Đồ án tốt nghiệp khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym beta galactosidaza từ vi khuẩn sphingomonas paucimobilis bk16

LỜI MỞ ĐẦU Sữa thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giúp cho hấp thụ phospho canxi cao, có tính kháng thể mạnh, tốt cho trẻ em người già Lactoza disccarit chiếm chủ yếu thành phần sữa Sự có mặt lactoza trình chế biến thực phẩm đơi khơng có lợi, gây sẫm màu tạo mùi không mong muốn sản phẩm gia nhiệt, làm ảnh hưởng tới chất lượng cảm quan tái kết tinh chúng Sau dùng sữa, lactoza enzym -galactosidaza ruột non người phân giải thành glucoza galactoza Tuy nhiên lực tổng hợp enzym người bị dần qua tuổi cai sữa Kết đại đa số người trưởng thành người già giới mắc bệnh thiểu chuyển hóa lactoza Nghĩa là, người sử dụng nhiều sữa có triệu chứng đầy hơi, chướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, buồn nơn Vì hướng giải đặt là:  Phát triển sản phẩm sữa có hàm lượng lactoza giảm để người mắc bệnh thiểu chuyển hóa lactoza sử dụng  Dùng trực tiếp chế phẩm enzym dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt độ enzym -galactosidaza ruột non Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza galactoza dùng axit enzym -galactosidaza Việc thuỷ phân axit dẫn đến số bất lợi hao mịn thiết bị, nhiễm mơi trường, gây khó khăn cho việc đảm bảo an tồn thực phẩm mà phương pháp enzym hồn tồn khắc phục Ngồi ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm, tiềm ứng dụng enzym -galactosidaza lĩnh vực nghiên cứu bản, sinh học phân tử kỹ nghệ protein (làm gen thông báo, thị, phân tử cảm biến ), sản xuất dược phẩm y học lớn Chính vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất chế phẩm enzym -galactosidaza cần thiết, công nghiệp chế biến sữa Đề tài “Khảo sát đặc tính khả thu nhận enzym -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16” nhằm mục đích sau:  Khảo sát đặc tính sinh enzym chủng S paucimobilis BK16  Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzym -galactosidaza chủng S paucimobilis BK16  Xác định số đặc tính enzym -galactosidaza thu từ chủng S paucimobilis BK16  Nghiên cứu khả thu enzym kỹ thuật PHẦN I TỔNG QUAN I.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYM -GALACTOSIDAZA: Enzym -galactosidaza enzym xúc tác cho trình thuỷ phân chuyển hóa gốc -D-galactozyl, có thủy phân lactoza thành glucoza galactoza [6] Enym -galactosidaza có nhiều tổ chức bao gồm vi sinh vật, thực vật động vật Các enzym ứng dụng nhiều trình công nghệ sinh học, đặc biệt enzym từ vi sinh vật sử dụng để thủy phân lactoza nhằm làm tăng khả tiêu hóa sữa để cải thiện đặc tính chức sản phẩm từ sữa Phản ứng chuyển hoá galactozyl thường sử dụng để tạo galacto-oligosaccrit nhằm cải biến mặt chức cấu trúc nguyên liệu thực phẩm, dược phẩm hợp chất có hoạt tính sinh học khác [6] Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu enzym galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phương pháp tách chiết, tinh chế ứng dụng nhiều lĩnh vực khác công nghiệp thực phẩm, y học dược phẩm lĩnh vực nghiên cứu Mặc dù vậy, nước ta, việc nghiên cứu enzym bước đầu ứng dụng chúng đề cập đến I.1.1 Vi sinh vật có khả tổng hợp -galactosidaza : Hiện nhà nghiên cứu tìm nhiều chủng loại vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym -galactosidaza với hoạt lực cao Enzym tổng hợp dạng ngoại bào (tiết ngồi mơi trường) nội bào (tích tụ tế bào, dạng tự dạng liên kết với màng, với plasma lyzosome tế bào…) [6] Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả tổng hợp enzym -galactosidaza: 32 NẤM Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces MEN lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis… NẤM MỐC Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae, Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum canescens, Rhizopus acidus, R.niveus,… Vi khuÈn gram ©m: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie, A.formicans, VI KHUẨN Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae, Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris,… Vi khuÈn gram d¬ng: Bacillus acidocaldarius, B.circulans, B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira,… I.2 Đặc tính enzym -galactosidaza từ vi sinh vật: Khối lượng phân tử enzym dao động từ 19.000 đến 630.000 Dalton Cấu trúc phân tử enzym bao gồm nhiều loại khác từ monomer (enzym từ Kluyveromces lactic) đến octamer (enzym từ E.coli) [4] Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử loại enzym khác Các enzym -galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ưu thuộc vùng trung tính, hầu hết enzym -galactosidaza từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có số chủng đạt tới pH tối ưu pH=2 [15] Một số enzym -galactosidaza từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt ion hố trị ion hố trị 2, ví dụ enzym -galactosidaza từ S rectivirgula cần phải có mặt nhiều ion kim loại hoá trị để đạt đến độ bền nhiệt hoạt tính tối đa Tuy nhiên số enzym -galactosidaza khác lại khơng cần có mặt ion kim loại enzym từ Rhizobium melioti [15] Những điểm cho ta thấy tính đa dạng enzym -galactosidaza vi sinh vật I.2 CÁC NGUỒN ENZYM -GALACTOSIDAZA: 33 Mặc dù nhiều enzym -galactosidaza từ vi sinh vật biết đến có số vi sinh vật lựa chọn làm nguồn sinh enzym công nghiệp Hầu hết vi sinh vật có nguồn gốc từ nấm mốc Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger A.oryzae từ vi khuẩn E.coli Những lồi vi sinh vật lựa chọn chúng tạo enzym -galactosidaza với giá rẻ an toàn cho thêm vào thực phẩm [5] Enzym từ vi sinh vật, thực vật ứng dụng rộng rãi trình công nghệ sinh học I.2.1 Enzym từ vi khuẩn: Vi khuẩn E.coli đối tượng nghiên cứu Cấu trúc bậc ba enzym từ E.coli chế điều hoà phiên mã gen lacZ khẳng định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ chế xúc tác enzym Mặc dù vậy, việc sử dụng enzym vào trình sinh học kiểm nghiệm quy mơ phịng thí nghiệm vi khuẩn khơng phép có mặt sản phẩm thực phẩm Lĩnh vực chủ yếu enzym từ vi khuẩn E.coli nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ nghệ hóa miễn dịch Enzym -galactosidaza từ Steptcoccus thermophilus – vi khuẩn sử dụng công nghệ chế biến sản phẩm lên men từ sữa sử dụng để thủy phân lactoza sữa quy mơ cơng nghiệp tính bền nhiệt độ an toàn sử dụng dạng phụ gia sản phẩm Nó dùng làm chất xúc tác cho trình sản xuất galacto-oligosaccarit từ lactoza hoạt tính chuyển hóa galactozyl cao Đối với vi khuẩn chúng phát triển tối ưu dải pH từ 6,5 đến 7,5 Chúng phát triển pH 8,5 [5] I.2.2 Ezym từ nấm mốc: Enzym từ nấm mốc Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger A.oryae sử dụng công nghiệp chế biến sữa sản phẩm từ sữa 34 Đặc biệt enzym từ A.orytococcuss laurentii Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển hóa galactozyl cao dùng để sản xuất galatooligosaccarit từ lactoza Nấm mốc phát triển tối ưu phạm vi pH từ đến 7, chúng phát triển dải pH từ đến 8,5 [6] I.2.3 Enzym từ thực vật – bina: Các nhà khoa học tách chiết tinh chế enzym -galactosidaza từ bina Enzym -galactosidaza tách từ nguồn thực vật có khả thủy phân loại chất khác tốc độ khác Cụ thể thủy phân lactoza với tốc độ 2% so với thủy phân p-nitrophenyl--galactozit Monogalactozyldiglyxerit hấp thụ vào celit bị thủy phân galactosidaza tốc độ nhỏ 250 lần so với thủy phân p-nitrophenyl-galactozit [8] I.3 MỘT SỐ CƠ CHẾ CỦA CÁC PHẢN ỨNG ĐƯỢC XÚC TÁC BỞI ENZYM -GALACTOSIDAZA : I.3.1 Cơ chế động học phản ứng với ONPG: Cơ chế động học phản ứng với xúc tác enzym -galactosidaza từ Escerichia coli thể đơn giản phản ứng với 2nitrophenyl--D-galatopyranozit (ONPG) ONPG chất tổng hợp aglycon đóng vai trị nhóm chuyển dời ONPG (được ký hiệu S) gắn với enzym để hình thành phức chất Michaelis ES (bước a) 2-nitrophenolat nhanh chóng giải phóng để tạo thành hợp chất trung gian enzym-galatozyl (bước b), phần hợp chất thuỷ phân (bước c) phần cịn lại chuyển hố galatozyl (g,h) Đối với phản ứng thuỷ phân phân tử H2O phản ứng với hợp chất trung gian enzym galatozyl để tạo galatoza enzym dạng tự (bước c) Đối với phản ứng chuyển hố galatozyl, chất nhận galatozil (kí hiệu Nu) có mặt hỗn hợp phản ứng gắn vào vị trí glucoza enzym để tạo thành phức chất gồm cấu tử (bước g), sau tạo thành sản phẩm phụ Gal-Nu (bước h) Trong phản ứng chuyển hoá galatozil, nồng độ chất nhận tăng tỷ 35 lệ 2-nitrophenol giải phóng tăng, giảm không đổi tùy thuộc vào chất chất nhận số Michaelis (k2, k3 k6) Kí hiệu: E: enzym Gal: galactoza S: chất Glu: glucoza NP: 2-nitrophenol Nu: chất nhận galactozyl I.3.2 Cơ chế động học phản ứng với lactoza: Cơ chế động học phản ứng với lactoza (một chất tự nhiên) khác so với phản ứng với ONPG (hình 1) Bước (b) thay bước (d, e) (f) glucoza (sản phẩm q trình thuỷ phân lactoza) có lực vị trí glucozyl enzym này, glucoza giải phóng kết hợp ngược lại để hình thành phức chất gồm cấu tử sau phản ứng với galactoza để tạo allolactoza Trong suốt trình thủy phân lactoza, allactoza hình thành tạm thời chất enzym Khi nồng độ lactoza tham gia phản ứng cao, lactoza đóng vai trị chất nhận lactozyl (Nu) sản phẩm chuyển hoá lactozyllactoza Ngược lại, galactozyllactoza đóng vai trị làm chất nhận galactozyl để tạo 36 tetrasaccarit Bằng cách này, hỗn hợp oligosaccarid bao gồm di-, tri- saccarit cao hình thành từ lactoza I.3.3 Cơ chế thuỷ phân lactoza -galactosidaza có pH trung tính: Nhóm sulfhydryl nằm vị trí hoạt hóa -galactosidaza đóng vai trị làm axit chung để proton hố nguyên tử oxy liên kết galactozyt, nhóm imidazol đóng vai trị làm nhóm nhân cơng vào vị trí C-1 glycon Phản ứng dẫn đến hình thành phức chất trung gian enzymgalactozyl nhờ liên kết đồng hóa trị Galatoza sau tách khỏi enzym nhờ hấp thụ proton từ nước anion sulfhydryl đóng vai trị bazơ giúp cho nhóm OH cơng vào vị trí C-1 (hình bên) Hình 2: Cơ chế thuỷ phân lactoza -galactosidaza có pH trung tính 37 38 I.4 SỰ ĐIỀU HOÀ SINH TỔNG HỢP ENZYM -GALACTOSIDAZA CỦA VI SINH VẬT : Trong điều kiện tự nhiên, vi sinh vật tạo sản phẩm vừa đủ mức cần thiết cho hoạt động sống, sinh sản phát triển chúng Vận tốc sinh tổng hợp enzym điều chỉnh phần máy di truyền, phần yếu tố môi trường bên định Sự tổng hợp enzym tế bào sống tăng cường (kích thích) bị kìm chế (trấn áp) Sự tăng cường sinh tổng hợp enzym nhóm enzym tham gia vào việc xúc tác trình phản ứng ảnh hưởng hợp chất hóa học (mà thường chất phản ứng) gọi phản ứng sinh tổng hợp Chất gây nên cảm ứng sinh tổng hợp (gây nên gia tăng enzym đó) gọi chất cảm ứng (yếu tố cảm ứng), enzym tạo thành chế cảm ứng gọi enzym cảm ứng Chất gây kìm hãm sinh tổng hợp enzym gọi chất kìm toả phụ, enzym bị kìm hãm khơng tổng hợp gọi enzym bị kìm toả Sự tạo thành enzym dị hoá (enzym xúc tác phân giải chất) điều chỉnh chế cảm ứng sinh tổng hợp Một ví dụ điển hình chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu cặn kẽ tổng hợp enzym -galactosidaza cần để sử dụng lactoza tế bào E.coli Các tế bào E.coli nguyên thuỷ sinh trưởng nhiều chất chứa lượng nhỏ -galactosidaza Nếu cho thêm vào môi trường lactoza hay galactosidaza khác trong thời gian hoạt lực -galactosidaza chúng tăng lên 1.000 lần Trong trường hợp có đến 3% tồn protein tế bào -galactosidaza 39 ...Đề tài ? ?Khảo sát đặc tính khả thu nhận enzym  -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16? ?? nhằm mục đích sau:  Khảo sát đặc tính sinh enzym chủng S paucimobilis BK16  Nghiên... octamer (enzym từ E.coli) [4] Tuỳ thu? ??c vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử loại enzym khác Các enzym  -galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ưu thu? ??c vùng trung tính, hầu hết enzym. .. trình sinh tổng hợp enzym  -galactosidaza chủng S paucimobilis BK16  Xác định số đặc tính enzym  -galactosidaza thu từ chủng S paucimobilis BK16  Nghiên cứu khả thu enzym kỹ thu? ??t PHẦN I TỔNG