Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 14 NẤM Colletotrichum acutatum GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH TẠI TỈNH KON TUM Identification of Colletotrichum acutatum Causing Anthracnose Dise[.]
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 NẤM Colletotrichum acutatum GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH TẠI TỈNH KON TUM Identification of Colletotrichum acutatum Causing Anthracnose Disease on Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in Kon Tum Province Mai Văn Quân, Ngô Quang Huy, Lê Quang Mẫn, Nguyễn Văn Liêm, Trịnh Xuân Hoạt Viện Bảo vệ thực vật Ngày nhận bài: 29.11.2019 Ngày chấp nhận: 12.12.2019 Abstract The objective of this study was to identify the pathogenicity of Colletotrichum acutatum isolated from the infected-Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) growing in Tu Mo Rong district, Kon Tum province The morphological characteristics of the isolates indicated that they belong to Colletotrichum acutatum The obtained isolates were used for inoculation experiment and the results showed that the inoculated Vietnamese ginseng seedlings show symptoms similar with that of the disease in the field condition Pathogen was re-isolated from the inoculated seedlings and are identical with C acutatum fungus PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 amplified DNA fragments of approximate 700 bp from all isolates The DNA sequencing and phylogenetic analysis based on ITS region confirmed that C acutatum is the causal agent of anthracnose disease on Vietnamese ginseng Study on the biological characteristics of C acutatum using medium plate culture method, effects of various culture conditions on mycelium growth, sporulation of the fungus was carried out The growth of mycelium of C acutatum cultured on PDA medium was the fastest with the production of conidia and fungal spores The optimum temperature for mycelial growth and sporulation of C acutatum was 20 28oC on PDA medium The optium pH conditions for mycelium growth was pH6.0 and 20 - 25oC Keywords: Colletotrichum acutatum, Vietnamese gingseng, Panax vietnamensis Ha et Grush ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Colletotrichum acutatum loại nấm phát triển gây hại quan trọng nhiều loại trồng vùng ôn đới nhiệt đới giới Bệnh gây hại dâu tây (Fragaria ananassa), cà chua (Lycopersicon esculentum) táo (Malus pumila), cà phê (Coffea arabica), ổi (Psidium guajava), ô liu (Olea europea) Nấm gây hại thân, rễ làm cho bị vàng, héo, vết bệnh có màu nâu sẫm Tại Việt Nam, chưa có tài liệu cơng bố nấm Colletotrichum acutatum gây hại trồng Từ năm 2016-2018, bệnh thán thư phát sinh gây hại mạnh Sâm Ngoc Linh vùng trồng Tu Mơ Rông- Kon Tum Bệnh thường xuất vào đầu mùa mưa từ tháng 68 hàng năm, số vườn trồng Sâm Ngọc Linh có tỷ lệ bệnh gây hại lên tới 70% Các nghiên cứu tác nhân gây bệnh, đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh phát triển số biện pháp phòng trừ bệnh thán thư nấm C 14 acutatum gây Viện Bảo vệ thực vật thực Bài báo số kết nghiên cứu nấm C acutatum gây bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Kon Tum VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu Sâm Ngọc Linh có triệu chứng bị bệnh thán thư thu thập vùng trồng Sâm Ngọc Linh Tu Mơ Rông – Kon Tum từ năm 2018 đến 2019 Môi trường phân lập nghiên cứu nấm bao gồm: môi trường thạch agar (Water Agar-WA), môi trường Yeast Manitol Agar (YMA), môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), môi trường cà rốt Agar (CRA) môi trường Czapek Các loại hóa chất nghiên cứu sinh học phân tử phục vụ tách chiết DNA, thực phản ứng PCR tinh sản phẩm PCR Kết nghiên cứu Khoa học 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm thực vùng Sâm Ngọc Linh Tu Mơ Rơng- Kon Tum phịng thí nghiệm mơn Chẩn đốn Giám định dịch hại thiên địch, Viện Bảo vệ thực vật năm 2018-2019 2.3 Phương pháp nghiên cứu Điều tra, thu thập phân lập tác nhân gây bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh thực theo phương pháp điều tra phát bệnh Viện Bảo vệ thực vật, (1997) Các nguồn nấm gây bệnh thán thư sử dụng nghiên cứu phân lập làm đơn bào tử (Ho Ko, 1997): Sử dụng kim khêu nấm gạt nhẹ bề mặt tản nấm có chứa bào tử nấm, hịa lỗng bào tử nấm ml nước cất khử trùng lần Dùng pipet hút 50µl dung dịch bào tử nấm trang đĩa petri có chứa mơi trường WA Để khô bề mặt môi trường, quan sát bào tử nấm kính hiển vi độ phóng đại 40 lần để tách đơn bào tử nấm Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp dung dịch CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) Doyle Doyle (1990) Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)/ITS5 (5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) để xác định nấm Collectotricchum acutatum theo nghiên cứu White cs, (1990) Sản phẩm PCR, sau kiểm tra agarose gel, tinh kit QIAquick PCR Purification (Qiagen, Đức) giải trình tự trực tiếp hai chiều theo phương pháp Sanger Hàn Quốc Các trình tự kết BVTV – Số 1/2020 BLAST so sánh công cụ trực tuyến Ngân hàng Gen (NCBI) Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền trình tự tự xác định dựa mơ hình thay Kimura hai tham số, độ tin cậy nhánh xác định giá trị bootstrap, biểu diễn giá trị %, với 1000 lần lặp lại phần mềm MEGA 6.0 (Tamura cs., 2013) Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm Colletotrichum acutatum (i) môi trường dinh dưỡng nhân tạo gồm PDA, CRA, YMA o Czapek nhiệt độ 25 C; (ii) mức nhiệt độ o 10, 15, 20, 25 30 C môi trường PDA; (iii) mức pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 ngưỡng nhiệt o độ 20 25 C Nguồn nấm Colletotrichum acutatum nghiên cứu làm đơn bào tử Trong thí nghiệm, theo dõi kích thước tản nấm, đặc điểm hình thái khả hình thành bào tử Số liệu thí nghiệm xử ký phần mềm thống kê Statistix 9.0 phần mềm Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh Triệu chứng quan sát ban đầu bị vàng, sau rụng dần theo tầng rời Trên cuống thân vết bệnh kéo dài màu nâu, khô héo, xuất ổ bào tử nấm phận bị bệnh (hình 1A) Gặp điều kiện mưa ẩm kéo dài thân bị thối nhũn Mâm bào tử mọc bề mặt vết bệnh có màu nâu Cuống bào tử ngắn, khơng màu Bào tử đơn bào, thn dài, khơng màu, kích thước bo t 9,25-11,34ì3,16-5,32 àm (hỡnh 1C) Hỡnh Triu chng bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh Tu Mơ Rông- Kon Tum (A): Triệu chứng bệnh gây hại cuống hoa; (B): Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo nấm C acutatum; (C): Đĩa cành bào tử nấm C.acutatum vật kính 40 15 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Phân lập, làm nấm lây nhiễm nhân tạo giống Sâm Ngọc Linh trồng từ hạt tháng tuổi Sau lây nhiễm 8,56 ngày, triệu chứng bệnh thán thư bắt đầu xuất Triệu chứng lây nhiễm tương tự triệu chứng bị bệnh điều kiện sản xuất Lấy mẫu bệnh lây nhiễm phân lập lại mơi trường PDA, hình thái nấm phân lập hồn tốn tương đồng với đặc điểm hình thái nấm phân lập từ bị bệnh (hình 1, bảng 1) Bảng Kết lây nhiễm nhân tạo nấm C acutatum Sâm Ngọc Linh (Tu Mơ Rông, 2019) Số lần lây nhiễm Số lây nhiễm (cây) Số biểu bệnh (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thời gian ủ bệnh (ngày) Lần 30 16 53,33 8,67 Đối chứng lần 30 0 Lần 30 19 63,33 8,56 30 0 Đối chứng lần 3.2 Giám định nấm gây bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh kỹ thuật sinh học phân tử Colletotrichum fuscum (KF498868) Colletotrichum fuscum 99 Colletotrichum higginsianum (MH820156) Colletotrichum higginsianum (MH820154) Colletotrichum destructivum (MG978339) Colletotrichum destructivum (EU070911) Colletotrichum coccodes (AB105970) 94 Colletotrichum coccodes (AY376528) Colletotrichum sublineolum (AJ301978) Glomerella graminicola (AY376539) Colletotrichum trifolii (AJ301941) Colletotrichum trifolii (KJ576854) TT.SNL03 Glomerella acutata (AF411700) 99 Colletotrichum acutatum (AJ749683) Colletotrichum acutatum (AJ749694) Plectosphaerella cucumerina (AF176952) 0.020 Hình Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining (Viện Bảo vệ thực vật, 2019) So sánh 17 trình tự đoạn gen 08 loài nấm khác từ Ngân hàng Gen, mã số Ngân hàng Gen đặt dấu ngoặc đơn Mẫu nấm gây bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh có ký hiệu TT.SNL03 Gốc nhánh giá trị thống kê bootstrap với 1.000 lần lặp (chỉ ghi giá trị lớn 80%) Plectosphaerella cucumerina loài khác với Colletotrichum 16 Kết nghiên cứu Khoa học DNA tách chiết từ nấm C acutatum làm mạch khuôn phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung ITS4/ITS5 để khuếch đại vùng ITS Sản phẩm PCR tất mẫu nấm có kích thước xấp xỉ 700 bp Giải trình tự hai chiều tồn mẫu thu kết đồng Trình tự gen mẫu nấm đại diện ký hiệu TT.SNL03 chọn làm đại diện để so sánh mức độ tương đồng Ngân hàng gen NCBI Trình tự 17 đoạn gen loài nấm thuộc Colletotrihum (C fuscum, C higginsianum, C destructivum, C coccodes, C sublineolum, C graminicola, C trifolii, C acutatum) chọn lựa từ Ngân hàng Gen trình tự gen chủng nấm TT.SNL03 sử dụng để xây dựng phát sinh loài Glomerella acutata giai đoạn giai đoạn sinh sản hữu tính nấm Colletotrichum acutatum Chủng nấm Plectosphaerella cucumerina chọn làm nhóm ngồi (outgroup) (Hình 2) Phân tích phát sinh lồi cho thấy nguồn nấm TT.SNL03 phân lập từ mẫu bệnh thán thư gây hại Sâm Ngọc Linh Kon Tum có gen mã hóa vùng ITS với độ tương đồng cao với nấm C acutatum với giá trị bootstrap 99% Kết khẳng định nấm gây bệnh thán thư BVTV – Số 1/2020 Sâm Ngọc Linh Tu Mơ Rông-Kon Tum Colletotrichum acutatum 3.3 Khả phát triển nấm môi trường dinh dưỡng Nấm C acutatum sinh trưởng phát triển khác loại môi trường dinh dưỡng khác Nấm phát triển tốt môi trường PDA, CRA Czapek Sau ngày, kích thước tản nấm đạt cao mơi trường Czapek với đường kính tản nấm 4,3±0,06 cm Sau ngày ni cấy, kích thước tản nấm đạt giá trị cao môi trường CRA (6,46±0,02 cm), môi trường Czapek (6,38±0,02 cm) Sau ngày ni cấy, kích thước tản nấm đạt phát triển tương đương loại mơi trường PDA, Czapek CRA với đường kính tản nấm dao động từ 8,06±0,02 đến 8,12±0,02 cm (bảng 2) Trên môi trường YMA nấm phát triển nhất, sau ngày kích thước tản nấm đạt 7,82±0,02 cm Tuy nhiên bào tử nấm hình thành mơi trường PDA YMA Trên môi trường CRA Czapek bào tử nấm chưa hình thành sau ngày ni cấy (Bảng 1) Bảng Phát triển nấm C acutatum loại môi trường khác (Viện Bảo vệ thực vật, 2019) Môi trường PDA YMA CRA Czapek P Kích thước tản nấm trung bình (cm) Sau ngày Sau ngày Sau ngày bc b a 3,82 ±0,02 6,14 ±0,04 8,12 ±0,02 c c b 3,72 ±0,02 6,04 ±0,02 7,82 ±0,04 b a a 3,92 ±0,04 6,46 ±0,02 8,06 ±0,02 a a a 4,3 ±0,06 6,38 ±002 8,12 ±0,02