẩn A tumefaciens khác với vật chủ khác nên Chủng LBA1100 plasmid pTiB6 đƣợc kết luận cho hiệu chuyển gen cao vào A awamori A niger Những chủng vi khuẩn A tumefaciens khác đƣợc sử dụng A awamori nhƣ A348, LBA1119, LBA1126 … nhƣng phải sử dụng Ti plasmid hỗ trợ khác cho hiệu Phƣơng pháp ATMT sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 nấm A oryzae đƣợc chứng minh hiệu Với chủng vi khuẩn A tumefaciens cần phải điểu chỉnh yếu tố việc đồng nuôi cấy để thu đƣợc kết tốt [69, 77, 78] Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS) yếu tố quan trọng định hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong hầu hết 21 z nghiên cứu trƣớc đây, AS đƣợc bổ sung môi trƣờng cảm ứng giai đoạn đồng nuôi cấy nhằm cảm ứng hoạt động gen vir [31, 69, 80] Ở số trƣờng hợp, AS đƣợc bổ sung giai đoạn nuôi lắc cảm ứng với A tumefaciens nhƣng không bắt buộc, chí cịn làm giảm hiệu suất biến nạp với vật chủ nhƣ Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [69, 70] Một yếu tố định tới hiệu chuyển gen phƣơng pháp ATMT tỷ lệ đồng nuôi cấy nguyên liệu nấm vi khuẩn A tumefaciens Tăng tế bào vi khuẩn A tumefaciens nấm làm tăng hiệu chuyển gen Tuy nhiên, hai yếu tố có giới hạn định Nếu tăng lƣợng tế bào vi khuẩn A tumefaciens vƣợt nồng độ thích hợp dẫn đến tƣợng cạnh tranh dinh dƣỡng, gây khó khăn việc tiêu diệt vi khuẩn chuyển sang môi trƣờng chọn lọc thể nấm chuyển gen Ngƣợc lại, nhiều bào tử nấm dẫn đến tình trạng mọc việc phân lập thể chuyển gen khó khăn [69, 70] Điều kiện đồng ni cấy vi khuẩn nguyên liệu nấm yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu phƣơng pháp ATMT Điều kiện đồng nuôi cấy nấm vi khuẩn gồm thời gian, nhiệt độ loại màng lọc Nhiệt độ đồng nuôi cấy dao động từ 20°C - 28°C, nhƣng nhiệt độ tối ƣu thƣờng từ 22°C - 25°C, thời gian từ - ngày [22, 80] Ở nấm A awamori, nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen 20oC - 28 oC thời gian đồng nuôi cấy kéo dài từ 16 - 96 Tuy nhiên, điều kiện tối ƣu 22.5oC - 25oC thời gian - ngày [69] Ngoài ra, loại màng lọc khác nhƣ cellulose, nitrocellulose, nylon cho hiệu suất chuyển gen khác [69] Ngồi yếu tố trên, cịn có số yếu tố khác ảnh hƣởng tới hiệu việc chuyển gen nhƣ loài nấm, nồng độ kháng sinh, quy trình chuyển gen Vì vậy, muốn hiệu chuyển gen cao cần tối ƣu điều kiện để tìm quy trình phù hợp với loài 1.4.3.6 Ưu điểm nhược điểm phương pháp ATMT 22 z Chuyển gen vào nấm sợi phƣơng pháp ATMT đƣợc đánh giá tốt so với phƣơng pháp chuyển gen truyền thống nhƣ chuyển gen xung điện, chuyển gen tế bào trần Thứ nhất, nguyên liệu đƣợc dùng để đồng nuôi cấy với A tumefaciens vơ đa dạng Chúng bào tử, tế bào trần, sợi nấm, bào tử nảy mầm, chí từ cặn tế bào [69, 70] Trong đó, phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần đòi hỏi nguyên liệu nấm phải tế bào trần hình thành từ khuẩn ty sau xử lý với phức hệ enzyme Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm tế bào trần cao nhƣng thực tế tiến hành gặp nhiều cản trở Nguồn nguyên liệu tế bào trần đƣợc tạo sau sử dụng hỗn hợp enzyme loại bỏ thành tế bào nấm phải đƣợc sử dụng ngay, nên thí nghiệm cần hồn thiện ngày Việc sử dụng loại enzyme đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm khó khăn với hầu hết phịng thí nghiệm Việt Nam Chất lƣợng tế bào trần phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tuổi hệ sợi nấm, loại enzyme dùng để loại bỏ thành tế bào, thời gian ủ sợi nấm enzyme, … Quy trình chuyển gen qua protoplast với nhiều bƣớc phức tạp đòi hỏi ngƣời thực phải có kỹ cao Chính vậy, hiệu suất chuyển gen thƣờng không ổn định lần thực khác [59, 65] Thứ hai, hiệu suất chuyển gen phƣơng pháp ATMT thƣờng cao ổn định so với phƣơng pháp truyền thống Theo thống kê, hiệu chuyển gen ATMT thƣờng đạt đƣợc 300 - 900 thể chuyển gen với 107 bào tử, cao 600 lần so với phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần nhờ polyethylene glycol (PEG) [90] Chuyển gen vào A awamori nhờ A tumefaciens có hiệu suất cao phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp PEG khoảng 400 lần [69] Với vật chủ Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp - 10 lần so với chuyển gen nhờ tế bào trần Với số vật chủ khác, chẳng hạn nhƣ Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tƣơng tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đƣợc tối ƣu [12, 21, 70] Ƣu điểm thứ ba kích thƣớc đoạn DNA đƣợc chuyển vào tế bào chủ Với phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần, kích thƣớc đoạn DNA ngoại lai 23 z đƣợc đƣa vào khoảng 40 kb Chuyển gen phƣơng pháp ATMT cho phép đƣa đoạn DNA ngoại lai có kích thƣớc lên đến 150 kb vào hệ gen tế bào nấm [13] Một ƣu điểm khác phƣơng pháp tạo sƣu tập thể đột biến ngẫu nhiên đoạn T-DNA có khả chèn vào vị trí khác hệ gen tế bào chủ Vi khuẩn A tumefaciens có xu hƣớng chèn T-DNA vào hệ gen nấm dẫn đến phá hủy gen thể chuyển gen tƣơng ứng Đặc tính đƣợc ứng dụng để xác định chức số gen sinh tổng hợp chất liên quan đến trình phát triển gây bệnh số loài nấm khác Việc xóa gen nhờ chế trao đổi DNA tƣơng đồng nấm sử dụng phƣơng pháp chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens đạt đƣợc hiệu suất cao Khi sử dụng PEG thông qua protoplast, hiệu xóa gen vào khoảng 1% 50%, nhiên đạt đến 97% sử dụng vi khuẩn A tumefaciens [21] Bên cạnh ƣu điểm, phƣơng pháp có số nhƣợc điểm định Thời gian thí nghiệm dài so với phƣơng pháp khác cần thời gian cho bƣớc đồng nuôi cấy nấm vi khuẩn Ngoài ra, phƣơng pháp không ƣu để tạo nên chủng sinh vật mang số lƣợng lớn TDNA để tăng trình biểu gen, vi khuẩn Agrobacterium có xu hƣớng tích hợp vào hệ gen nấm [69] Tuy nhiên, với ƣu điểm bật trên, khẳng định chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens phƣơng pháp đơn giản, ổn định cho hiệu cao Thậm chí, với số lồi nấm, việc chuyển gen khả thi sử dụng phƣơng pháp 1.4.3.7 Ứng dụng phương pháp ATMT cải biến di truyền nấm sợi Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đƣợc chứng minh hiệu phƣơng pháp chuyển gen thông thƣờng khác, chí số lồi chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens khả thi Phƣơng pháp ATMT giúp tạo sƣu tập lớn thể đột biến ngẫu nhiên DNA chèn vào hệ gen tế bào vật chủ [68, 74] Phƣơng pháp cịn có khả tăng 24 z cƣờng q trình trao đổi chéo DNA tƣơng đồng nên đƣợc coi cơng cụ hữu ích để xóa điều tra vai trò gen mong muốn Để xác nhận chức gen phƣơng pháp hiệu tạo đột biến xóa gen Xóa gen đƣợc thực dựa chế trao đổi chéo tƣơng đồng Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình xóa gen bao gồm: trình tự tƣơng đồng, chiều dài trình tự tƣơng đồng, phƣơng pháp chuyển gen vị trí gen đích hệ gen Cấu trúc vector xóa đƣợc thiết kế với hai trình tự tƣơng đồng với hai trình tự vùng 5’ 3’ gen đích Giữa hai trình tự khung đọc mở gen đích đƣợc cắt đoạn, bị loại bỏ hoàn toàn Ở nấm men Saccharomyces cerevisiae xóa gen đạt hiệu cao với hai đoạn trình tự tƣơng đồng nhỏ (50 bp) Tuy nhiên, nấm sợi số loài nấm men khác địi hỏi hai trình tự tƣơng đồng với kích thƣớc lớn kb để thực trao đổi chéo tƣơng đồng Xóa gen phƣơng pháp ATMT đạt hiệu từ 14% – 75% cao hẳn so với phƣơng pháp chuyển gen khác [70, 73, 103] Chuyển gen vào nấm sợi theo phƣơng pháp ATMT đƣợc nghiên cứu rộng rãi nƣớc giới với nhiều thành tựu lo lớn Tuy nhiên Việt Nam, chủ đề với số nghiên cứu chuyển gen vào A oryzae đƣợc công bố gần Với ƣu điểm vƣợt trội nêu trên, phƣơng pháp nên đƣợc triển khai mạnh mẽ tạo nên bƣớc tiến cho ngành công nghiệp tiềm Việt Nam 1.5 Hệ thống marker dùng cho chuyển gen nấm sợi 1.5.1 Hệ thống marker chọn lọc thể chuyển gen Để xác nhận thể chuyển gen, ngƣời ta cần đến trợ giúp marker chọn lọc Marker chọn lọc giữ vai trò định thành cơng q trình chuyển gen Hai loại marker đƣợc sử dụng chủ yếu gen kháng thuốc (gen kháng kháng sinh) gen liên quan đến sinh tổng hợp hay nhiều hợp chất thiết yếu trình sinh trƣởng nấm  Gen kháng kháng sinh 25 z Có nhiều loại kháng sinh đƣợc sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen nấm nhƣng thông dụng ba loại hygromycin B, phleomycin nourseothricin Hygromycin B loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, đƣợc sinh xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus Kháng sinh tiêu diệt đƣợc vi khuẩn, nấm sinh vật nhân chuẩn dựa chế ức chế tổng hợp protein [83] Phleomycin đƣợc sinh xạ khuẩn Streptomyces verticillus, thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide Kháng sinh hoạt động theo bám vào DNA phá vỡ cấu trúc sợi kép DNA dẫn đến tế bào dừng hoạt động chết Phleomycin có hiệu hầu hết loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, tế bào thực vật tế bào động vật [64] Kháng sinh nourseothricin có tên thƣơng mại clonNAT, kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces noursei Kháng sinh gây lỗi mã hóa trình dịch mã khiến cho protein khơng đƣợc tổng hợp [51] Gen kháng hygromycin B (hph) đƣợc tìm thấy vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus vi khuẩn Escherichia coli (E coli) mã hóa cho HmB phosphotransferases bất hoạt hygromycin B theo chế phosphoryl hóa Gen kháng phleomycin (ble) đƣợc tìm thấy Streptoalloteichus hindustanus E coli mã hóa cho protein liên kết với kháng sinh làm bất hoạt Gen kháng nourseothricin (nat1) mã hóa cho nourseothricin acetyltransferase bất hoạt nourseothricin theo chế acetyl hóa Cả ba gen hph, ble, nat1 đƣợc sử dụng rộng rãi làm marker chọn lọc thể chuyển gen vi khuẩn, nấm men, nấm sợi tế bào độngthực vật [51, 54, 86] Phần lớn nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi sử dụng loại gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc Tuy nhiên, loại kháng sinh thƣờng có giá thành đắt khiến chi phí cho thí nghiệm tăng cao, gây hạn chế cho việc nghiên cứu chuyển gen Bên cạnh đó, nhiều loại nấm sợi có khả kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh bị ức chế nồng độ cao, tiêu biểu A oryzae khiến cho việc dùng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc 26 z không khả thi [97] Vấn đề đƣợc khắc phục cách cải biến di truyền số loài nấm sợi để dùng gen trợ dƣỡng làm marker chọn lọc  Marker trợ dưỡng Chủng đột biến trợ dƣỡng chủng khơng có khả tự tổng hợp loại axit amin hợp chất cần thiết cho sinh trƣởng Vì chủng sinh trƣởng môi trƣờng tối thiểu yêu cầu bổ sung thêm axit amin hợp chất tƣơng ứng Các chủng đột biến trợ dƣỡng đƣợc dùng để chuyển gen sử dụng marker chọn lọc gen trợ dƣỡng tƣơng ứng Gen trợ dƣỡng đƣợc sử dụng phổ biến nấm sợi pyrG Gen pyrG mã hóa sinh tổng hợp orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase), enzyme quan trọng trình sinh tổng hợp uridine uracil cần cho sinh trƣởng nấm Khi gen pyrG bị xóa bị đột biến gây hỏng, thể đột biến khơng cịn khả tổng hợp uridine (tiền chất uracil) Do chủng không sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng tối thiểu thiếu uridine/uracil Khi gen pyrG đƣợc chuyển trở lại chủng đột biến chủng lại sinh trƣởng bình thƣờng mơi trƣờng tối thiểu Chính vậy, nhiều nghiên cứu sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc cho trình chuyển gen nấm [66, 89] Ở chủng tự nhiên (wild type), enzyme OMP decarboxylase chuyển hóa hợp chất 5-fluorooritic acid (5-FOA) không độc thành chất gây độc tế bào 5-flourouracil Ngƣợc lại, chủng đột biến sai hỏng gen pyrG khơng thể chuyển hóa 5-FOA nên chúng sinh trƣởng bình thƣờng mơi trƣờng có bổ sung 5-FOA Vì 5-FOA thƣờng đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng q trình sàng lọc chủng vi nấm chuyển gen liên quan đến gen pyrG [106] Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tạo chủng nấm sợi trợ dƣỡng uridine/uracil Phƣơng pháp phổ biến để tạo đột biến trợ dƣỡng chiếu tia UV, sau sàng lọc mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung 5-FOA, uridine uracil [38, 46] Các thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil cịn đƣợc tạo phƣơng pháp xóa gen pyrG theo chế trao đổi chéo tƣơng đồng Các vector xóa 27 z gen pyrG đƣợc thiết kế chuyển vào chủng nấm tự nhiên (wild type) Nhờ chế trao đổi chéo tƣơng đồng, gen pyrG nguyên gốc hệ gen nấm đƣợc thay cấu trúc DNA tƣơng đồng chuyển vào khả hoạt động, từ hình thành chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil [106] Ngồi gen pyrG cịn có gen trợ dƣỡng khác đƣợc sử dụng làm marker chọn lọc nhƣ gen adeA, met, trp, argB … Chuyển gen vào chủng trợ dƣỡng giúp giảm chi phí, an tồn mơi trƣờng có tiềm ứng dụng vào sản xuất thực tiễn [106] 1.5.2 Hệ thống marker thị dùng chuyển gen Môi trƣờng chọn lọc dùng cho chuyển gen thƣờng gây chết kìm hãm phát triển chủng tự nhiên Trong đó, thể chuyển gen phát triển bình thƣờng chứa marker chọn lọc giúp bảo vệ chúng khỏi yếu tố chọn lọc chuyển gen Trái ngƣợc với marker chọn lọc, marker thị làm thể chuyển gen có kiểu hình khác, dễ dàng phân biệt với chủng tự nhiên Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng nhƣ dấu hiệu để sàng lọc thể chuyển gen Gen thị thƣờng không gây ảnh hƣởng đến chức sinh lý khả sinh trƣởng thể chuyển gen Các gen thị đƣợc biểu gen đích biểu độc lập mà khơng cần gen đích kèm [7] Gen thị gồm gen mã hóa cho protein huỳnh quang gen mã hóa cho enzyme chuyển hóa chất khơng nhìn thấy thành chất có màu phát sáng Các gen thị đƣợc dùng phổ biến chuyển gen GFP, DsRed, GUS (mã hóa enzyme β-glucuronidase), LUC (mã hóa cho luciferase), LacZ (mã hóa -galactosidase), … Trong DsRed GFP hai gen thị đƣợc sử dụng nhiều chuyển gen nấm sợi [52, 60, 75]  Gen mã hóa protein huỳnh quang xanh GFP Gen GFP lần đƣợc Osamu Shimomura phân lập từ lồi sứa Aequoreavictoria Gen GFP có kích thƣớc 720 bp, mã hóa cho protein kích thƣớc 238 axit amin, trọng lƣợng 26,9 kDa Protein hấp thụ mạnh ánh sáng có bƣớc 28 z sóng 395 – 475 nm phát tín hiệu huỳnh quang xanh đƣợc chiếu sáng dƣới bƣớc sóng 509nm (Hình 1.6) [85] Hình 1.6 Biểu gen huỳnh quang GFP nấm sợi A oryzae [78] DIC: ánh sáng thƣờng Fluorescence: ánh sáng huỳnh quang Protein GFP cho tín hiệu huỳnh quang tốt dƣới điều kiện chiếu tia UV ánh sáng huỳnh quang xanh mà khơng cần địi hỏi cofactor chất hoạt động nhƣ số gen thị khác nhƣ β-glucuronidase, β-galacturonidase Hơn nữa, tích hợp gen GFP hệ gen tế bào chủ đủ bền vững đến hệ sau nên gen thị GFP thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến nghiên cứu chuyển gen biểu gen [60] Đến nay, GFP đƣợc biểu thành công nhiều loài sinh vật nhân sơ nhân chuẩn Trong nghiên cứu chuyển gen nấm sợi, gen GFP đƣợc biểu số loài nhƣ A oryzae, A niger, A fumigatus, A nidulans, … [17, 33, 48, 78, 85] Gần đây, số dạng đột biến gen GFP đƣợc sử dụng nhƣ thị sinh học phân tử Chúng bao gồm dạng đột biến BFP, CFP YFP mã hóa cho protein huỳnh quang phát ánh sáng xanh dƣơng (blue), xanh lục (cyan) vàng (yellow) Tuy nhiên, GFP gen thị đƣợc sử dụng phổ biến nghiên cứu chuyển gen biểu gen nấm sợi [60]  Gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed 29 z Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed có chiều dài 687 bp đƣợc phân lập từ loài san hơ thuộc chi Discosoma mã hóa cho protein DsRed gồm 226 axit amin với kích thƣớc 28 kDa Protein DsRed phát tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh dƣới ánh sáng bƣớc sóng 583 nm [11] Với tính chất tƣơng tự nhƣ GFP, gen huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc sử dụng làm thị phân tử nhiều loài sinh vật khác Ở nấm sợi, gen DsRed đƣợc biểu thành cơng lồi nhƣ A oryzae, Fusarium oxysporum, Acremonium chrysogenum, A fumigatus…[25, 44, 56, 76-78] Hình 1.7 Biểu gen DsRed chủng nấm sợi A oryzae AUT1-PID [78] DIC: sáng thƣờng Fluorescence: ánh sáng huỳnh quang 1.6 Promoter biểu gen nấm sợi Promoter thành phần quan trọng cấu trúc tất gen đóng vai trò then chốt điều hòa biểu gen Promoter vùng trình tự nucleotide nằm phía đầu 5’ gen gồm chứa vị trí nhận biết cho RNA polymerase yếu tố phiên mã tham gia vào q trình biểu gen Kích thƣớc promoter dao động từ 100 – 1000 bp [94] Theo khả điều hòa biểu gen, promoter đƣợc chia làm hai loại chính: promoter khơng đặc hiệu (promoter định) promoter đặc hiệu (gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển promoter cảm ứng) [2] Promoter định loại promoter tham gia điều khiển hoạt động gen hầu nhƣ tất loại mô, tất giai đoạn phát triển khác sinh vật Promoter đặc hiệu quy định biểu 30 z đặc hiệu gen một vài loại mô một vài giai đoạn Một promoter đặc hiệu hoạt động số mơ, cịn số mơ khác khơng có hoạt động nhƣng mức độ yếu Promoter cảm ứng loại promoter hoạt động mạnh môi trƣờng xuất điều kiện cảm ứng định nhƣ hạn, nhiệt độ q cao hay q thấp, ơxi hóa cao, chất cảm ứng … [4] Ở nấm sợi, promoter định đƣợc sử dụng rộng rãi glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase (gpdA) từ A nidulans Vì mức độ tƣơng đồng cao khả tăng cƣờng mức độ biểu nên promoter gpdA đƣợc nhân dòng sử dụng nhiều loài nấm sợi Năm 2002, Wasylnka Moore biểu thành công gen gfp đƣợc điều khiển promoter gpdA vào nấm sợi A fumigatus [101] Năm 2016, Nguyễn Thị Khuyến cộng chứng minh promoter gpdA A nidulans điều khiển gen DsRed hoạt động mạnh A oryzae Toàn hệ sợi cuống sinh bảo tử thể chuyển gen A oryzae cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang Thậm chí, số thể chuyển gen cho kiểu hình màu hồng nhạt đến đậm đĩa chuyển gen [78] Bên cạnh gpdA, promoter trpC từ A nidulans ToxA, ToxB (gen mã hóa cho protein độc) nấm gây bệnh thực vật Pyrenophora tritici – repentis thƣờng đƣợc sử dụng nghiên cứu chuyển gen biểu gen nấm sợi Ngoài loại promoter định, promoter cảm ứng đƣợc ứng dụng rộng rãi việc biểu gen nấm sợi Ƣu điểm việc biểu enzyme protein tái tổ hợp dƣới kiểm sốt promoter cảm ứng chi phí thấp mức độ biểu cao nhiều lần Các promoter cảm ứng thƣờng đƣợc sử dụng gồm glaA A niger A awamori, TAKA-A amylase (amyB) mã hóa cho amylase, thiA (gen liên quan đến tổng hợp thiamine) A oryzae…[73] Trong số promoter trên, glaA nấm sợi A niger promoter đƣợc sử dụng nhiều GlaA gen mã hóa cho glucoamylase - enzyme tiết nhiều A niger với khối lƣợng 20 g/l [27] Vì hiệu hoạt động cao nên đoạn trình tự tƣơng đồng glaA (promoter glaA) đƣợc sử dụng phổ biến sản xuất protein tái tổ hợp khác nguồn A niger số loài Aspergillus khác [61] Các nghiên cứu 31 z trƣớc chứng minh hoạt động promoter glaA bị chi phối số chất cảm ứng Khi môi trƣờng có mặt tinh bột, maltose, promoter glaA hoạt động mạnh Sự có mặt glucose làm giảm khả hoạt động promoter khả hoạt động bị ức chế hồn tồn xylose đƣợc sử dụng làm nguồn cacbon môi trƣờng [28] Promoter glaA điều khiển số gen mã hóa cho protein tái tổ hợp đƣợc biểu thành công nhƣ gen mã hóa prochymosin bị (ở nấm sợi A niger A awamori), gen mã hóa lysozyme lịng trắng trứng gà (A niger), gen mã hóa cho interleukin – ngƣời (A nidulans)… Ngoài glaA A niger, promoter glaA hai loài A oryzae A awamori đƣợc ứng dụng thành công nghiên cứu chuyển gen biểu gen nấm sợi [34] 32 z Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vector sử dụng nghiên cứu đƣợc liệt kê Bảng 2.1 Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật vector dùng nghiên cứu STT Tên chủng Phân loại Nguồn gốc RIB40∆pyrG A oryzae [77] VS1∆pyrG A oryzae [77] N402 A niger CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan) DH5α E coli [36] AGL1 A tumefaciens [55] pEX2 Vector nhị thể Phịng Genomic - Phịng thí nghiệm (binary vector) Trọng điểm Công nghệ Enzym pKO2 Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 chủng đƣợc cải biến di truyền đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen vào nấm sợi Chủng A oryzae VS1, RIB40 bị xóa gen pyrG hệ gen đƣợc sử dụng trực tiếp để chuyển gen sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG 33 z 2.1.2 Thiết bị hóa chất Các hóa chất đƣợc sử dụng ni cấy vi sinh vật thí nghiệm sinh học phân tử gồm: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl, SDS… Các hóa chất, kit tách chiết/tinh DNA, enzyme, … đƣợc mua từ hãng uy tín nhƣ Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym Các thiết bị sử dụng nghiên cứu đƣợc sử dụng Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tên thiết bị Xuất xứ Bể điện di Bio-Rad Mỹ Kính hiển vi quang học Olympus Nhật Bản Kính hiển vi huỳnh quang Carlzeiss Đức Máy chuyển gen xung điện Bio-Rad Mỹ Máy cô quay chân không Thermo Mỹ Máy đo pH Meter F-51 Thụy Sỹ Máy đo quang phổ Thermo Mỹ Máy ly tâm lạnh Eppendorf Đức Máy ly tâm Sigma Mỹ Máy PCR Bio-Rad MyCycler Mỹ Máy soi gel Bio-Rad Mỹ 34 z Tên thiết bị Xuất xứ Máy vortex Cyclone Anh Pipetman, Gilson Pháp Tủ cấy vi sinh an toàn cấp Nuaire Mỹ Các mồi dùng cho phản ứng PCR công ty IDT (Singapore) tổng hợp Danh sách mồi đƣợc liệt kê Bảng 2.2 Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu Tên mồi DsRed-F Trình tự ( 5’ – 3’) Enzyme giới Kích thƣớc hạn sản phẩm AACTCGAGCACGTGCTT XhoI, PmlI, AAGGATATCATGGCCTC AflII, EcoRV CTCCGAGG 730 bp DsRed-R AAGGATCCCCGCGGGA EcoRV, SacI, GCTCGATATCCTACAGG SacII, BamHI AACAGGTGGTGGC Ao-pyrG-ORF-F ATGTCTTCCAAGTCGCA ATT 900 bp Ao-pyrG-ORF-R TATTGCGCACCAACACG An-pyrG-P1 GAATTCACTGCTATGCG EcoRI ACCGTAGA An-pyrG-P2 2,78 kb AAATCTAGACATCGGAA XbaI GCACAATGAGGC 35 z Tên mồi An-glaA-pro-F Trình tự (5’ - 3’) GGGACTAGTTGAATGATGGA Enzyme Kích thƣớc giới hạn sản phẩm SpeI CGTGTCTGG An-glaA-pro-R GGGCTCGAGTGTAATGATGC XhoI 600 bp TGGGGATGA An-pyrG-ORF-F TCTTTCCATTCCCGCATTA An-pyrG-P3 GTCTTCTCATCCGCCATGTT An-pyrG-ORF-F TCTTTCCATTCCCGCATTA An-pyrG-ORF-R ACTACCCGTGCTCGACATT 2.1.3 Các môi trƣờng sử dụng nghiên cứu  Môi trường PDA (Potato dextrose agar): Glucose : 20 g/l Dịch chiết từ 200 g khoai tây tƣơi bỏ vỏ Agar : 20 g/l Nƣớc cất : đến lit  Môi trường LB: Peptone : 10 g/l Cao nấm men : g/l NaCl : g /l Agar : 16 g/l 36 z 2,08 kb 1,05 kb  Môi trường CD (Czapek-Dox): Sucrose : 30 g/l NaNO3 : g/l KH2PO4 : g/l KCl : 0,5 g/l MgSO4.7H2O : 0,5 g/l FeSO4.7H2O : 0,01 g/l CuSO4.5H2O : 0,005 g/l ZnSO4.7H2O : 0,001 g/l Agar : 20 g/l Chỉnh pH 5,5 NaOH KOH 5M  Môi trường cảm ứng IM rắn: 1M-MES : 40 ml MM salts 2,5x : 400 ml Glucose : 0,9 g Glycerol : ml Agar : 16 g Cho nƣớc cất tới 1000 ml  1M-MES: MES : 195,2 g/l Chỉnh pH 5,3 KOH 5M  MM salts 2,5X: KH2PO4 : 3,625 g/l 37 z K2HPO4 : 5,125 g/l NaCl : 0,375 g/l MgSO4.7H2O : 1,25 g/l CaCl2.2H2O : 0,165 g/l FeSO4.7H2O : 0,0062g/l (NH4)2SO4 : 1,25 g/l  Môi trường M+ Met dùng để chọn lọc thể chuyển gen [106]: NH4Cl : g/l (NH4)2SO4 : g/l KCl : 0,5 g/l NaCl : 0,5 g/ KH2PO4 : g/l MgSO4 : FeSO4 : 0,02 g/l Glucose : 20 g/l Methionine : 1,5 g/l 0,5 g/l Chuẩn pH 5,5 Các môi trường khử trùng 121oC 15 phút trước sử dụng 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu nhƣ PCR, tạo vector, xử lý enzyme giới hạn, lai (ligation), … đƣợc thực tham khảo theo cẩm nang Molecular Cloning tác giả Sambrook [91] Các phƣơng pháp nhƣ tách chiết DNA, tách chiết plasmid đƣợc phát triển Phòng Genomic – Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội Phƣơng pháp nhƣ tinh DNA sử dụng kit tách chiết thƣơng mại 38 z 2.2.1 Thu bào tử nấm Các chủng nấm đƣợc nuôi cấy môi trƣờng Czapek-Dox PDA Riêng với chủng nấm trợ dƣỡng, 0,1% uracil 0,1% uridine đƣợc bổ sung vào môi trƣờng hỗ trợ sinh trƣởng Sau khoảng ngày, đĩa nuôi cấy đƣợc sử dụng để thu bào tử Bổ sung nƣớc cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi dùng que gạt vô trùng tách bào tử khỏi hệ sợi nấm Dùng màng Miracloth (Calbiochem, Đức) vô trùng đặt miệng ống falcon vô trùng, dùng pipet hút dịch đĩa cho qua màng lọc để loại bỏ hệ sợi Phần dịch qua màng lọc đƣợc ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 10 phút để thu cặn Phần cặn chứa bào tử nấm đƣợc rửa lại hai lần nƣớc cất vô trùng ly tâm nhƣ để thu bào tử Dịch bào tử sau thu xong đƣợc xác định nồng độ buồng đếm Thoma Pha loãng dịch đến nồng độ 106 bào tử/ml Giữ dịch bào tử 4oC để sử dụng cho thí nghiệm Để lƣu trữ lâu dài, dịch bào tử đƣợc bổ sung thêm glycerol đến 20%, làm đông nhanh nitơ lỏng giữ -80oC Đối với chủng nấm trợ dƣỡng uridine/uracil, bào tử sau thu đƣợc cần kiểm tra để tránh nhiễm cách nhỏ 20 - 50µl dịch bào tử đĩa môi trƣờng tối thiểu Czapek-Dox (CD) ủ đĩa khoảng - ngày 30ºC Nếu hệ sợi nấm không xuất hiện, chứng tỏ bào tử khiết đáp ứng đƣợc yêu cầu dùng cho chuyển gen 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số Một mililit bào tử nấm (106 bào tử/ml) đƣợc bổ sung vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml mơi trƣờng CD lỏng Bình đƣợc ni lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 30ºC ngày Hệ sợi nấm đƣợc thu cách lọc qua màng Miracloth đƣợc thấm khô giấy lọc trƣớc chia vào ống eppendorf ml Sử dụng 200 mg sợi nấm nghiền nitơ lỏng thành bột mịn cối chày sứ giã trực tiếp ống eppendorf sử dụng đũa thủy tinh Bổ sung 600 µl đệm chiết GX (2,5% SDS; 200 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0,2% βmercaptoethanol) 0,1 mg proteinase K vào ống Vortex ống sau ủ nhiệt độ 60oC - 65ºC 30 phút Bổ sung vào ống 300 µl natri acetate 3M (pH 5,2) 39 z trộn ly tâm tốc độ 12000 vịng/phút 20 phút 4ºC Hút khoảng 700 µl dịch phía chứa DNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml, sau bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh, trộn đều, ly tâm 12000 vòng/phút 20 phút 4ºC Tủa chứa DNA đƣợc rửa 500 µl ethanol 70%, ly tâm tốc độ 12000 vịng/phút phút 4ºC đƣợc làm khơ máy quay chân khơng SpeedVac trƣớc hịa vào 50 µl đệm TE 1x (Tris-EDTA, pH 8) Bổ sung µl RNase (10 mg/ml) ủ 60ºC 30 phút để loại bỏ RNA Sản phẩm DNA tổng số đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,7% đƣợc bảo quản - 20ºC 2.2.3 Thành phần phản ứng PCR Trình tự đoạn DNA đƣợc lấy từ GenBank từ sở liệu http://www.aspergillusgenome.org/ Các cặp mồi khuếch đại trình tự DNA tƣơng ứng đƣợc thiết kế phần mềm Primer3 đƣợc tổng hợp hóa học cơng ty IDT Đối với phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen sử dụng cho cắt nối tạo vector enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase hãng Thermo Scientific đƣợc sử dụng để đảm bảo độ xác q trình chép DNA Phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl có thành phần nhƣ sau:  Buffer 10x for Phusion : 2,5µl  dNTPs : 1µl  Mồi xi : 1µl  Mồi ngƣợc : µl  Phusion polymerase : µl  DNA khn : µl  Nƣớc vô trùng : 17,5µl Đối với phản ứng PCR nhằm mục đích kiểm tra sử dụng GoTaq Green MasterMix hãng Promega với tổng thể tích phản ứng µl gồm thành phần nhƣ sau: 40 z  MasterMix : 2,5µl  Mồi xi : 0,2 µl  Mồi ngƣợc : 0,2 µl  Nuclease free water : 1,9 µl  DNA khn : 0,2 µl Các mồi sử dụng phản ứng PCR có nồng độ 10 pM 2.2.4 Xử lý enzyme giới hạn  Cắt enzyme giới hạn: Khung vector nhị thể trƣớc nối đoạn DNA cần thiết phải đƣợc xử lý với enzyme cắt giới hạn Quy trình cắt enzyme giới hạn với tổng tích 20 µl gồm thành phần nhƣ sau:  Vector : µl  FastDigest buffer : µl  Enzyme : µl  Enzyme : µl  Nuclease free water : 12 µl Các thành phần đƣợc trộn ống eppendorf 1,5 ml, ủ 37oC 40 phút sau đƣợc điện di gel agarose, cắt băng DNA tƣơng ứng tinh kit để thu đƣợc phần khung vector xử lý enzyme Các đoạn DNA nối (Insert) đƣợc xử lý với enzyme giới hạn tƣơng thích theo quy trình tƣơng tự Tổng thể tích cắt 20 µl bao gồm thành phần:  Insert : 10 µl  Fast Digest buffer : µl  Enzyme : µl  Enzyme : µl  Nuclease free water : µl 41 z  Nối đoạn insert vào khung vector: Khung vector đoạn insert sau xử lý enzyme giới hạn đƣợc tiến hành lai ghép (ligation) Thành phần phản ứng nối với tổng thể tích 20 µl bao gồm:  Vector : µl  Insert : 10 µl  T4 DNA ligase buffer 10X: µl  T4 DNA ligase : µl  Nuclease free water : µl Các thành phần phản ứng đƣợc trộn với ống eppendorf 1,5 ml, bọc giấy bạc ủ 4oC qua đêm sau biến nạp vào E coli để phục vụ cho bƣớc thí nghiệm  Xử lý với enzyme làm đầu: Đối với tạo vector xóa pyrG yêu cầu sử dụng enzyme làm đầu (DNA blunting enzyme có kit CloneJET PCR Cloning Kit), tổng thể tích cắt 20 µl bao gồm :  2x reaction buffer : 10 µl  Vector pKO2 : µl  Nuclease free water : µl  DNA blunting enzyme : µl Trộn thành phần ống eppendorf 1,5 sau voltex nhanh ly tâm - giây, ủ 70o C phút Giữ ống eppendorf đá lạnh, bổ sung thêm µl T4 ligase enzyme sau bọc giấy bạc ủ 4oC qua đêm  Cắt kiểm tra vector Bƣớc cuối trình tạo vector cắt kiểm tra enzyme giới hạn Mỗi vector đƣợc cắt kiểm tra hai, ba enzyme có trình tự nhận biết khung vector đoạn insert Quy trình cắt enzyme kiểm tra tƣơng tự 42 z với quy trình cắt enzyme tạo vector Tổng thể tích cắt enzyme kiểm tra 10 µl với thành phần:  Vector : 10 µl  FastDigest buffer : µl  Enzyme : µl  Enzyme : µl  Nuclease free water : µl Sản phẩm cắt enzyme sau ủ 37o C 40 phút đƣợc điện di để kiểm tra kết 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen  Tạo vector xóa gen pyrG A niger Gen pyrG đƣợc khuếch đại PCR với khuôn DNA hệ gen từ chủng A niger N402 với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2) có trình tự nhận biết enzyme giới hạn XbaI Phản ứng PCR sử dụng enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC/ phút; 35 chu kỳ lặp lại bƣớc 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ phút; 72ºC/ 10 phút, giữ 4ºC Cấu trúc xóa gen pyrG A niger đƣợc thiết kế dựa khung vector nhị thể pKO2 Đoạn pyrG sau tinh đƣợc cắt enzyme XbaI, tiếp đƣợc nối vào vector pKO2 đƣợc cắt enzyme EcoRV XbaI Việc ghép nối sử dụng enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo cách cắt vector mang gen pyrG nguyên gốc enzyme giới hạn EcoRV BamHI, sau tiến hành làm đầu ghép nối để vector tự đóng vịng enzyme blunting có kit ClonJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cấu trúc xóa mang đoạn gen pyrG có kích thƣớc nhỏ gen pyrG nguyên gốc 564 bp  Tạo vector biểu gen huỳnh quang đỏ pEX2A 43 z Cấu trúc vector pEX2A đƣợc thiết kế dựa khung vector nhị thể pEX2 mang gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed marker chọn lọc gen pyrG A niger.Vector pEX2 đƣợc cắt hai enzyme EcoRI SpeI, sản phẩm cắt đƣợc điện di gel 0,7% 30 phút 90V, cắt lấy đoạn gel có chứa băng DNA kích thƣớc 8,1 kb, tinh đoạn DNA khung vector kit tinh DNA từ gel agarose theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Gen pyrG đƣợc PCR từ DNA tổng số, sau đƣợc cắt enzyme EcoRI XbaI tinh Đoạn pyrG sau tinh đƣợc nối vào khung vector pEX2 enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Vector sau tạo đƣợc cắt kiểm tra enzyme XhoI, theo tính tốn lý thuyết sản phẩm cắt gồm ba băng DNA với kích thƣớc tƣơng ứng 1,28 kb; 2,35 kb 8,29 kb  Tạo vector biểu huỳnh quang đỏ pEX2C Cấu trúc vector pEX2C đƣợc thiết kế dựa khung vector nhị thể pEX2 để biểu gen DsRed dƣới điều khiển promoter glaA từ A niger marker chọn lọc gen pyrG A oryzae Sử dụng enzyme SpeI XhoI để cắt vector pEX2, sau điện di tinh để thu đƣợc đoạn DNA khung vector kích thƣớc 10 kb Promoter glaA đƣợc PCR từ hệ gen A niger sử dụng enzyme Phusion high - fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC/ phút; 35 chu kỳ lặp lại bƣớc 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ phút; 72ºC/ 10 phút, giữ 4ºC Promoter glaA sau đƣợc cắt enzyme SpeI, XhoI tinh kit tinh DNA Đoạn glaA sau tinh đƣợc nối vào khung vector pEX2 enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Vector sau tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzyme EcoRI cho kết theo tính tốn lý thuyết băng với kích thƣớc 2,22 kb 8,4 kb 2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens  Biến nạp vector vào vi khuẩn A tumefaciens Vector đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens phƣơng pháp xung điện Khuẩn lạc tƣơi chủng AGL1 đƣợc nuôi lắc mơi trƣờng LB lỏng qua 44 z đêm, 200 vịng/phút 28°C Thu tế bào vi khuẩn ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 4°C Rửa tế bào vi khuẩn ba lần 10 ml HEPES 100 mM lạnh lần glycerol 10% Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 4°C lần rửa Hòa cặn tế bào ml glycerol 10% Chia 50 µl dịch tế bào AGL1 khả biến vào ống eppendorf, làm đông nhanh nitơ lỏng bảo quản -80°C Khi biến nạp; trộn 0,5 µl plasmid vào 50 µl dịch tế bào khả biến, chuyển hỗn hợp vào cuvet mm Quá trình biến nạp đƣợc thực máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với thơng số 2,5 kV, 400Ω, 25 µF Sau kích hoạt xung điện, bổ sung 500 µl mơi trƣờng LB lỏng vào cuvet, trộn nhẹ chuyển hỗn hợp sang ống eppendorf Ni lắc 200 vịng/phút 28°C Ly tâm thu tế bào tốc độ 8000 vịng/phút 20 giây, cấy trải lên mơi trƣờng LB có bổ sung kanamycin (100 mg/l) Ủ đĩa 28°C, - ngày để thu đƣợc khuẩn lạc kháng kanamycin Các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra colony PCR (PCR sử dụng khuẩn lạc làm DNA khuôn) với mồi đặc hiệu để xác nhận vi khuẩn AGL1 nhận đƣợc vector mong muốn  Chuyển gen vào nấm vi khuẩn A tumefaciens Cấy khuẩn lạc tƣơi đƣợc xác nhận PCR từ đĩa LB có bổ sung kanamycin vào 20 ml LB lỏng, ni lắc qua đêm 28°C với tốc độ 200 vòng/phút Hút ml dịch ni cho vào bình tam giác có chứa ml mơi trƣờng cảm ứng IM có bổ sung 200 µM AS, bọc giấy bạc để tránh ánh sáng Ni lắc 28°C, 200 vịng/phút - giờ, OD dịch nuôi đạt 0,6 đến 0,8 Trộn 100 µl dịch ni cảm ứng với 100 µl bào tử nấm (nồng độ 106 bào tử/ml) trải lên màng cellulose đƣợc đặt sẵn đĩa mơi trƣờng IM có bổ sung 200 µM AS Đồng ni cấy hộp tối 2,5 ngày 22°C Sau chuyển màng cellulose sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc CD có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) tác dụng diệt vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Ủ đĩa nhiệt độ phòng - ngày để nhận đƣợc khuẩn lạc chuyển gen 45 z Đối với thí nghiệm xóa gen pyrG, 100 µl dịch ni cảm ứng đƣợc trộn với 100 µl bào tử nấm (107 bào tử/ml) trải lên màng cellulose đặt sẵn môi trƣờng IM bổ sung 200 µM AS Đồng ni cấy hộp tối 2,5 ngày 20°C Sau chuyển màng sang đĩa môi trƣờng chọn lọc Czapek-Dox (CD) bổ sung 0,1% uracil; 0,1% uridine; 0,2% 5-FOA kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) 2.2.7 Sàng lọc thể chuyển gen Sau thu đƣợc thể chuyển gen riêng rẽ đĩa môi trƣờng chọn lọc, chủng đƣợc khiết phƣơng pháp cấy ria ba pha Sau nuôi cấy tách chiết DNA, thể chuyển gen đƣợc xác nhận phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu  Xác nhận thể xóa gen pyrG Đối với thể đột biến xóa gen pyrG, khuẩn lạc nấm xuất môi trƣờng chọn lọc có 5-FOA đƣợc cấy chuyển đồng thời lên môi trƣờng CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine, CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine + 0,2% 5-FOA môi trƣờng CD không bổ sung uridine uracil để kiểm tra khả sinh trƣởng Các chủng xóa gen pyrG không sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng CD không bổ sung uridine, uracilvà sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng có 5-FOA Ngƣợc lại, chủng tự nhiên sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng không bổ sung uridine, uracil, nhƣng bị ức chế mơi trƣờng có 5-FOA Các chủng kháng 5-FOA đƣợc nuôi cấy tách chiết DNA tổng số sau đƣợc PCR xác nhận với cặp mồi đặc hiệu AnpyrG-P1/P2, An-pyrG-ORF-F/R An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 (Bảng 2.2).Các thể chuyển gen đƣợc xác nhận xóa gen thành cơng kích thƣớc sản phẩm PCR nhỏ 564 bp so với kích thƣớc đoạn pyrG nguyên gốc đƣợc PCR từ DNA tổng số chủng nấm A niger N402  Xác nhận thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A Các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A đƣợc nuôi cấy, thu hệ sợi tách chiết DNA tổng số sau PCR xác nhận với hai cặp mồi An-pyrG-P1/P2và DsRed-F/R Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, thể chuyển gen thành công chủng 46 z A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil cho sản phẩm băng DNA kích thƣớc 2,78 2,2 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen pyrG nguyên gốc gen pyrG chủng trợ dƣỡng Kết xác nhận chuyển gen hai chủng A oryzae VS1, RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil cho băng với kích thƣớc 2,78 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen pyrG A niger Với cặp mồi DsRed-F/R, cá thể chuyển gen chủng N402, VS1, RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil cho sản phẩm với kích thƣớc 730 bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed  Xác nhận thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C Đối với thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C, sau tách chiết DNA tổng số, DNA đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR xác nhận với cặp mồi An-glaA-pro-F/R DsRed-F/R Kết thu đƣợc với cặp mồi An-glaApro-F/R băng DNA với kích thƣớc 600 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc promoter glaA A niger Kết PCR với cặp mồi DsRed-F/R cho băng DNA có kích thƣớc với kích thƣớc gen DsRed-730 bp  Xác nhận thể chuyển gen huỳnh quang DsRed Tất thể chuyển gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc tiến hành làm tiêu quan sát biểu dƣới kính hiển vi huỳnh quang Đặt miếng giấy thấm vào đĩa petri, đặt hai tip 1000 µl lên miếng giấy, đặt lam kính lên hai tip để lamen giấy thấm Đĩa đƣợc khử trùng điều kiện 121°C, atm, 15 phút Sau khử trùng, thêm nƣớc cất vô trùng vào miếng giấy thấm để trì độ ẩm cho tiêu Nhỏ giọt mơi trƣờng thạch PDA/CD lên lam kính Đợi giọt thạch đơng, nhỏ 10 µl dịch bào tử nấm lên giọt thạch, đậy lamen lại Tiêu đƣợc ủ 25°C 1,5 ngày, sau tiêu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang 47 z Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen 3.1.1 Chủng nấm A niger N402 đƣợc lựa chọn xóa gen Chủng nấm A niger N402 chủng chuẩn đƣợc nhiều phòng thí nghiệm quốc tế sử dụng nghiên cứu ứng dụng Trong nghiên cứu này, lựa chọn chủng N402 đối tƣợng nghiên cứu Sau ngày ni cấy 30°C mơi trƣờng PDA hệ sợi nấm phát triển nhanh mơi trƣờng Czaperk-Dox với đƣờng kính 5,2 cm (PDA) 3,4 cm (CD) Khuẩn lạc nấm hai môi trƣờng hình thành bào tử màu đen Khi quan sát mặt sau đĩa, hệ sợi có màu vàng nhăn nheo Quan sát dƣới kính hiển vi quang học, chúng tơi thấy hệ sợi chủng N402 có nhiều vách ngăn, phân nhánh liên tục (Hình 3.1C) Chủng N402 có cuống sinh bào tử ngắn, phía đầu cuống sinh bào tử bình với nhiều bào tử đính hình cầu tích lũy sắc tố melanin tạo thành bọng hình cầu có màu đen Hình 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm A niger N402 (A, B) Hình thái đĩa môi trƣờng CD, PDA, (C) Cấu trúc hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, (D, E) Cuống sinh bào tử 48 z Kết nuôi cấy cho thấy A.niger N402 sinh trƣởng nhanh môi trƣờng PDA nên môi trƣờng đƣợc chọn làm môi trƣờng để thu bào tử nấm Môi trƣờng tối thiểu CD với thành phần đơn giản, có sẵn phịng thí nghiệm đảm bảo cho sinh trƣởng phát triển A niger nên đƣợc chọn làm môi trƣờng chọn dọc dùng thí nghiệm chuyển gen 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm A oryzae VS1 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Trong nghiên cứu này, ngồi chủng nấm A niger N402 chúng tơi cịn tiến hành thí nghiệm chủng nấm A oryzae VS1 A oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Hai chủng nấm đƣợc cung cấp phịng Genomic - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Vì bị xóa gen pyrG nên hai chủng nấm khơng có khả sinh trƣởng mơi trƣờng tối thiểu CD Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy 0,1% uridine 0,1% uracil, chủng A oryzae xóa gen pyrG sinh trƣởng đạt kích thƣớc tƣơng đƣơng với chủng tự nhiên [77] Hình 3.2 Hình thái cấu trúc hiển vi chủng A oryzae VS1 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil 49 z Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng CD bổ sung 0,1% uridine 0,1% uracil, chủng VS1 (nguồn gốc Việt Nam) sinh trƣởng tốt chủng quốc tế RIB40 với đƣờng kính khuẩn lạc tƣơng ứng 4,2 cm (VS1) 3,1 cm (RIB40) Hình thái khuẩn lạc hai chủng tƣơng tự với màu vàng - xanh bào tử nấm Khuẩn lạc chủng VS1 có màu xanh lục ngả vàng, khuẩn lạc chủng quốc tế RIB40 có màu vàng hoa cau Khi quan sát mặt sau đĩa thạch, hệ sợi hai chủng màu Hệ sợi chủng VS1 phát triển mạnh vào chất tạo nên rãnh bề mặt khuẩn lạc khiến cho mặt sau khuẩn lạc nhăn nheo chủng RIB40 khơng có đặc điểm tƣơng tự Dƣới kính hiển vi, cuống sinh bào tử A oryzae dài, đầu thể bình với nhiều bào tử đính tạo nên cấu trúc cuống sinh bào tử điển hình dạng bơng hoa cúc Bào tử hai chủng A oryzae VS1 RIB40 có dạng hình cầu (Hình 3.2) 3.2 Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil Ở nấm sợi A niger, kỹ thuật chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens với marker gen kháng kháng sinh đƣợc chứng minh hiệu Tuy nhiên, việc tạo chủng đột biến kháng kháng sinh thƣờng có số hạn chế Thứ chi phí cho thí nghiệm cao, giá thành loại kháng sinh đắt, phải sử dụng nồng độ kháng sinh cao để ức chế mọc nấm trình chọn lọc thể chuyển gen (nồng độ kháng sinh hygromycin sử dụng dao động 300900 µg/ml) Hơn nữa, chủng đột biến kháng kháng sinh khó ứng dụng sản xuất thực tế nguy lan truyền gen kháng kháng sinh môi trƣờng đặc biệt sang vi sinh vật gây bệnh Với lợi nhƣ tiết kiệm chi phí, an tồn với mơi trƣờng đƣợc ứng dụng rộng rãi sản xuất công nghiệp, chủng đột biến trợ dƣỡng ngày đƣợc quan tâm Do đó, nghiên cứu này, tiến hành tạo chủng A niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil phƣơng pháp xóa gen pyrG Gen pyrG mã hóa cho enzyme OMP decarboxylase tham gia vào trình sinh tổng hợp uridine/uracil, thành phần quan trọng trình sinh trƣởng phát triển nấm sợi Chủng đột biến trợ dƣỡng có khả sinh trƣởng mơi trƣờng có bổ sung uracil/uridine nhận 50 z lại đƣợc gen pyrG Lúc gen pyrG đƣợc dùng làm marker dùng cho chuyển gen thay cho gen kháng kháng sinh 3.2.1 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG Để xóa gen pyrG nấm sợi A niger, tạo vector nhị thể với vùng T-DNA mang gen pyrG khơng cịn ngun vẹn Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc dựa cấu trúc vector pKO2 cung cấp Phòng Genomic - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Phƣơng pháp tạo vector xóa gồm ba bƣớc Bƣớc thứ khuếch đại đoạn pyrG nguyên gốc kích thƣớc 2,8 kb nấm A niger N402 (Hình 3.3B) cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2) Bƣớc thứ hai gắn đoạn pyrG vào khung vector pKO2 đƣợc xử lý enzyme giới hạn Bƣớc cuối cắt bỏ đoạn 564 bp khung đọc mở enzyme giới hạn BamHI EcoRV, làm đầu đóng vịng plasmid nhằm làm hỏng vùng mã hóa gen pyrG để tạo thành vector xóa pKO2-pyrG (Hình 3.3A) Cấu trúc xóa gen pyrG sau đƣợc xác nhận cắt kiểm tra với enzyme giới hạn XhoI (có trình tự nhận biết hai đầu gen pyrG) Kết điện di gel agarose 0,7% cho thấy kích thƣớc sản phẩm thu đƣợc từ vector xóa 1,79 kb nhỏ 564 bp so với kích thƣớc đoạn 2,35 kb cắt từ vector mang gen pyrG nguyên gốc (Hình 3.3C) Quy trình tạo vector xóa gen pyrG sơ đồ cắt kiểm tra đƣợc thể Hình 3.3 51 z Hình 3.3 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG nấm Aspergillus niger (A) Sơ đồ bƣớc tạo cấu trúc xóa gen pyrG, (B) Sản phẩm PCR đoạn pyrG A niger dùng tạo cấu trúc xóa gen, (C) Điện di sản phẩm cắt kiểm tra cấu trúc xóa pKO2-ΔpyrG với enzym XhoI Từ kết trên, kết luận vector pKO2-pyrG dùng để xóa gen pyrG A niger đƣợc tạo thành cơng 3.2.2 Xóa thành cơng gen pyrG A niger N402 Để xóa gen pyrG A niger N402, vector xóa pKO2-ΔpyrG đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens phƣơng pháp xung điện Thêm 500 µl LB lỏng vào ống biến nạp nuôi lắc 28oC, tốc độ 200 vịng/phút 52 z Dịch ni đƣợc ly tâm thu cặn cấy trải đĩa LB có bổ sung kanamycin để chọn lọc khuẩn lạc vi khuẩn nhận đƣợc cấu trúc xóa gen Ba khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên để kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2 ) Kết cho thấy khuẩn lạc cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 2,2 kb, nhỏ 564 bp so với kích thƣớc đoạn pyrG nguyên gốc 2,8 kb (Hình 3.4) Nhƣ vậy, khuẩn lạc A tumefaciens AGL1 nhận đƣợc cấu trúc xóa gen Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa pyrG A1, A2, A3 M: 1kb DNA marker, (+) Đối chứng dƣơng sử dụng khuôn đoạn pyrG nguyên gốc 2,8 kb Vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc sử dụng để chuyển vào nấm sợi A niger Quy trình xóa gen đƣợc thực dựa quy trình xóa gen pyrG Aspergillus oryzae [77] Một số thông số đƣợc thay đổi cho phù hợp với A niger Bào tử nấm vi khuẩn A tumefaciens đƣợc ủ chung môi trƣờng cảm ứng nhiệt độ tối ƣu 22oC Q trình đồng ni cấy kéo dài 2,5 ngày Sau màng chuyển gen đƣợc chuyển sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc CD có bổ sung 5-FOA, 0,1% uridine 0,1% uracil để sàng lọc thể xóa gen Các bƣớc quy trình xóa gen A niger đƣợc tóm tắt Hình 3.5 53 z Hình Quy trình xóa gen pyrG nấm sợi A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT Sau ngày, môi trƣờng chọn lọc CD pH 5,5 + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA, số khuẩn lạc kháng 5-FOA xuất đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A tumefaciens khơng mang vector xóa không xuất khuẩn lạc Kết trình xóa gen đƣợc thể Hình 3.6 Hình 3.6 Kết xóa gen mơi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1% uridine, 0,1% uracil 0,2% – FOA Đối chứng sử dụng chủng AGL1 không mang vector xóa pyrG 54 z Các thể nấm kháng 5-FOA đƣợc cấy chuyển đồng thời sang ba môi trƣờng CD; CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA sử dụng chủng tự nhiên A niger N402 (WT) làm đối chứng Kết cho thấy môi trƣờng tối thiểu CD, chủng đột biến không sinh trƣởng đƣợc chủng tự nhiên phát triển bình thƣờng Ngƣợc lại, mơi trƣờng CD + uridine + uracil + 5-FOA, chủng đột biến có khả sinh trƣởng bình thƣờng chủng tự nhiên không sinh trƣởng đƣợc chuyển hóa 5-FOA gây độc tế bào Cả chủng tự nhiên chủng đột biến sinh trƣởng tốt mơi trƣờng CD + uridine + uracil (Hình 3.7) Hình 3.7 Kiểm tra khả sinh trƣởng chủng đột biến môi trƣờng khác nhau, đối chứng sử dụng chủng A niger N402 Để khẳng định xác chủng kháng 5-FOA thu đƣợc có phải chủng đột biến xóa gen pyrG hay khơng, chúng tơi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ chủng nêu kiểm tra cấu trúc gen pyrG PCR với cặp mồi đặc hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2) Theo tính tốn lý thuyết, kích thƣớc sản phẩm PCR thu đƣợc chủng tự nhiên 2,78 kb; kích thƣớc sản phẩm PCR từ chủng xóa gen pyrG nhỏ 564 bp vào khoảng 2,2 kb Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng X4 chủng đột biến xóa gen pyrG Các chủng X1, X2, X3 kháng 5-FOA khuyết dƣỡng uridine/uracil nhƣng gen pyrG nguyên vẹn giống với chủng tự nhiên (Hình 3.8B) Có thể chủng X1, X2, X3 trình chuyển gen, T-DNA chèn ngẫu nhiên làm hỏng gen liên quan đến q trình sinh tổng hợp uridine/uracil 55 z Hình 3.8 Xác nhận chủng xóa gen pyrG (A) Sơ đồ trao đổi chéo vị trí cặp mồi dùng để xác nhận chủng xóa gen, (B) PCR xác nhận chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil X1, X2, X3, X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2, (C) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/R, (D) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P3 Đối chứng âm sử dụng nƣớc cất vô trùng WT: sử dụng DNA chủng N402 M: kb DNA marker 56 z Để khẳng định chắn, chủng X4 chủng xóa gen pyrG, chúng tơi tiếp tục kiểm tra chủng đột biến xóa gen X4 với cặp mồi An-pyrG-ORF-F/R cặp mồi kết hợp An-pyrG-ORF-F mồi An-pyrG-P3 (Bảng 2.2) Cặp mồi An-pyrG-ORF khuếch đại khung đọc mở (ORF) gen pyrG, với chủng tự nhiên cho băng 1,05 kb, chủng đột biến lên băng 0,49 kb (Hình 3.8C) Nhƣ vậy, khung đọc mở gen pyrG chủng đột biến X4 bị loại bỏ đoạn kích thƣớc 564 bp giống nhƣ tính tốn lý thuyết Cặp mồi An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 đƣợc sử dụng thêm để khẳng định đoạn gen bị xóa nằm locus gen pyrG, mồi AnpyrG-P3 gắn vào vùng nằm ngồi cấu trúc xóa Kết thu đƣợc, chủng đột biến lên băng 1,52 kb, nhỏ 564 bp so với chủng tự nhiên 2,08 kb (Hình 3.8D) Với tất kết trên, kết luận chủng đột biến X4 bị xóa gen pyrG theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng Trƣớc đây, việc tạo chủng A niger đột biến xóa gen pyrG đƣợc thực thành cơng phƣơng pháp sử dụng tia UV gây đột biến ngẫu nhiên xóa gen theo chế trao đổi chéo tƣơng đồng sử dụng biện pháp chuyển gen tế bào trần [38, 79] Tuy nhiên, sử dụng tia UV gây nhiều loại đột biến nhƣ dịch khung, thay nucleotide, xóa nucleotide, tái tổ hợp xếp lại vật chất di truyền Mặt khác, tia UV thƣờng tạo nhiều đột biến vị trí khác nên khó để kiểm sốt cấu trúc di truyền thể đột biến xóa gen [58] Xóa gen tế bào trần cho hiệu suất cao nhƣng tốn hóa chất enzyme đắt tiền, quy trình thực gồm nhiều bƣớc phức tạp [99] Việc xóa gen pyrG sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đơn giản so với hai phƣơng pháp trên, dễ dàng tạo đƣợc đột biến đích theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng Hơn nữa, lần việc xóa gen pyrG đƣợc thực thành cơng chủng nấm mốc A niger N402 phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 57 z 3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil DsRed gen thị huỳnh quang đƣợc sử dụng phổ biến chuyển gen nấm, thực vật đƣợc biểu thành công nhiều loài nấm sợi nhƣ A oryzae, A nidulans, A fumigatus… Chính vậy, DsRed đƣợc chọn làm gen thị cho tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger trợ dƣỡng sử dụng phƣơng pháp ATMT vector nhị thể tạo pEX2A 3.3.1 Tạo vector nhị thể pEX2A Vector pEX2A đƣợc tạo dựa cấu trúc vector pEX2, chứa gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển promoter gpdA từ A nidulans marker trợ dƣỡng pyrG A niger Đoạn gen pyrG A niger đƣợc khuếch đại với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2), sau đƣợc xử lý với hai enzyme XbaI EcoRI Sau tinh sạch, đoạn cắt đƣợc gắn vào khung vector pEX2 đƣợc xử lý trƣớc enzyme giới hạn EcoRI SpeI (Hình 3.9) Vector pEX2A sau tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzyme XhoI (có trình tự nhận biết nằm bên gen pyrG A niger trình tự nhận biết nằm khung vector pEX2) Điện di sản phẩm phản ứng cắt gel agarose 0,7% 30 phút, 90 V, kết thu đƣợc ba băng có kích thƣớc 1,24 kb; 2,35 kb 8,29 kb (Hình 3.9) Kết phù hợp với tính tốn lý thuyết, nên khẳng định cấu trúc vector pEX2A đƣợc tạo thành cơng 58 z Hình 3.9 Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A (A) Quá trình nối đoạn pyrG vào khung vector pEX2 để tạo vector pEX2A, (B) Sơ đồ cắt kiểm tra vector pEX2A với enzyme XhoI ảnh điện di kết cắt kiểm tra 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ uridine/uracil đến phục hồi sinh trƣởng chủng xóa gen pyrG Chủng N402 xóa gen pyrG khơng có khả tự tổng hợp uridine/uracil nên khơng thể sinh trƣởng mơi trƣờng tối thiểu khơng có mặt uridine/uracil Vì đặc điểm nên giai đoạn đồng nuôi cấy bào tử nấm vi khuẩn A tumefaciens, môi trƣờng cảm ứng IM phải đƣợc bổ sung uridine/uracil Để xác định nồng độ uridine/uracil thích hợp cần phải bổ sung, tiến hành kiểm tra mức độ phục hồi chủng xóa gen pyrG mơi trƣờng ni cấy có bổ sung nồng độ uridine/uracil khác Các chủng xóa gen đƣợc cấy môi trƣờng tối thiểu CD bổ sung lần lƣợt: 0,01% uridine; 0,02% uridine; 0,03% uridine; 0,01% uracil; 0,02% uracil; 0,03% uracil; 0,01% uridine + 0,01% uracil; 0,02% uridine + 0,02% 59 z uracil; 0,03% uridine + 0,03% uracil Sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 30°C, mức độ phục hồi chủng xóa gen pyrG đƣợc thể Hình 3.10 Hình 3.10 Ảnh hƣởng nồng độ uridine/uracil đến khả sinh trƣởng chủng đột biến xóa gen pyrG (A) Hình thái chủng xóa gên CD môi trƣờng bổ sung nồng độ uridine: 0,01%; 0,02%, 0,03%, (B) Hình thái chủng xóa gen môi trƣờng CD bổ sung ba nồng độ uracil: 0,01%; 0,02%; 0,03%, (C) Hình thái chủng xóa gen môi trƣờng CD bổ sung uridine uracil với nồng độ loại: 0,01%; 0,02%; 0,03% Trên môi trƣờng CD bổ sung 0,01% uracil; 0,02% uracil 0,03% uracil chủng tự nhiên chủng xóa gen sinh trƣởng đƣợc hình thành bào tử màu đen, nhƣng chủng xóa gen phát triển chậm nhiều so với chủng tự nhiên (Hình 3.10B) Trên mơi trƣờng CD bổ sung uridine, khuẩn lạc chủng xóa gen có kích thƣớc tƣơng đƣơng với chủng tự nhiên, nhiên chủng xóa gen gần nhƣ khơng sinh bào tử (0,01% uridine) lƣợng bào tử đƣợc sinh (0,02% 0,03% uridine) (Hình 3.10A) Trên mơi trƣờng CD bổ sung 0,01% uridine 0,01% 60 z uracil, chủng xóa gen sinh trƣởng chậm chút so với chủng tự nhiên (Hình 3.10C) Khi bổ sung 0,02% uridine 0,02% uracil, gần nhƣ khơng có khác biệt kích thƣớc chủng đột biến xóa gen chủng tự nhiên Nhƣng bổ sung 0,03% uracil 0,03% uridine hai chủng có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhƣng lại phát triển chậm nồng độ 0,02% uracil 0,02% uridine (Hình 3.10C) Sự ức chế sinh trƣởng nồng độ uracil cao đƣợc Nguyễn Thị Khuyến cộng báo cáo lồi A oryzae [78] Nhƣ vậy, mơi trƣờng tối thiểu có bổ sung 0,02% uridine 0,02% uracil môi trƣờng tốt để phục hồi kiểu hình khả sinh trƣởng chủng A niger xóa gen pyrG 3.3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil Chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens đƣợc chứng minh phƣơng pháp đơn giản, cho hiệu cao áp dụng đƣợc với nhiều loài nấm sợi Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm: thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), nồng độ bào tử, nhiệt độ thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ uridine/uracil môi trƣờng cảm ứng Với loài, cần quy trình tối ƣu để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen mong muốn Trong nghiên cứu này, số thông số chuẩn áp dụng cho chuyển gen theo phƣơng pháp ATMT vào nhiều loài nấm sợi đƣợc giữ nguyên nhƣ nồng độ AS 200 µM, thời gian ni cảm ứng giờ, nhiệt độ đồng nuôi cấy 22°C… [69, 77] Dựa kết khả sinh trƣởng chủng A niger xóa gen pyrG mơi trƣờng có bổ sung nồng độ uridine, uracil khác (Hình 3.10), lựa chọn bốn môi trƣờng cảm ứng để tiến hành tối ƣu quy trình chuyển gen là: IM + 0,02% uridine; IM + 0,02% uracil, IM + 0,01% uridine + 0,01% uracil IM + 0,02% uridine + 0,02% uracil Hai nồng độ bào tử nấm đƣợc sử dụng chuyển gen 105 106 bào tử/ml Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang vector pEX2A đƣợc sử dụng để tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger Cấy khuẩn lạc tƣơi chủng vi khuẩn vào mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kanamycin (100 mg/l), nuôi lắc qua đêm 28°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Hút ml dịch vi khuẩn cho vào ml mơi trƣờng IM lỏng có bổ sung AS (200 µM), bọc giấy bạc vào bình vi khuẩn, ni lắc 61 z 28°C, 200 vịng/phút cho OD đạt 0,6-0,8 Trộn 100 µl dịch vi khuẩn đƣợc cảm ứng với 100 µl dịch bào tử (nồng độ 105 106 bào tử/ml) Hỗn hợp đƣợc trải màng cellulose đặt loại môi trƣờng cảm ứng bổ sung 200 µM AS, đồng ni cấy hộp tối 22°C 2,5 ngày Sau màng cellulose đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung cefotaxime (300 mg/l) Sau ủ đĩa ngày 30°C, đĩa môi trƣờng chọn lọc xuất khuẩn lạc nấm chuyển gen riêng rẽ, số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc ml dịch bào tử đƣợc thể Hình 3.11 Hình 3.11 Kết tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil Các kết đƣợc thể Hình 3.11 cho thấy điều kiện nồng độ 106 bào tử/ml, môi trƣờng cảm ứng IM bổ sung 0,02% uridine 0,02% uracil cho kết cao chuyển gen vào chủng A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil Ở điều kiện này, số thể chuyển gen thu đƣợc 2250 ± 200 thể chuyển gen/106 bào tử Ở điều kiện bổ sung nồng độ 0,02% uridine 0,02% uracil nhƣng giảm nồng độ bào tử xuống 105 bào tử/ml, kết chuyển gen thu đƣợc 1120 thể chuyển gen/ml bào tử, giảm xuống nửa so với điều kiện Ở nồng độ 62 z uridine/uracil lại, số lƣợng thể chuyển gen thu đƣợc thấp nhiều Đặc biệt nồng độ 0,02% uracil, kết chuyển gen thu đƣợc đạt 67 ± 15 thể chuyển gen/105 bào tử Nhƣ vậy, môi trƣờng IM bổ sung 0,02% uridine 0,02 % uracil với nồng độ 106 bào tử/ml điều kiện tốt để chuyển gen vào nấm sợi A niger trợ dƣỡng uridine/uracil Quy trình chuyển gen tối ƣu đƣợc tóm tắt Hình 3.12 Hình 3.12 Chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng nhờ vi khuẩn A tumefaciens, (A) Quy trình chuyển gen tối ƣu, (B) Minh họa thể chuyển gen xuất đĩa môi trƣờng tối thiểu, đối chứng sử dụng vi khuẩn không biến nạp vector Phƣơng pháp chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens đƣợc áp dụng thành công số loài nấm sợi với hiệu suất cao nhƣ A awamori (400 thể chuyển 63 z gen/106 bào tử), Trichoderma reesei (10-20 thể chuyển gen/105 bào tử), A oryzae (1060 ± 143 thể chuyển gen/106 bào tử) [69, 77, 105] Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi A niger với marker pyrG tế bào trần đƣợc thực thành công với hiệu 400 khuẩn lạc/107 tế bào trần [38] Tuy nhiên, phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần có nhiều hạn chế nhƣ chi phí cao, bƣớc thực phức tạp đòi hỏi nhiều kinh nghiệm hiệu suất không ổn định với lần thực [59, 65] Phƣơng pháp chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens sử dụng trực tiếp bào tử nấm để chuyển gen, quy trình thực đơn giản cho hiệu chuyển gen cao, ổn định lần thực khác [39] Quy trình chuyển gen tối ƣu vào chủng A niger trợ dƣỡng uridine/uracil nhờ vi khuẩn A tumefacines đƣợc thiết lập nghiên cứu với hiệu cao, lên tới 2200 thể chuyển gen/106 bào tử, cao nhiều so với phƣơng pháp sử dụng tế bào trần (400 khuẩn lạc/107 tế bào trần) Quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG mở triển vọng cho nghiên cứu biểu enzyme protein tái tổ hợp loài nấm sợi tiềm 3.3.4 Đánh giá hiệu chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A niger N402 trợ dƣỡng Để xác nhận khuẩn lạc thu đƣợc đĩa chuyển gen có nhận đƣợc gen chuyển, chúng tơi chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc cấy chuyển sang môi trƣờng CD, sau tiến hành ni hệ sợi, tách chiết DNA PCR xác nhận với hai cặp mồi DsRed-F/R An-pyrG-P1/P2 Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, thể chuyển gen lên băng với kích thƣớc lần lƣợt 2,8 kb 2,2 kb, đối chứng âm sử dụng DNA tổng số A niger đột biến trợ dƣỡng xóa gen pyrG lên băng 2,2 kb (Hình 3.13A) Cặp mồi DsRed-F/R cho kết với chủng chuyển gen băng DNA có kích thƣớc 730 bp tƣơng ứng với kích thƣớc gen DsRed, đối chứng âm sử dụng DNA chủng A niger N402 xóa gen pyrG khơng xuất băng (Hình 3.13B) Bên cạnh việc xác nhận chuyển gen PCR, chúng tơi cịn tiến hành quan sát hệ sợi chủng chuyển gen dƣới kính hiển vi huỳnh quang Kết cho thấy, hệ sợi cuống sinh bào tử chủng đƣợc quan sát phát tín hiệu 64 z huỳnh quang tốt (Hình 3.12C) Nhƣ vậy, quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm sợi A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil biểu thành cơng gen huỳnh quang DsRed Hình 3.13 Biểu gen huỳnh quang DsRed chủng A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil (A) Kiểm tra PCR gen pyrG, (B) Kiểm tra PCR gen DsRed, (C) Sợi nấm cấu trúc cuống sinh bào tử thể chuyển gen dƣới kính hiển vi huỳnh quang 3.4 Chuyển gen vào nấm mốc tƣơng A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A 3.4.1 Mức độ tƣơng đồng gen pyrG chi Aspergillus Gen pyrG lồi thuộc chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao so sánh với Trình tự gen pyrG nấm A niger có độ tƣơng đồng axit amin đến 91,7% so sánh với A oryzae A flavus, 91% so với A parasiticus 89,2% so với A fumigatus Tuy nhiên, mức độ tƣơng đồng gen pyrG A niger đạt 50% so với trình tự URA3 (sinh tổng hợp uracil) 65 z Sacharomyces cerevisiae (Hình 3.14) Mức độ tƣơng đồng cao trình tự gen pyrG sở để sử dụng gen pyrG A niger làm marker cho chuyển gen vào loài Aspergillus gần gũi Một số nghiên cứu trƣớc gen pyrG nấm sợi A niger đƣợc sử dụng làm marker để chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil, gen pyrG A niger đƣợc biểu thành công nấm sợi A oryzae enzyme mã hóa có khả hoạt động A oryzae [66] Hình 3.14 Sự tƣơng đồng pyrG loài Aspergillus khác (A) Mức độ tƣơng đồng trình tự axit amin protein PyrG/URA3 loài nấm, (B) Khoảng cách di truyền loài nấm qua phân loại với gen pyrG/URA3 3.4.2 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae Trong nghiên cứu này, tiếp tục sử dụng vector pEX2A với marker pyrG A niger dùng để chuyển vào hai chủng A oryzae VS1, RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil nhằm đánh giá khả chuyển biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed hai chủng A oryzae so với A niger trợ dƣỡng uridine/uracil 66 z Quy trình chuyển gen vào nấm sợi A oryzae trợ dƣỡng uridine /uracil đƣợc tiến hành theo quy trình Nguyễn Thị Khuyến cộng đƣợc công bố trƣớc [77] Vi khuẩn A tumefaciens đƣợc nuôi cấy môi trƣờng cảm ứng (IM), bổ sung hợp chất phenolic acetosyringone (AS) với nồng độ 200 mM để kích thích trình chuyển T-DNA Ngồi ra, mơi trƣờng cảm ứng IM cần bổ sung 0,05% uridine 0,05% uracil để hỗ trợ bào tử A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil nảy mầm trình chuyển gen xảy Bào tử tƣơi (nồng độ106 bào tử/ml) hai chủng VS1 RIB40 đƣợc sử dụng thời gian đồng nuôi cấy 60 (2,5 ngày) 22ºC để thu đƣợc thể chuyển gen mơi trƣờng chọn lọc Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil Sau - ngày nhiệt độ 28oC - 30oC, đĩa chuyển gen xuất khuẩn lạc riêng rẽ Trong đó, đĩa đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn A tumefciens không mang vector pEX2A, đĩa chuyển gen không xuất khuẩn lạc Kết chuyển gen chủng A oryzae VS1 RIB40 đƣợc thể Hình 3.17 67 z Hình 3.16 Kết chuyển gen DsRed vào A oryzae chủng RIB40 VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil Các thể chuyển gen DsRed đƣợc chọn lọc môi trƣờng M + Met có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A tumefaciens Chuyển gen vào chủng A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng bào tử nồng độ 106 bào tử/ml thu đƣợc - thể chuyển gen/đĩa Chủng A.oryzae RiB40 trợ dƣỡng với nồng độ bào tử tƣơng ứng thu đƣợc từ 71 – 112 thể chuyển gen/đĩa Để xác nhận thể chuyển gen thu đƣợc đĩa nhận đƣợc gen cần chuyển, lựa chọn ngẫu nhiên tách chiết DNA số khuẩn lạc, sau PCR kiểm tra với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 DsRed-F/R Ở chủng A oryzae RIB40∆pyrG, tất thể chuyển gen cho băng 2,8 kb với cặp mồi An-pyrGP1/P2 (Hình 3.17A), cho băng 730 bp với cặp mồi DsRed-F/R với kích thƣớc marker pyrG A niger gen thị huỳnh quang đỏ DsRed (Hình 3.17B) Quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, hệ sợi tất thể chuyển gen cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.17C) Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker trợ dƣỡng pyrG A niger đƣợc biểu thành công chủng A oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil với hiệu suất 100% 68 z Hình 3.17 Biểu gen huỳnh quang DsRed chủng A oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil (A) PCR xác nhận với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, (B) PCR xác nhận với cặp mồi DsRed-F/R, (C) Cấu trúc hệ sợi nấm dƣới kính hiển vi huỳnh quang Ở chủng VS1, đĩa chuyển gen chí xuất số khuẩn lạc có màu hồng (Hình 3.16) Kết thu đƣợc PCR sử dụng cặp mồi DsRed-F/R chủng VS1 chuyển gen xuất băng 730 bp, phù hợp với kích thƣớc gen DsRed, 69 z đối chứng âm sử dụng DNA tổng số chủng trợ dƣỡng khơng cho băng (Hình 3.18A) Ngồi ra, tiến hành quan sát hệ sợi thể chuyển gen VS1 dƣới kính hiển vi huỳnh quang, 100% thể chuyển gen đƣợc chọn ngẫu nhiên quan sát cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.18B) Hình 3.18 Xác nhận chuyển gen DsRed vào A oryzae VS1∆pyrG sử dụng vector pEX2A (A,B) PCR xác nhận gen DsRed thể chuyển gen (V1,V2,V3) sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2 DsRed-F/R, (B) Hệ sợi thể chuyển gen dƣới kính hiển vi huỳnh quang 70 z Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc biểu thành công chủng nấm sợi A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens với marker trợ dƣỡng pyrG A niger Gen huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển promoter gpdA từ nấm sợi A nidulans lần đƣợc biểu thành công A oryzae phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens với marker trợ dƣỡng pyrG A niger Biểu gen DsRed dƣới kiểm sốt promoter gpdA cịn dẫn đến kiểu hình đỏ đĩa mơi trƣờng tƣơng tự nhƣ số nấm sợi khác nhƣ Acremonium chrysogenum Penicillium paxilli [44, 71] Điều cho thấy biểu gen dƣới điều khiển promoter gpdA từ A nidulans có hiệu lồi nấm khác thuộc chi Aspergillus Promoter gpdA vector nhị thể tạo đƣợc thay promoter mạnh khác nhƣ amyB, melO, glaA, tefl để nâng cao hiệu biểu gen loài nấm sợi an toàn [77, 78] Nấm sợi A oryzae đƣợc nghiên cứu chuyển gen từ nhiều năm nay, nhiên phƣơng pháp chuyển gen thông qua tế bào trần [32, 66] Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens, sử dụng marker kháng kháng sinh đƣợc áp dụng thành công với nhiều loại nấm sợi, nhƣng không khả thi với A oryzae khả kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh Do đó, gen trợ dƣỡng pyrG giải pháp tối ƣu làm marker chuyển vào A oryzae Mới đây, phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi A oryzae trợ dƣỡng với marker pyrG A oryzae đƣợc thực thành công [77] Tuy nhiên, lần gen pyrG A niger đƣợc sử dụng làm marker để chuyển vào A oryzae trợ dƣỡng theo phƣơng pháp ATMT với hiệu chuyển gen lên tới 400 - 800 thể chuyển gen/106 bào tử với chủng VS1 710 - 1120 thể chuyển gen/106 bào tử với chủng quốc tế RIB40 Hơn nữa, hiệu suất biểu gen huỳnh quang đỏ nghiên cứu đạt 100% với hai chủng VS1 RIB40 Nhƣ vậy, việc sử dụng gen pyrG A niger làm marker chuyển gen vào A oryzae hồn tồn khả thi Điều góp phần chứng minh gen pyrG số loài chi Aspergillus có khả biểu lồi nấm sợi có quan hệ gần gũi, mở triển vọng cho nghiên cứu chuyển gen 71 z trợ dƣỡng vào lồi nấm sợi phục vụ cho lợi ích nghiên cứu kinh tế ngƣời 3.5 Biểu gen huỳnh quang DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA từ A niger Trong nghiên cứu này, chứng minh đƣợc promoter gpdA từ nấm sợi A nidulans hoạt động hiệu việc biểu gen DsRed hai loài nấm sợi A niger A oryzae thông qua việc sử dụng vector pEX2A Để đánh giá hiệu hệ thống chuyển gen vừa thiết lập đƣợc, tiến hành thay promoter gpdA vector pEX2 [77] promoter cảm ứng mạnh glaA A niger để tạo vector pEX2C Sau sử dụng vector tạo đƣợc để đánh giá hoạt động marker pyrG từ A oryzae promoter glaA từ A niger hai loài A niger A oryzae 3.5.1 Tạo vector pEX2C Vector pEX2C đƣợc tạo thành dựa cấu trúc vector pEX2, chứa gen DsRed đƣợc điều khiển promoter glaA A niger marker chọn lọc pyrG A oryzae Promoter gpdA từ A nidulans điều khiển hoạt động gen huỳnh quang đỏ DsRed vector pEX2 đƣợc thay promoter glaA A niger Các bƣớc tạo cấu trúc vector gồm: PCR đoạn glaA kích thƣớc 600 bp từ hệ gen nấm A niger cặp mồi An-glaA-pro-F/R (Bảng 2.2), xử lý đoạn glaA với enzyme SpeI XhoI, tinh đoạn cắt glaA gắn vào khung vector pEX2 đƣợc xử lý hai enzyme SpeI XhoI Cấu trúc vector pEX2C sau đƣợc tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzyme EcoRI có vị trí nhận biết vector: vị trí gen pyrG vị trí promoter glaA (Hình 3.19A) Sản phẩm cắt kiểm tra đƣợc điện di gel agarose 0,7%, 90V 30 phút Kết quan sát cho thấy, sản phẩm cắt gồm băng DNA với kích thƣớc lần lƣợt 8,4 kb 2,2 kb (Hình 3.19B), hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết Nhƣ vậy, khẳng định, vector pEX2C đƣợc tạo thành cơng Q trình tạo cấu trúc cắt kiểm tra vector pEX2C đƣợc tóm tắt Hình 3.19 72 z Hình 3.19 Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2C (A) Tạo cấu trúc pEX2C cách nối promoter glaA từ A niger thay promoter gpdA vetor pEX2 (B) Sơ đồ cắt giới hạn kiểm tra vector pEX2C enzyme EcoRI ảnh điện di kết cắt 3.5.2 Biểu gen DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA thông qua vector pEX2C Vector pEX2C sau tạo thành đƣơc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens theo phƣơng pháp biến nạp xung điện Sau - ngày cấy trải môi trƣờng LB bổ sung kanamycin (100mg/l), thu đƣợc số khuẩn lạc đơn Bốn khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc lựa chọn PCR với cặp mồi An-pro-glaA-F/R (Bảng 2.2) Kết cho thấy, tất khuẩn lạc đƣợc chọn lên băng DNA có kích thƣớc 600 bp tƣơng ứng với kích thƣớc promoter glaA nấm sợi A niger Đối chứng dƣơng sử dụng vector pEX2C cho băng DNA kích thƣớc 600 bp Đối chứng âm sử dụng vi khuẩn A tumefaciens không mang vector pEX2C không lên băng DNA (Hình 3.20) 73 z Hình 3.20 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4 Đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn AGL1 không mang vector pEX2C Đối chứng (+) sử dụng vector pEX2C Nhƣ tất khuẩn lạc vi khuẩn A tumefaciens AGL1 đƣợc chọn nhận đƣợc vector pEX2C Chọn khuẩn lạc kiểm tra để nuôi cấy tiến hành chuyển gen vào hai chủng nấm mốc A niger N402 A oryzae VS1 trợ dƣỡng theo quy trình thiết lập Sau - ngày chuyển màng, đĩa môi trƣờng chọn lọc xuất thể chuyển gen mọc riêng rẽ Trong đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A tumefaciens không mang vector pEX2C không xuất thể chuyển gen hai chủng (Hình 3.21) Hình 3.21 Chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG từ A oryzae vào A niger N402 A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil 74 z Các thể chuyển gen DsRed chủng A niger N402 đƣợc chọn lọc đĩa môi trƣờng CD bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A tumefaciens Chuyển gen vào chủng N402 trợ dƣỡng uridine/uracil với nồng độ 106 bào tử/ml thu đƣợc 57 - 81 thể chuyển gen/đĩa Trong đó, số thể chuyển gen chủng A niger N402 có màu hồng đĩa chọn lọc Thể chuyển gen chủng VS1 đƣợc chọn lọc môi trƣờng M + Met bổ sung cefotaxime (300 µg/ml) Kết chuyển gen vào chủng A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil thu đƣợc - thể chuyển gen/đĩa Các thể chuyển gen N402::DsRed đƣợc xác nhận ba phản ứng PCR độc lập sử dụng cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, An-glaA-pro-F/R DsRed-F/R Với cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, thể chuyển gen lên băng xấp xỉ 900 bp tƣơng ứng với kích thƣớc khung đọc mở gen pyrG A oryzae (Hình 3.22A) Với cặp mồi An-glaA-pro-F/R thể chuyển gen cho băng tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn promoter glaA 600 bp (Hình 3.22C) Với cặp mồi Dsred-F/R, kết thu đƣợc thể chuyển gen băng DNA với kích thƣớc 730 bp với kích thƣớc gen DsRed (Hình 3.22B) Đối chứng âm sử dụng DNA chủng N402 trợ dƣỡng, kết điện di không cho băng Khi quan sát dƣới ánh sáng huỳnh quang, toàn hệ sợi bào tử thể chuyển gen phát tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.22D) Nhƣ vậy, gen DsRed dƣới điều khiển promoter glaA đƣợc chuyển thành công vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil 75 z Hình 3.22 Biểu gen DsRed chủng nấm A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil (A, B,C) PCR xác nhận gen pyrG, DsRed glaA bốn chủng chuyển gen N1, N2, N3, N4 M: Marker DNA 1kb Đối chứng (+) sử dụng vector pEX2C, đối chứng (-) sử dụng nƣớc cất vô trùng, (D) Hệ sợi nấm thể chuyển gen dƣới ánh sáng huỳnh quang Các thể chuyển gen chủng VS1 đƣợc tiến hành xác nhận PCR với hai cặp mồi An-glaA-pro-F/R DsRed-F/R Kết PCR tất chủng chuyển gen cho băng DNA tƣơng ứng với kích thƣớc promoter glaA (600 bp) gen DsRed (730 bp) (Hình 3.23A) Hệ sợi thể chuyển gen quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.23D) Hơn nữa, thể chuyển gen chủng VS1 cấy mơi trƣờng CD có bổ sung 1% tinh bột, mặt sau hệ sợi có màu hồng nhạt đến đậm (Hình 3.23C) Điều giải thích promoter glaA điều khiển hoạt động gen DsRed promoter cảm ứng Khi môi trƣờng có bổ sung tinh bột, maltose cảm ứng hoạt động promoter khiến cho gen DsRed đƣợc biểu mạnh, chí dẫn đến kiểu hình đỏ quan sát mắt thƣờng Nhƣ vậy, kết luận gen huỳnh quang đỏ DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA A niger biểu tốt chủng nấm A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil 76 z Hình 3.23 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil (A,B) Xác nhận PCR gen DsRed glaA chủng chuyển gen V1, V2, V3, V4, (C) Hệ sợi chủng chuyển gen có màu hồng ni cấy mơi trƣờng CD bổ sung 1% tinh bột, (D) Hệ sợi nấm cuống sinh bào tử phát tín hiệu huỳnh quang đỏ tốt quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang Promoter glaA đƣợc sử dụng nghiên cứu đoạn promoter gen glaA mã hóa cho enzyme glucoamylase A A niger Các nghiên cứu trƣớc rằng, glaA promoter cảm ứng, hoạt động mạnh mơi trƣờng ni cấy có bổ sung tinh bột, glucose, maltose bị ức chế biểu bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy xylose [28, 29, 95] Promoter glaA đƣợc đƣa vào nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp đƣợc sử dụng nhƣ chiến lƣợc công nghiệp sản xuất enzyme từ A niger, A oryzae số loài Aspergillus khác Promoter glaA đƣợc sử dụng để biểu thành công gen GFP A niger sử dụng phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần [33] Trong nghiên cứu này, promoter glaA đƣợc sử dụng thay cho promoter gpdA cho kết biểu gen cao 77 z hai loài nấm sợi A niger A oryzae Đây lần đầu tiên, gen DsRed dƣới điều khiển promoter glaA từ A niger đƣợc biểu thành công A oryzae A niger phƣơng pháp ATMT Kết lần chứng minh khả hoạt động promoter glaA loài khác chi Aspergillus Gen thị huỳnh quang đỏ DsRed vector tạo đƣợc nghiên cứu đƣợc thay gen mã hóa cho enzyme protein mong muốn nhằm tăng cƣờng biểu gen dƣới điều khiển promoter glaA Thêm vào kết chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG A oryzae cho kết ấn tƣợng với chủng A niger N402 (570 thể chuyển gen/106 bào tử) chủng A oryzae VS1 (70 thể chuyển gen/106 bào tử) Nghiên cứu lần khẳng định khả hoạt động chéo gen pyrG số loài gần gũi chi Aspergillus Việc sử dụng marker pyrG A oryzae làm marker trợ dƣỡng chuyển gen vào nấm sợi A niger vi khuẩn A tumefaciens hoàn toàn khả thi 78 z KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tạo đƣợc chủng A niger trợ dƣỡng uridine/uracil cách xóa gen pyrG để sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen vào lồi nấm mà khơng sử dụng gen kháng kháng sinh Đã tạo thành công vector nhị thể chứa marker chọn lọc gen pyrG dùng cho chuyển gen vào chủng A niger A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil gồm: vector xóa gen pyrG, vector biểu gen huỳnh qunag đỏ DsRed với marker gen pyrG A niger, vector biểu gen huỳnh quang đỏ với marker trợ dƣỡng pyrG A oryzae promoter glaA A niger Các vector hoạt động tốt chuyển vào chủng A niger N402, A oryzae VS1 A oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Đã xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu cho chuyển gen vào nấm sợi A niger sử dụng vi khuẩn A tumefaciens marker trợ dƣỡng pyrG Đã chứng minh đƣợc việc sử dụng chéo gen pyrG A oryzae làm marker trợ dƣỡng cho chuyển gen vào A niger, ngƣợc lại, sử dụng gen pyrG A niger làm marker trợ dƣỡng chuyển gen vào A oryzae thông qua việc biểu thành công gen mã hóa protein huỳnh quang DsRed Đã chứng minh đƣợc đoạn promoter glaA kích thƣớc 600 bp A niger có khả hoạt động tốt A oryzae thông qua việc biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu biểu số enzyme/protein tái tổ hợp chủng A niger trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens 79 z TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Xuân Dung, Nguyễn Việt Khoa, Nguyễn Văn Tính, Trần Nguyễn Nhật Khoa, Lâm Thị Kim Chung (2012), "Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy Aspergillus niger để tăng hiệu suất sản sinh phytase", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 24: pp 222-232 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), "Vi sinh vật học" Nhà xuất Giáo dục Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải (2011), "Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(1): pp 1-18 Nguyễn Đức Thành, Lê Hoàng Đức (2014), "Nhân dịng gen vùng promoter ubiquitin từ ngơ (Zae Mays L)", Tạp chí Sinh học 35(3se): pp 114-121 Nguyễn Văn Thành, Trần Thị Yến Minh (2013), "Ứng dụng vi sinh vật enzymer protease để cải thiện chất lƣợng nƣớc tƣơng lên men truyền thống.", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 26: pp 205-212 Tài liệu tiếng Anh Acharya P., Acharya D., Modi H (2008), "Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate", African Journal of Biotechnology 7(22) Alam J., Cook J L (1990), "Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription", Analytical biochemistry 188(2): pp 245254 Aluko R., McIntosh T (2005), "Limited enzymatic proteolysis increases the level of incorporation of canola proteins into mayonnaise", Innovative Food Science & Emerging Technologies 6(2): pp 195-202 Archer D B., Peberdy J F (1997), "The molecular biology of secreted enzyme production by fungi", Critical Reviews in Biotechnology 17(4): pp 273-306 80 z 10 Arora D K (1991), Handbook of Applied Mycology: Volume 1: Soil and Plants, CRC Press 11 Baird G S., Zacharias D A., Tsien R Y (2000), "Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral", Proceedings of the National Academy of Sciences 97(22): pp 11984-11989 12 Beijersbergen, Alida Godelieve Maria Bundock, Paul Gouka, Robertus Johannes, De Groot, Marcellus Johannes Augustinus, Hooykaas, Jacob P J., Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus 2001, Google Patents 13 Beijersbergen A G M., Bundock P., Gouka R J., De Groot M J A., Hooykaas P J J., Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus 2001, Google Patents 14 Bennett J W (2010), An overview of the genus Aspergillus, Caiser Academic Press, Portland 15 Bennett J W., Klich M A (1992), Aspergillus: Biology and industrial applications, Butterworth-Heinemann Boston 16 Bos C J (1986), "Induced mutation and somatic recombination as tools for genetic analysis and breeding of imperfect fungi" 17 Breakspear A., Langford K J., Momany M., Assinder S J (2007), "CopA: GFP localizes to putative Golgi equivalents in Aspergillus nidulans", FEMS microbiology letters 277(1): pp 90-97 18 Casselton L., Zolan M (2002), "The art and design of genetic screens: filamentous fungi", Nature Reviews Genetics 3(9): pp 683-697 19 Chakraborty B., Kapoor M (1990), "Transformation of filamentous fungi by electroporation", Nucleic acids research 18(22): pp 6737 20 Chang P.-K., Ehrlich K C (2010), "What does genetic diversity of Aspergillus flavus tell us about Aspergillus oryzae?", International Journal of Food Microbiology 138(3): pp 189-199 81 z 21 de Boer, Paulo Bronkhof, Jurian Dukiќ, Karolina Kerkman, Richard Touw, Hesselien van den Berg, Marco Offringa, Remko (2013), "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum using novel Agrobacterium-mediated transformation approaches", Fungal Genetics and Biology 61: pp 9-14 22 De Groot M J., Bundock P., Hooykaas P., Beijersbergen A (1998), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi", Nature Biotechnology 16 23 Deacon J W (2013), Fungal biology, John Wiley & Sons 24 Debets A J., Holub E F., Swart K., Broek H W., Bos C J (1990), "An electrophoretic karyotype of Aspergillus niger", Molecular and General Genetics MGG 224(2): pp 264-268 25 Elleuche S., Pöggeler S (2009), "Visualization of peroxisomes via SKL-tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", Bikarbonat-Stoffwechsel bei filamentösen Ascomyceten: pp 26 Fincham J (1989), "Transformation in fungi", Microbiological Reviews 53(1): pp 148-170 27 Finkelstein D B (1987), "Improvement of enzyme production in Aspergillus", Antonie Van Leeuwenhoek 53(5): pp 349-352 28 Fowler T., Berka R M., Ward M (1990), "Regulation of the glaA gene of Aspergillus niger", Current genetics 18(6): pp 537-545 29 Ganzlin M., Rinas U (2008), "In-depth analysis of the Aspergillus niger glucoamylase (glaA) promoter performance using high-throughput screening and controlled bioreactor cultivation techniques", Journal of Biotechnology 135(3): pp 266-271 30 Geiser D., Klich M., Frisvad J C., Peterson S., Varga J., Samson R A (2007), "The current status of species recognition and identification in Aspergillus", Studies in Mycology 59: pp 1-10 82 z 31 Gelvin S B (2003), "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool", Microbiology and molecular biology reviews 67(1): pp 16-37 32 Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H (1989), "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis", Molecular and General Genetics MGG 219(1-2): pp 282-288 33 Gordon C L., Khalaj V., Ram A F., Archer D B., Brookman J L., Trinci A P., Jeenes D J., Doonan J H., Wells B., Punt P J (2000), "Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger", Microbiology 146(2): pp 415-426 34 Gouka R., Punt P., Van Den Hondel C (1997), "Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects", Applied microbiology and biotechnology 47(1): pp 1-11 35 Gow N A., Gadd G M (2007), Growing fungus, Springer Science & Business Media 36 Grant S G., Jessee J., Bloom F R., Hanahan D (1990), "Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylationrestriction mutants", Proceedings of the National Academy of Sciences 87(12): pp 4645-4649 37 Hanif M (2004), "Characterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of fungi" 38 Hartingsveldt W., Mattern I E., Zeijl C M., Pouwels P H., Hondel C A (1987), "Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG 206(1): pp 71-75 39 He L., Feng J., Lu S., Chen Z., Chen C., He Y., Yi X., Xi L (2016), "Genetic Transformation of Fungi", International Journal of Developmental Biology 83 z 40 Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R (1983), "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid" 41 Hong S.-B., Hong S.-Y., Jo K.-H., Kim Y.-S., Do J.-H., Do J.-Y., Noh S.-B., Yoon H.-H., Chung S.-H (2015), "Taxonomic Characterization and Safety of Nuruk Molds Used Industrially in Korea", The Korean Journal of Mycology 43(3): pp 149-157 42 Houbraken J., Frisvad J C., Samson R A (2011), "Fleming's penicillin producing strain is not Penicillium chrysogenum but P rubens", IMA fungus 2(1): pp 87-95 43 Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K (2010), "Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and agar-plate culture", Journal of Bioscience and Bioengineering 109(3): pp 267-273 44 Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U (2007), "An efficient fungal RNAsilencing system using the DsRed reporter gene", Applied and Environmental Microbiology 73(3): pp 962-970 45 Jørgensen T R., Nielsen K F., Arentshorst M., Park J., van den Hondel C A., Frisvad J C., Ram A F (2011), "Submerged conidiation and product formation by Aspergillus niger at low specific growth rates are affected in aerial developmental mutants", Applied and Environmental Microbiology 77(15): pp 5270-5277 46 Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M (2003), "Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67(12): pp 2661-2663 47 Kandušer M., Miklavčič D., Electroporation in biological cell and tissue: an overview, in Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials 2009, Springer p 1-37 84 z 48 Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E M (2012), "NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal sporulation, not hyphal growth or pathogenesis", FEMS Microbiology letters 329(2): pp 138-145 49 Kitamoto K (2015), "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 79(6): pp 863-869 50 Kitamoto K (2002), "Molecular biology of the Koji molds", Advances in applied Microbiology 51: pp 129-154 51 Kochupurakkal B S., Iglehart J D (2013), "Nourseothricin N-acetyl transferase: a positive selection marker for mammalian cells", PloS one 8(7): pp e68509 52 Koo J., Kim Y., Kim J., Yeom M., Lee I C., Nam H G (2007), "A GUS/luciferase fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity with luciferin-dependent control of the reporter protein stability", Plant and cell physiology 48(8): pp 1121-1131 53 Kredics L., Varga J., Antal Z., Samson R A., Kocsubé S., Narendran V., Bhaskar M., Manoharan C., Vágvölgyi C., Manikandan P (2008), "Black aspergilli in tropical infections", Reviews in Medical Microbiology 19(3): pp 65-78 54 Krügel H., Fiedler G., Smith C., Baumberg S (1993), "Sequence and transcriptional analysis of the nourseothricin acetyltransferase-encoding gene nat1 from Streptomyces noursei", Gene 127(1): pp 127-131 55 Lazo G R., Stein P A., Ludwig R A (1991), "A DNA transformation– competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium", Nature Biotechnology 9(10): pp 963-967 56 Leal Jr S M., Cowden S., Hsia Y.-C., Ghannoum M A., Momany M., Pearlman E (2010), "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of Aspergillus fumigatus keratitis", PLoS Pathog 6(7): pp e1000976 85 z 57 Lee L.-Y., Gelvin S B (2008), "T-DNA binary vectors and systems", Plant Physiology 146(2): pp 325-332 58 Lin K., Wang A (2001), "UV mutagenesis in Escherichia coli K-12: Cell survival and mutation frequency of the chromosomal genes lacZ, rpoB, ompF, and ampA", J Exp Microbiol Immunol 1: pp 32-46 59 Liu Z., Friesen T L (2012), "Polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation in filamentous fungal pathogens", Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols: pp 365-375 60 Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T., Redman R., Rollins J., Wolpert T., Johnson K., Rodriguez R., Dickman M (2001), "Green fluorescent protein is lighting up fungal biology", Applied and Environmental Microbiology 67(5): pp 1987-1994 61 Lu X., Sun J., Nimtz M., Wissing J., Zeng A.-P., Rinas U (2010), "The intraand extracellular proteome of Aspergillus niger growing on defined medium with xylose or maltose as carbon substrate", Microbial Cell Factories 9(1): pp 23 62 Machida M., Asai K., Sano M., Tanaka T., Kumagai T., Terai G., Kusumoto K.I., Arima T., Akita O., Kashiwagi Y (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature 438(7071): pp 1157-1161 63 Machida M., Yamada O., Gomi K (2008), "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future", DNA research 15(4): pp 173-183 64 Maeda K., Kosaka H., Yagishita K., Umezawa H (1956), "A new antibiotic, phleomycin", The Journal of antibiotics 9(2): pp 82-85 65 Mathur J., Koncz C (1998), "PEG-mediated protoplast transformation with naked DNA", Arabidopsis Protocols: pp 267-276 66 Mattern I E., Unkles S., Kinghorn J R., Pouwels P H., Hondel C A (1987), "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG 210(3): pp 460-461 86 z 67 McClenny N (2005), "Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach", Medical Mycology 43(sup1): pp 125-128 68 Michielse C., Ram A., Hooykaas P., Van den Hondel C (2004), "Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori", Fungal Genetics and Biology 41(5): pp 571-578 69 Michielse C B., Hooykaas P J., Van Den Hondel C A., Ram A F (2008), "Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori", Nature protocols 3(10): pp 1671-1678 70 Michielse C B., Hooykaas P J., van den Hondel C A., Ram A F (2005), "Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi", Current Genetics 48(1): pp 1-17 71 Mikkelsen L., Sarrocco S., Lübeck M., Jensen D F (2003), "Expression of the red fluorescent protein DsRed-Express in filamentous ascomycete fungi", FEMS Microbiology Letters 223(1): pp 135-139 72 Mohammadhassan R., Kashefi B., Delcheh K S (2014), "Agrobacterium-based vectors: a review" 73 Moore M M (2009), "Genetic engineering of fungal cells", Biotechnology, Fundamentals in Biotechnology 3: pp 36-66 74 Mullins E D., Chen X., Romaine P., Raina R., Geiser D., Kang S (2001), "Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer", Phytopathology 91(2): pp 173-180 75 Murphy M., Wilson Y M., Butler C., Genetic Marker Mice and Their Use in Understanding Learning and Memory, in Functional Brain Mapping and the Endeavor to Understand the Working Brain 2013, InTech 76 Nahalkova J., Fatehi J (2003), "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel reporter in Fusarium oxysporum f sp lycopersici", FEMS Microbiology letters 225(2): pp 305-309 87 z 77 Nguyen K T., Ho Q N., Do L T B X., Mai L T D., Pham D.-N., Tran H T T., Le D H., Nguyen H Q., Tran V.-T (2017), "A new and efficient approach for construction of uridine/uracil auxotrophic mutants in the filamentous fungus Aspergillus oryzae using Agrobacterium tumefaciensmediated transformation", World Journal of Microbiology and Biotechnology 33(6): pp 107 78 Nguyen K T., Ho Q N., Pham T H., Phan T.-N., Tran V.-T (2016), "The construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus oryzae", World Journal of Microbiology and Biotechnology 32(12): pp 204 79 Nielsen M L., De Jongh W A., Meijer S L., Nielsen J., Mortensen U H (2007), "Transient marker system for iterative gene targeting of a prototrophic fungus", Applied and environmental microbiology 73(22): pp 7240-7245 80 Nyilasi I., Ács K., Papp T., Nagy E., Vágvölgyi C (2005), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Mucor circinelloides", Folia microbiologica 50(5): pp 415-420 81 Özyiğit İ İ., Agrobacterium tumefaciens and its use in plant Biotechnology, in Crop Production for Agricultural Improvement 2012, Springer p 317-361 82 Pel H J., de Winde J H., Archer D B., Dyer P S., Hofmann G., Schaap P J., Turner G., de Vries R P., Albang R., Albermann K (2007), "Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88", Nature Biotechnology 25(2): pp 221-231 83 PlTTENGBR R., WOLFE E., Hoehn M., MARKS P N., Daily W., McGuire J (1953), "Hygromycin I Preliminary studies on the production and biologic activity of a new antibiotic", Antibiotics & Chemotherapy 3(12): pp 126878 84 Polaina J., MacCabe A P (2007), Industrial enzymes, Springer 88 z 85 Prendergast F G., Mann K G (1978), "Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea", Biochemistry 17(17): pp 3448-3453 86 Punt P J., van den Hondel C A (1992), " Transformation of filamentous fungi based on hygromycin b and phleomycin resistance markers", Methods in enzymology 216: pp 447-457 87 Rokas A., Payne G., Fedorova N., Baker S., Machida M., Yu J., Georgianna D R., Dean R A., Bhatnagar D., Cleveland T (2007), "What can comparative genomics tell us about species concepts in the genus Aspergillus?", Studies in Mycology 59: pp 11-17 88 Ruijter G., Kubicek C., Visser J., Production of organic acids by fungi, in Industrial Applications 2002, Springer p 213-230 89 Ruiter-Jacobs Y M., Broekhuijsen M., Unkles S E., Campbell E I., Kinghorn J R., Contreras R., Pouwels P H., Hondell C A (1989), "A gene transfer system based on the homologous pyrG gene and efficient expression of bacterial genes in Aspergillus oryzae", Current Genetics 16(3): pp 159-163 90 Ruiz‐Díez B (2002), "Strategies for the transformation of filamentous fungi", Journal of applied Microbiology 92(2): pp 189-195 91 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory press 92 Samson R A., Hong S., Peterson S., Frisvad J C., Varga J (2007), "Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya", Studies in Mycology 59: pp 147-203 93 Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J., Van Dijck P (2002), "On the safety of Aspergillus niger–a review", Applied Microbiology and Biotechnology 59(4-5): pp 426-435 94 Sharan R (2007), "Analysis of Biological Networks: Transcriptional NetworksPromoter Sequence Analysis", Lecture 11: pp 1-15 89 z 95 Siedenberg D., Mestric S., Ganzlin M., Schmidt M., Punt P J., van den Hondel C A., Rinas U (1999), "GlaA Promoter Controlled Production of a Mutant Green Fluorescent Protein (S65T) by Recombinant Aspergillus niger during Growth on Defined Medium in Batch and Fed‐Batch Cultures", Biotechnology progress 15(1): pp 43-50 96 Sugui J A., Chang Y C., Kwon-Chung K (2005), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption", Applied and Environmental Microbiology 71(4): pp 1798-1802 97 Suzuki S., Tada S., Fukuoka M., Taketani H., Tsukakoshi Y., Matsushita M., Oda K., Kusumoto K.-I., Kashiwagi Y., Sugiyama M (2009), "A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae", Biochemical and biophysical research communications 383(1): pp 42-47 98 Te Biesebeke R., Record E., Van Biezen N., Heerikhuisen M., Franken A., Punt P., Van Den Hondel C (2005), "Branching mutants of Aspergillus oryzae with improved amylase and protease production on solid substrates", Applied Microbiology and Biotechnology 69(1): pp 44 99 Utermark J., Karlovsky P., Genetic transformation of filamentous fungi by Agrobacterium tumefaciens Protocol Exchange 2008 100 Varga J., Frisvad J C., Samson R (2011), "Two new aflatoxin producing species, and an overview of Aspergillus section Flavi", Studies in Mycology 69: pp 57-80 101 Wasylnka J A., Moore M M (2002), "Uptake of Aspergillus fumigatus conidia by phagocytic and nonphagocytic cells in vitro: quantitation using strains expressing green fluorescent protein", Infection and Immunity 70(6): pp 3156-3163 102 Wyss M., Pasamontes L., Rémy R., Kohler J., Kusznir E., Gadient M., Müller F., van Loon A P (1998), "Comparison of the Thermostability Properties of 90 z Three Acid Phosphatases from Molds: Aspergillus fumigatusPhytase, A niger Phytase, and A nigerpH 2.5 Acid Phosphatase", Applied and environmental microbiology 64(11): pp 4446-4451 103 Xu C., Zhang X., Qian Y., Chen X., Liu R., Zeng G., Zhao H., Fang W (2014), "A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii", PloS one 9(9): pp e107657 104 Xu Y (1990), "Advances in the soy sauce industry in China", Journal of fermentation and Bioengineering 70(6): pp 434-439 105 Zhong Y., Yu H., Wang X., Lu Y., Wang T (2011), "Towards a novel efficient T-DNA-based mutagenesis and screening system using green fluorescent protein as a vital reporter in the industrially important fungus Trichoderma reesei", Molecular Biology reports 38(6): pp 4145-4151 106 Zhu L., Maruyama J.-i., Kitamoto K (2013), "Further enhanced production of heterologous proteins by double-gene disruption (ΔAosedD ΔAovps10) in a hyper-producing mutant of Aspergillus oryzae", Applied Microbiology and Biotechnology 97(14): pp 6347-6357 107 Zupan J., Muth T R., Draper O., Zambryski P (2000), "The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights", The Plant Journal 23(1): pp 11-28 91 z PHỤ LỤC Các công trình cơng bố có liên quan đến luận văn Hồ Ngọc Quỳnh, Nguyễn Thị Khuyến, Trần Thị Phƣơng, Trần Văn Tuấn, 2017, "Biểu gen mã hóa protein huỳnh quang GFP DsRed chủng nấm sợi Aspergillus oryzae VS1 sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" Tạp chí Sinh học, 31(2), pp 212-222 92 z ... Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA... Aspergillus sử dụng vi khuẩn A tumefaciens marker trợ dƣỡng, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo số vector nhị thể dùng cho chuyển gene nấm sợi Aspergillus vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? ?? với nội... .41 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 43 2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens .44 2.2.7 Sàng lọc thể chuyển gen 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN