BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN HỮU DŨNG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) TRÊN GIÁ THỂ TẰM DÂU (Bombyx mori L[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN HỮU DŨNG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) TRÊN GIÁ THỂ TẰM DÂU (Bombyx mori L.)” CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI VĂN THẮNG, Hà Nội, 2020 i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đƣợc đồng ý nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, thực luận văn tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)” Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ tận tình cá nhân tập thể Trƣớc tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng, giảng viên trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ngƣời hƣớng dẫn, bảo chu đáo, tận tình suốt q trình tơi thực nghiên cứu đề tài khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn ban lãnh đạo thầy cô giáo giảng dạy Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp dạy bảo, trang bị cho kiến thức quý báu suốt năm học vừa qua Bài luận văn tốt nghiệp dấu mốc quan trọng đánh dấu trƣởng thành kết tổng kết đào tạo học viên Sau học chuyên ngành Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Lâm nghiệp Với nội dung nghiên cứu nỗ lực cố gắng áp dụng đƣợc học đƣa vào thực đề tài Mặc dù cố gắng nhƣng trình độ thời gian có hạn nên luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong thầy bạn đọc đóng góp ý kiến để luận văn tơi đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Hữu Dũng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1.Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.3 Vòng đời chế lây nhiễm Đông trùng hạ thảo vào thể côn trùng 1.1.4 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng 1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.6 Thành phần hóa học nấm Đơng trùng hạ thảo 1.1.7 Giá trị dƣợc liệu nấm Cordyceps militaris 11 1.1.8 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo 13 1.1.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni trồng nấm Cordyceps militari 21 1.2 Giới thiệu tằm dâu 23 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 27 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 27 2.2 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.2 Hoá chất thiết bị 27 iii 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phƣơng pháp gây nhiễm nấm vào giá thể tằm 28 2.4.2 Nghiên cứu thời gian nuôi tối phù hợp cho phát triển hệ sợi tằm 30 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết gây nhiễm nấm vào tằm 34 3.1.1 Gây nhiễm phƣơng pháp tiêm 34 3.1.2 Gây nhiễm phƣơng pháp phun bề mặt 36 3.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm thể nấm 38 3.3 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi trồng đến phát triển thể nấm 42 3.3.1 Ảnh hƣởng độ ẩm phịng ni đến phát triển thể nấm 42 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ phịng ni đến phát triển thể nấm 43 3.3.3 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thời gian chiếu sáng đến phát triển thể nấm 45 3.4 Ảnh hƣởng phƣơng thức nuôi trồng đến phát triển thể nấm 48 3.5 Kết phân tích hoạt chất Adenosine Cordycepin giá thể tằm 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… ……….53 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm ăn lan hệ sợi tằm phƣơng pháp tiêm 35 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm ăn lan hệ sợi tằm phƣơng pháp phun bề mặt 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm thể nấm 40 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng độ ẩm đến phát triển thể nấm 43 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển thể nấm 44 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thời gian chiếu sáng đến phát triển thể nấm 47 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cách gây nhiễm phƣơng thức nuôi đến phát triển thể nấm 49 Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lƣợng Adenosine Cordycepin nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng giá thể tằm nguyên 51 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đơng trùng hạ thảo C militaris ngồi tự nhiên (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC) Hình 1.2 Cơng thức số nucleotid Đông trùng hạ thảo 10 Hình 1.3 Vịng đời tằm dâu 25 Hình 2.1: Lây nhiễm nấm vào tằm phƣơng pháp tiêm A - tiêm dung dịch giống nấm vào phần đầu; B- đặt tằm sau tiêm nằm ngang giấy thấm; Cđặt tằm sau tiêm vào ống nhựa đen 29 Hình 2.2: Lây nhiễm nấm vào tằm phƣơng pháp phun dịch giống nấm lên thân tằm 30 Hình 3.1 Con tằm bị nhiễm với 150 µl dung dịch giống nấm sau 10 ngày gây nhiễm, ni tối, nhiệt độ phịng ni 22OC, độ ẩm 60% A: Con tằm sau gây nhiễm đặt đứng ống nhựa đen; B: Con tằm sau gây nhiễm đặt nằm ngang giấy thấm vô trùng 35 Hình 3.2 Con tằm bị nhiễm với thể tích dung dịch giống nấm khác sau 10 ngày gây nhiễm, ni tối, nhiệt độ phịng ni 22OC, độ ẩm 60% 38 Hình 3.3 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 40 Hình 3.4 Con tằm bị nhiễm nấm ni tối ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.5 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 12 ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 12 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.6 Con tằm bị nhiễm nấm ni tối 15 ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 15 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.7 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện nuôi độ ẩm khác A- độ ẩm 80%; B- độ ẩm 85%; C- độ ẩm 90% D- độ ẩm 95% 43 vi Hình 3.8 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện nhiệt độ nuôi khác A- nhiệt độ phịng ni 18OC; B- nhiệt độ phịng ni 20OC; C- nhiệt độ phịng ni 22OC D- nhiệt độ phịng ni 25OC 45 Hình 3.9 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 47 Hình 3.10 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt nằm ngang giấy thấm sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% A- gây nhiễm nấm cách phun dịch giống nấm bề mặt tằm; B- gây nhiễm nấm cách tiêm dịch giống nấm vào phần đầu tằm 49 Hình 3.11 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt thẳng đứng ống nhựa đen sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 50 Hình 3.12 Nấm đông trùng hạ thảo tằm nguyên tƣơi thu hoạch (A) nấm đông trùng hạ thảo tằm nguyên khô đƣợc sấy phƣơng pháp sấy thăng hoa (B) 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, tình hình gia tăng loại bệnh hiểm nghèo mối lo ngại quốc gia trế giới Các nhà khoa học dày cơng nghiên cứu, tìm liệu pháp hữu hiệu để giải vấn đề Con ngƣời dần chuyển hƣớng từ việc sử dụng loại thuốc đƣợc tổng hợp hóa học sang ƣu tiên sử dụng loại thực phẩm chức năng, loại thuốc có nguồn gốc hữu từ thiên nhiên Và loài nấm dƣợc liệu đối tƣợng đƣợc ý nhiều đa dạng hợp chất sinh học mà chúng chứa sinh khối Từ xƣa, ngƣời biết sử dụng số loại nấm bổ sung phƣơng thuốc cổ truyền để chữa bệnh nhƣ bồi bổ sức khỏe, nhƣ nấm linh chi, nấm lim xanh, nấm tuyết (mộc nhĩ trắng), v.v, đặc biệt nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps loài nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trƣởng thành số lồi trùng Hơn 400 phân lồi nấm thuộc chi Cordyceps tìm thấy mơ tả, nhiên có khoảng 36 lồi đƣợc nuôi trồng điều kiện nhân tạo để sản xuất thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Trong số lồi này, có lồi C militaris đƣợc trồng thành công quy mô lớn có chứa nhiều chất có hoạt chất sinh học (Li et al, 2006) Loài nấm C militaris, phân bố vùng núi có độ cao từ 2.000 - 3.000 m so với mực nƣớc biển, có chứa hàm lƣợng hoạt chất có hoạt tính sinh học thể nhƣ: cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise nhiều thành phần hoạt chất quý khác Nhờ hợp chất sinh học giá trị nên loại nấm C militaris đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều, đặc biệt cơng trình nghiên cứu lâm sàng, nhƣ: nghiên cứu kìm hãm phát triển tế bào ung thƣ máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C et al.,2005), ung thƣ phổi, ung thƣ vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu chứng minh nấm có hiệu chữa trị rối loạn chức gan (Nan J.X et al., 2001), lão hoá, chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngồi cịn có tác dụng kìm hãm oxy hoá lipid, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E and Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005), Nấm có khả trì tốt chức thận, phổi, chống lão hóa, điều hịa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính (Das et al., 2010) Hai loài C militaris C sinensis đƣợc nghiên cứu nhiều nuôi trồng, lên men, chiết xuất sản xuất dƣợc chất; có giá tri dƣợc liệu giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006) Loài C sinensis loại nấm dƣợc liệu có phân bố hạn chế tƣ nhiên đến chƣa có cơng trình báo cáo ni cấy thành cơng nên khan Loài C militaris chứa hợp chất sinh học tƣơng tự nhƣ loài C.sinensis, nhƣng dễ dàng nuôi trồng môi trƣờng nhân tạo (Li et al 1995; Dong et al., 2012) Do giá tri dƣợc liệu, giá trị kinh tế cao nên có nhiều cơng trình nghiên cứu ni trồng lồi nấm C militaris đƣợc công bố áp dụng vào sản xuất Tuy nhiên, hầu hết cơng trình công bố nuôi trồng nấm C militaris môi trƣờng tổng hợp bổ sung bột nhộng tằm, pepton, cao nấm men nuôi cấy ký chủ nhộng tằm Với mong muốn, tạo sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C militaris có chất lƣợng tốt, gần giống với tự nhiên; tiến hành đề tài hiên cứu: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)” 3 Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Trong lịch sử phát triển Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo (nấm ĐTHT) loại thuốc quý đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm trƣớc dùng cho bậc vua chúa Theo đông y Trung Quốc, loại nấm có tác dụng hỗ trợ chữa nhiều bệnh nhƣ bệnh phổi, thận, đổ mồ trộm, đau lƣng, yếu sinh lý v.v Chính vậy, nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc ngƣời Trung Quốc xem nhƣ nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc) Nấm Đơng trùng hạ thảo (cịn gọi Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) loài nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trƣởng thành số lồi trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành số loài nằm dƣới đất mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm sử dụng chất thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh phát triển dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc dính liền vào thân sâu Vì mùa đơng nấm ký sinh trùng, mùa hạ mọc thành thể nấm nên có tên Đơng trùng hạ thảo Để thu hoạch nấm ngƣời ta thƣờng đào lấy xác sâu nấm để làm thuốc Ngày nay, hiệu sử dụng chất dinh dƣỡng nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc khoa học chứng minh Nhiều nhóm nghiên cứu giới nghiên cứu, điều tra thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngồi tự nhiên, ni trồng để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức phục vụ cho ngƣời Cordyceps militaris loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps Lồi đƣợc Carl Linnaeus mơ tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982) 4 Cordyceps chi đa dạng họ Clavicipitaceae số lƣợng loài phổ ký chủ Ƣớc tính có 400 lồi chi (Mains, 1958; Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al., 2005) Nấm C militaris thuộc giới Nấm, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps loài C militaris Tên khoa học Cordyceps militaris (L.) Fr (1818) (Kobayasi, 1982) Nấm Đông trùng hạ thảo C militaris lồi nấm ký sinh sâu bƣớm, thể có màu cam, chiều dài - 10 cm Đầu thể nấm có đốm màu cam sáng, thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng nhộng, mặt cắt ngang thể có màu nhạt, rỗng Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rộng µm Các bào tử nang hình sợi, khơng màu phân đoạn, kích thƣớc 3,5 - – 1,5 µm Các bào tử nang điều kiện ngh o dinh dƣỡng s đứt nảy chồi tạo bào tử thứ cấp Nấm có phân bố rộng, Bắc M , châu Âu châu Á (Paul et al, 2008) Hình 1.1 Đơng trùng hạ thảo C militaris tự nhiên (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC) 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy đƣợc vào mùa hè, vùng núi cao 4.000 m nhƣ cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc Vân Nam, v.v Theo nhà khoa học chi nấm Cordyceps có tới 400 lồi khác nhau, tính riêng Trung Quốc tìm thấy khoảng 60 lồi Đơng trùng hạ thảo Các loài nấm phân bố rộng châu Á với trung tâm đa dạng vùng Đông Á châu Úc Tuy nhiên, ngƣời ta nghiên cứu nhiều loài nấm Cordyceps sinensis Cordyceps militaris có giá trị dƣợc liệu tốt với ngƣời 1.1.3 Vòng đời chế lây nhiễm Đông trùng hạ thảo vào thể côn trùng Vào mùa đơng, bào tử nấm ĐTHT có đất s dính vào bên ngồi sâu hay nhộng lồi bƣớm khác Sau bào tử nấm s nảy mầm thành ống bám Các ống s tiết enzyme kitanase, lipase, protease phá hủy vỏ ngồi ký chủ, xâm nhập vào mơ bên thể Trong thể ký chủ, hệ sợi nấm hút chất dinh dƣỡng phát triển mạnh m chiếm toàn thể, gây chết ký chủ, vỏ cứng lại để bảo vệ sợi nấm Đến mùa hè, hệ sợi nấm s nảy chồi, s làm nứt vỏ kitin sâu, phát triển thành thể Quả thể sinh sản hình thành bào tử túi bào tử Sau túi bào tử nứt ra, bào tử phóng thích mơi trƣờng Đến mùa đơng, trứng trùng nở thành sâu, nhộng, ngẫu nhiên bị bào tử xâm nhập.Vòng đời tiếp tục (Kobayasi et al, 1982; Kamble et al, 2012) Qủa thể nấm C militaris thƣờng có màu vàng nhạt màu da cam (Zheng et al., 2011) 1.1.4 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng Theo Bách khoa tồn thƣ nấm Cordyceps lây nhiễm vào thể sâu đến chƣa rõ nguyên nhân Những sâu ăn phải bào tử nấm chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ lỗ thở Đến sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn chất dinh dƣỡng thể sâu Đến giai đoạn định, nấm phát triển thành thể nấm (hình dạng giống thực vật) phát tán bào tử Nấm xâm nhiễm vào thể trùng gồm giai đoạn chính: (1) Giai đoạn xâm nhập Tính từ bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào xoang thể côn trùng Bào tử nấm sau mọc mầm phát sinh mầm bệnh, giải phóng enzyme ngoại bào tƣơng ứng với thành phần lớp vỏ cuticun côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày nhƣ Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, Naxetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme đƣợc tạo cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác lồi chí loài (Nguyễn Lân Dũng et al., 2006) Enzym protease chitinase hình thành thể trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) lớp biểu bì (thành phần protein) Lipase, cenlulase enzyme khác enzyme có vai trị khơng phần quan trọng Nhƣng quan trọng enzym phân hủy protein (protease) enzyme phân hủy kitin (chitinase) trùng Hai enzyme có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng nấm ký sinh côn trùng (2) Giai đoạn phát triển nấm thể côn trùng côn trùng chết Đây giai đoạn sống ký sinh nấm Trong xoang thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợ nấm đƣợc hình thành thể, phân tán khắp nơi theo dịch máu, phá hủy tế bào máu làm giảm tốc độ lƣu thông máu Toàn phận nội quan bị xâm nhập Nấm thƣờng xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động côn trùng trở nên chậm chạp phản ứng với tác nhân kích thích bên ngồi Kết vật chủ khả kiểm soát hoạt động sống dẫn đến chết (Pramer D., 1965) (3) Giai đoạn sinh trƣởng nấm sau vật chủ chết Ở bên thể côn trùng, sợi nấm sinh trƣởng nhân lên nhanh chóng Một số lồi nấm tiếp tục sinh trƣởng dạng sợi nấm Hệ thống miễn dịch ký chủ côn trùng sử dụng chế thực bào tiết hợp chất đối kháng (nhƣ quinine melanine) Đầu tiên, thể côn trùng phải xác định thể ngoại lai tạo phản ứng miễn dịch Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển nhanh thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch trùng Hơn nấm cịn tạo dạng độc tố số công cụ cơng khác để giết chết trùng, độc tố công cụ công phá hủy chế kháng ký chủ Hầu hết nấm bất toàn (inperfect fungi) thƣờng tạo độc tố giết chết côn trùng thời gian ngắn nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính Trong giai đoạn đầu độc ký chủ, số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trƣớc gây hại tồn thể trùng thể trùng quan sát thấy sợi nấm (Trần Ngọc Lân, 2008) 1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Bảng 1.1 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Giới Nấm Nấm Ngành Ascomycota Ascomycota Lớp Ascomycestes Sordariomycetes Bộ Hypocreales Hypocreales Chi Cordyceps Cordyceps Loài Sinensis militaris Tên khoa học Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Hai loài nấm C sinensis C militaris đƣợc nghiên cứu nhiều nuôi trồng, lên men, chiết xuất sản xuất thực phẩm chức có giá tri dƣợc liệu giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006) Nấm đơng trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay cịn gọi C sinensis) loại nấm dƣợc liệu có phân bố hạn chế tự nhiên đƣợc ni dƣỡng điều kiện hoang dã, lồi nấm chƣa đƣợc nuôi trồng thành công mơi trƣờng nhân tạo, sản lƣợng nấm thu đƣợc không đáp ứng đủ nhu cầu thị trƣờng (Li et al., 2006; Stone 2008; Zhang et al., 2012) Lồi đơng trùng hạ thảo C militaris (thƣờng đƣợc gọi nấm cam sâu bƣớm), chứa hợp chất hóa học tƣơng tự nhƣ C sinensis, nhƣng dễ dàng nuôi trồng môi trƣờng nhân tạo (Li et al., 1995; Dong et al., 2012) Hiện nay, có nhiều nghiên cứu quy trình ni trồng nấm C.militaris nhằm thay cho lồi C sinensis có nhiều nghiên cứu quan trọng gen, nhu cầu dinh dƣỡng, mơi trƣờng ni cấy, đặc tính sinh hóa dƣợc lý nấm C militaris Gần đây, gen hồn chỉnh C militaris đƣợc giải trình tự làm sở cho nhiều nghiên cứu sâu loại nấm (Zheng et al., 2011) Có 400 phân lồi Cordyceps tìm thấy mơ tả, nhiên có khoảng 36 lồi đƣợc ni trồng điều kiện nhân tạo để sản xuất thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Duy lồi C militaris đƣợc trồng quy mơ lớn có dƣợc tính tốt có thời gian sản xuất ngắn (Li et al., 2006) 1.1.6 Thành phần hóa học nấm Đơng trùng hạ thảo Theo số liệu nghiên cứu thành phần hóa học thể nấm C militaris cho thấy loài nấm chứa thành phần nhƣ protein chiếm 40,69%; loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học chất quan trọng (Shih et al., 2007) Acid amin Kết nghiên cứu Hyun (2008) cho thấy thể nấm C militaris có chứa lƣợng acid amin tổng số cao sinh khối nấm (69,32 mg/g thể 14,03 mg/g sinh khối nấm) Khối lƣợng acid amin loại thể sinh khối nấm có chênh lệch, dao động từ 1,15 - 15,06 mg/g (đối với thể) 0,36 - 2,99 mg/g (đối với sinh khối) Thành phần acid amin loại thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), alanine (5,18 mg/g) Số liệu phân tích Chang ctv (2001) cho thấy phần lớn sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001) cid b o Theo kết nghiên Hur (2008) thể nấm C militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, lƣợng acid linoleic chiếm đến 61,3% thể 21,5% sinh khối Lƣợng acid béo no chủ yếu acid palmitic, chiếm 24,5% thể 33,0% sinh khối denosine cordycepin Adenosine cordycepin hai hợp chất có dƣợc tính cao nấm C militaris Adenosine thể chiếm 0,18% sinh khối nấm chiếm 0,06% Hợp chất cordycepin thể có hàm lƣợng cao gấp lần so với sinh khối (Huang et al., 2006) Polysaccharide Các polysaccharide CPS-1 CPS-2 đƣợc tách chiết nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ đơn phân đƣờng monosaccharide: mannose galactose Kết nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide có khả phục hồi tổn thƣơng gan ethanol, tác dụng tăng lên tăng liều dùng chiết xuất Một số monosaccharid có nấm đơng trùng hạ thảo nhƣ rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose… (Yan et al., 2008) - Các nucleotid: Nucleotid thành phần có hoạt tính nấm đơng trùng hạ thảo, hoạt chất adenosin, cordycepin đƣợc sử dụng hoạt chất để đánh giá chất lƣợng đông trùng hạ thảo Ngồi đơng trùng hạ thảo cịn nhiều loại nucleotid khác nhƣ uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc đƣợc đƣa vào hợp chất có hoạt tính 10 antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân bị nhiễm HIV nhƣ didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, hoạt chất chƣa tìm thấy đƣợc dƣợc liệu khác tự nhiên Cơng thức hóa học Cordycepin Cơng thức hóa học Guanosin Cơng thức hóa học Thymidin Cơng thức hóa học Adenosin cơng thức hóa học Cytidin Cơng thức hóa học Uridin Hình 1.2 Cơng thức số nucleotid Đông trùng hạ thảo - Các sterol Các phytosterol nấm đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β sitosterol) đóng vai trị quan trọng điều trị, phịng chống ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt ung thƣ trực tràng (Choi et al., 2007) - Các nhóm hoạt chất khác 11 Đơng trùng hạ thảo có chứa loại acid amin thiết yếu nhƣ acid glutamic, acid aspartic, arginin…và hợp chất kiểu polyamin cadaverin, spermidin, spermin…, cyclodipeptid nhƣ cordycedipeptid A Các hợp chất có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus vi khuẩn Theo kết nghiên cứu Filipa et al., 2013, chiết xuất methanol C militaris đƣợc thử nghiệm tính chất chống oxy hố, kháng khuẩn, chống nấm chống tăng sinh dòng tế bào khối u ngƣời Mannitol (2,01 g / 100 g) trehalose (24,71 g / 100 g) loại đƣờng tự C militaris Các axit béo khơng bão hịa (68,87%) chiếm ƣu axit béo bão hòa (23,40%) δ-tocopherol dạng vitamin E đƣợc phát (55,86 μg / 100 g) Các axit hữu đƣợc tìm thấy nấm axit oxalic, citric fumaric (lần lƣợt 0,33, 7,97 0,13 g / 100 g) Chiết xuất methanol C militaris ức chế lipid peroxidation, làm giảm phát triển gốc tự Chiết xuất cho thấy tính kháng khuẩn chống nấm mạnh Cuối cùng, chất chiết xuất từ C militaris ức chế gia tăng tế bào ung thƣ biểu mô tế bào ung thƣ ngƣời (MCF-7, ung thƣ vú), NCI-H460 (non-small lung), HCT-15 (đại tràng) heLa (cổ tử cung) 1.1.7 Giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris Các hợp chất dƣợc liệu nấm Cordyceps militaris ứng dụng điều tri bệnh nâng cao sức khỏe ngƣời, lồi nấm có giá tri kinh tế cao Nấm Cordyceps militaris khan tự nhiên Vì vậy, việc sản xuất quy mô lớn chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu điều tri bệnh từ Cordyceps militaris vấn đề cấp thiết - C c h p chất chống ung thƣ: Hợp chất cordycepin (3′deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thƣ, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor et al., 2010) 12 - Hoạt tính kh ng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hsCPS2 chứa dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử tạo phức nồng đô (8 mg/ml) 89%, 1,188 85% (Fengyao et al., 2011) - Tăng số lƣ ng tinh trùng: Nghiên cứu lợn cho thấy dùng chế phẩm từ Cordycepsmilitaris, số lƣợng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động hình dạng bình thƣờng tăng Hiệu đƣợc tr ch sau tuần ngƣng sử dụng chế phẩm Lƣợng cordycepin tế bào tăng thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả chất làm tăng lƣợng tinh dịch chất lƣợng tinh trùng lợn (Lin et al., 2007) - Hạn chế virus c m: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng đậu nành nảy mầm có khả ứng dụng điều tri cúm A Chất góp phần điều hịa hoạt động miễn dịch đại thực bào (Yuko et al., 2007) - Kh ng khu n kh ng nấm kh ng ung thƣ: C.militaris protein (CMP) tách chiết từ nấm có kích thƣớc 12kDa, pI 5,1 có hoạt tính khoảng pH 7- Protein ức chế nấm Fusariumoxysporum gây độc tế bào ung thƣ bàng quan (Byung-Tae et al., 2009) Hợp chất cordycepin cho thấy khả kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp chất dẫn xuất từ nấm đƣợc mong đợi ứng dụng việc điều tri bệnh nhiễm khuẩn đƣờng ruột Cordycepin ngăn biểu gen T2D chịu trách nhiệm điều hịa bệnh tiểu đƣờng thơng qua việc ức chế đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, đƣợc hy vọng s ứng dụng đƣợc nhƣ chất điều hòa miễn dịch dùng điều tri bệnh miễn dịch (Seulmee et al., 2009) - Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, xúc tiến việc phân hủy fibrin 13 Enzyme có khả sử dụng điều trị tan huyết khối tƣơng tự nhƣ enzym fibrinolytic mạnh khác nhƣ nattokinase enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme sản xuất quy mơ lớn s làm giải pháp thay hữu hiệu cho enzym fibrinolytic giá thành cao đƣợc sử dụng cho bệnh tim lão hóa ngƣời (Jae-Sung et al., 2006) - Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm nấm, dịch chiết từ thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) đƣợc thử nghiệm tác dụng kiểm sốt lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) interleukin-6 (IL-6) tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào đƣợc xử lý với nồng độ khác CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α IL-6 mức độ giảm theo nồng độ dịch chiết Những kết cho thấy CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất chất trung gian gây viêm tế bào (Wol-Soon et al., 2010) - C c ứng dụng lâm sàng nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis đƣợc sử dụng rộng rãi Cordyceps militaris, nhiên ứng dụng lâm sàng chúng tƣơng tự Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris đƣợc sử dụng trƣờng hợp suy giảm chức phổi, ho có đờm, chóng mặt (Das et al., 2010; Mizuno, 1999) 1.1.8 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.8.1 Trên giới Có nhiều nghiên cứu Đông trùng hạ thảo (C militaris) đƣợc nghiên cứu đăng nhiều tạp chí uy tín Tuy nhiên, điểm giống hầu hết nhà khoa học cho phần dƣợc tính nấm đơng trùng hạ thảo (C militaris) chủ yếu có thể nấm có khơng có thể ký chủ ... trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L. )? ?? 3 Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ. .. nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L. )? ?? Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, ngồi cố gắng nỗ l? ??c thân, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ tận tình cá nhân tập thể. .. 1.1.4 Sự l? ?y nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng 1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.6 Thành phần hóa học nấm Đơng trùng hạ thảo 1.1.7 Giá trị