Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NA[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Vũ Thị Thơm TS Phạm Thế Hải Hà Nội, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên Nguyễn Thị Thu Hà LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập làm luận văn tốt nghiệp, nhận quan tâm giúp đỡ Thầy Cô, nhà trường, quan, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thơm, TS Phạm Thế Hải người Thầy tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Thị Luyến - chủ nhiệm đề tài, ThS Lê Anh Tuấn - nghiên cứu sinh đề tài Nghị định thư hợp tác nghiên cứu Đại học Quốc gia Hà Nội Đại học Liverpool - Vương quốc Anh (Mã số HNQT/SPĐP/01.06), tạo điều kiện để tham gia nghiên cứu, hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, nhà khoa học hội đồng chấm đề cương luận văn tốt nghiệp đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, Thầy Cô Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Các cán Bộ môn Y Dược học sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; bác sĩ nhân viên Bệnh viện Phổi Trung ương tạo điều kiện tốt cho q trình hồn thành luận văn Sự biết ơn gia đình bạn bè ln sát cánh động viên khích lệ tơi Cuối tơi xin gửi lời tri ân tới bệnh nhân tham gia vào nhóm nghiên cứu, đóng góp bệnh nhân giúp tơi có thành cơng Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Thị Thu Hà năm MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lao 1.1.1 Hình thể, cấu trúc 1.1.2 Khả gây bệnh 1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao 1.2 Thuốc điều trị lao lao kháng thuốc 1.2.1 Thuốc điều trị lao phân loại lao kháng thuốc .6 1.2.2 Tính kháng thuốc vi khuẩn lao 1.2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước tính kháng thuốc vi khuẩn lao 1.3 Isoniazid điều trị lao 10 1.3.1 Dược lý chuyển hóa Isoniazid .10 1.3.2 Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid bệnh nhân lao 12 1.4 Đặc điểm gen NAT2 đa hình gen NAT2 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Dụng cụ, trang thiết bị .16 2.1.2 Hóa chất, mơi trường .16 2.2 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu .17 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Cỡ mẫu 17 2.3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm 18 2.3.3 Quy trình ni cấy đờm mơi trường lỏng BACTEC MGIT 18 2.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ cho thuốc chống lao hàng 20 2.3.5 Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid 26 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu .27 2.3.7 Đạo đức nghiên cứu y học .28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Tính kháng thuốc vi khuẩn lao thuốc kháng lao hàng 29 3.1.1 Đặc điểm chung quần thể bệnh nhân nghiên cứu .29 3.1.2 Tình hình kháng thuốc chống lao hàng bệnh nhân lao phổi .32 3.2 Tỷ lệ phân bố kiểu gen NAT2 người bệnh lao mối ảnh hưởng đến tính kháng thuốc Isoniazid 40 3.2.1 Kết tối ưu quy trình phân tích NAT2 .40 3.2.2 Tỷ lệ phân bố kiểu gen NAT2 người bệnh lao 42 3.2.3 Mối liên quan đa hình kiểu gen NAT2 tình hình kháng INH 47 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Nhận định kết nuôi cấy MGIT 19 Bảng 2.2: Nồng độ thuốc ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng môi trường đặc 22 Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1) 23 Bảng 2.4: Đánh giá kết vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc 25 Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc vi khuẩn lao 25 Bảng 2.6: Thành phần tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2 27 Bảng 3.1: Thông tin chung quần thể nghiên cứu 29 Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy đơn vị sinh trưởng vi khuẩn lao .32 Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc nhóm lao lao tái trị 34 Bảng 3.4: Kết kháng sinh đồ với thuốc chống lao hàng .36 Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 nhóm lao lao tái trị 43 Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 nhóm lao lao tái trị 44 Bảng 3.7: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với thể lao 45 Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 vùng giới .46 Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH 48 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: M tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x .3 Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy môi trường đặc [23], [59] .5 Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid gan [39] 11 Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 NST số 14 Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu luân chuyển mẫu bệnh viện 18 Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 19 Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA 21 Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc 24 Hình 3.1: Biểu đồ dinh dưỡng theo BMI hai nhóm bệnh nhân 31 Hình 3.2: Một số hình ảnh kết kháng sinh đồ mơi trường đặc 33 Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng loại .34 Hình 3.4: Kết DNA tổng số tách chiết điện di gel agarose 1,2% .41 Hình 3.5: Kết nhân dịng gen NAT2 số mẫu theo điều kiện tối ưu 41 Hình 3.6: Kết đọc kiểu gen NAT2 42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFB Vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid Fast Bacilli) BMI Chỉ số khối thể (Body Mass Index) EMB Ethambutol INH Isoniazid LJ Lowenstein-Jensen MTB Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) MDR-TB Lao đa kháng thuốc (Multi Drug Resistant Tuberculosis) MDR/RR-TB Lao đa kháng Lao kháng Rifampicin (Multi Drug Resistant - Rifampicin Resistant - Tuberculosis) MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube NAT2 N-Acetyltransferase RMP Rifampicin PZA Pyrazinamid SM Streptomycin SNP Đa hình đơn nucleotit (Single Nucleotide polymorphisms) XDR-TB Lao siêu kháng thuốc (Extensively Drug Resistant-Tuberculosis) WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng phức tạp thời gian điều trị kéo dài Theo thống kê WHO (2018), với nỗ lực không ngừng toàn giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53 triệu người phát điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong lao xuống 37% Mặc dù tập trung kiểm soát, bệnh lao 10 nguyên nhân tử vong hàng đầu nguyên nhân tử vong số bệnh truyền nhiễm (trên HIV) Việt Nam điểm nóng bệnh lao, đứng thứ 14 số 30 nước có gánh nặng cao lao (WHO, 2018) Năm 2017, tổng số trường hợp mắc lao báo cáo Việt Nam 105.733 bệnh nhân số có khoảng 80% bệnh nhân lao phổi mắc tái nhiễm Mặc dù toàn giới, tỷ lệ mắc lao giảm khoảng 2% năm đến bệnh lao vấn đề thách thức phát triển lan rộng lao kháng thuốc Bệnh nhân mang lao kháng thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn Ở Việt Nam theo ước tính trung bình chi phí cho bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao nhiều so với chi phí 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường Theo thống kê WHO, toàn cầu 3,5% trường hợp lao 18% trường hợp lao tái trị có kháng Rifampicin đa kháng Rifampicin Isoniazid (MDR/RR-TB) Ở Việt Nam số ước tính tương ứng 4,1% 17% Tuy nhiên số ước tính có khoảng 32%-67% thực đánh giá tính kháng thuốc với Rifampicin (WHO, 2018) Trong thuốc chống lao hàng một, Rifampicin Isoniazid hai thuốc quan trọng phác đồ điều trị lao cịn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid Trong năm gần đây, tình hình kháng thuốc với loại thuốc quan tâm, báo cáo Việc tập trung vào hai thuốc quan trọng Rifampicin Isoniazid bỏ qua biến động đáng ý tình hình kháng thuốc ba thuốc Theo hướng dẫn WHO Bộ Y tế, Isoniazid dùng hầu hết đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới, lao tái trị kể điều trị dự phịng lao Isoniazid chuyển hóa Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà enzyme NAT2 gan Đa hình di truyền gen NAT2 biết đến có liên quan chặt chẽ tới đáp ứng Isoniazid bệnh nhân mắc lao Nghiên cứu Nam Phi cho thấy > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị tình hình kháng thuốc xảy nghiên cứu khác khẳng định kháng thuốc không tuân thủ điều trị mà khác biệt dược động học thuốc cá thể Mặt khác số nghiên cứu yếu tố di truyền bệnh nhân yếu tố nguy việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật cịn vấn đề khó khăn bệnh viện, kể bệnh viện tuyến Trung ương Chỉ số lượng định bệnh nhân định làm kháng sinh đồ thời gian khoảng 2-3 tháng có kết vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm q trình ni cấy Hiện số test phân tử áp dụng để chẩn đoán nhanh lao kháng thuốc Hain test hay Xpert MTB/RIF Tuy nhiên, xét nghiệm giá thành cao không định rộng rãi Hơn kit thương mại đánh giá lao kháng Rifampicin, Isoniazid chưa đánh giá với thuốc khác thuốc kháng lao hàng Từ thực tiễn chẩn đoán điều trị lao, với mục tiêu xác định tính kháng thuốc thuốc chống lao hàng tiên lượng nguy mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến yếu tố di truyền gen NAT2 bệnh nhân lao phổi, đề xuất đề tài “Khảo sát tính kháng thuốc vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị Isoniazid đánh giá ảnh hƣởng gen NAT2 bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc Isoniazid” Mục tiêu nghiên cứu Xác định tính kháng thuốc vi khuẩn lao với thuốc chống lao hàng bệnh nhân lao phổi; Xác định đa hình di truyền gen NAT2 mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid vi khuẩn lao bệnh nhân lao phổi Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lao 1.1.1 Hình thể, cấu trúc Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, Actinomycetales, phân Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm 169 lồi, đa phần khơng gây bệnh cho người Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho người gọi nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có lồi Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti Trong quan trọng lồi Mycobacterium tuberculosis[64] Mycobacterium gọi trực khuẩn kháng cồn kháng acid, Robert Koch phân lập năm 1882, gọi tắt BK (Bacille de Koch) M tuberculosis trực khuẩn mảnh, cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm Chúng khơng có vỏ, khơng có lơng khơng có nha bào Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành đám nối đầu vào Thành tế bào M tuberculosis chứa lượng nhỏ peptidoglycan, chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, làm cho vi khuẩn lao không nhuộm phương pháp thông thường mà phải nhuộm phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1.1) [15] Hình 1.1: M tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x Khoa Sinh học Khố 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 1.1.2 Khả gây bệnh 1.1.2.1 Độc lực đường lây truyền Trực khuẩn lao khơng có ngoại độc tố nội độc tố Độc lực vi khuẩn lao liên quan đến yếu tố sợi lớp sáp vách tế bào Các chủng lao độc lực có chứa nhiều yếu tố sợi có chất hóa học 6,6’-dimycoly trehalose Yếu tố sợi làm vi khuẩn lao gắn với thành bó làm giảm độc lực Vi khuẩn lao sống sót đại thực bào sau bị thực bào Vi khuẩn lao phát triển đại thực bào, phá vỡ tế bào xâm nhập đại thực bào khác [15] Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hơ hấp Người bị nhiễm lao hít phải giọt đờm (đường kính - μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho, hắt vào khơng khí Các vi khuẩn qua hàng rào thứ thể lại phế nang tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn trường hợp có triệu chứng khơng rõ ràng Vi khuẩn lây nhiễm sang thai nhi đường máu qua tĩnh mạch rốn mẹ bị lao cấp tính qua nước ối chuyển mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo Đơi khi, đường lây khác đường tiêu hóa uống sữa bị bị bệnh M bovis Từ quan bị lao ban đầu, trực khuẩn lao theo đường máu bạch huyết đến quan khác để gây bệnh (lao hạch, lao mang não lao xương) Tuy nhiên, đường truyền bệnh quan trọng với bệnh lao đường hô hấp [11], [15] 1.1.2.2 Cơ chế gây bệnh Bệnh lao loại bệnh nhiễm trùng bên tế bào tiến triển mạn tính Vi khuẩn lao xâm nhập vào phế nang bị đại thực bào tiêu diệt phần Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt tiếp tục nhân lên đại thực bào dần thành nang lao Nếu nang lao vỡ vi khuẩn lao lây nhiễm rộng, sinh sản bệnh lao xuất Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao phản ứng viêm cấp tính nhẹ phổi xuất Sau vi khuẩn lao bị thực bào, người có đáp ứng miễn dịch tế bào đầy đủ, sau - tuần lymphokin sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà chết vi khuẩn lao Cơ thể sinh đáp ứng mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết hình thành u hạt Tiếp theo hoại tử trung tâm, bã đậu hố, xơ hố hình thành sẹo Sau liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao không bị diệt hồn tồn Chúng tồn thể dạng không hoạt động, người nhiễm lao thường biểu test tuberculin (+) khơng có khả lây nhiễm Ở người có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở thành người mắc lao Ngoài yếu tố nguy việc mắc lao như: tuổi trẻ, bệnh kèm đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố địa yếu tố gen [11] 1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao Để chuẩn đốn xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, ni cấy… xét nghiệm ni cấy vi khuẩn lao tiêu chuẩn vàng Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37oC áp suất oxy 100 mmHg Đây lý giải thích lao phổi thể bệnh gặp nhiều Vi khuẩn lao không nuôi môi trường thông thường, phải nuôi môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1.2) a Khuẩn lạc đƣợc phóng đại b Khuẩn lạc LJ Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis ni cấy mơi trƣờng đặc [24], [60] Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Vi khuẩn lao mọc chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 lần môi trường thử nghiệm Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao hình thành khuẩn lạc điển hình Khuẩn lạc dạng R, sần sùi hình hoa lơ Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao mọc thành váng, đám lắng cặn Hiện môi trường thương mại Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) dạng lỏng ni cấy vi khuẩn lao cho kết dương tính sau 3-13 ngày[15] 1.2 Thuốc điều trị lao lao kháng thuốc 1.2.1 Thuốc điều trị lao phân loại lao kháng thuốc Hiện nay, thực tế điều trị, người ta phân loại nhóm thuốc trị bệnh lao, thường gọi “thuốc kháng lao hàng 1” “thuốc kháng lao hàng 2” [18]: Kháng lao hàng gồm: Bao gồm Streptomycin (viết tắt SM hay S), Rifampicin (viết tắt RIF hay RMP hay R ), Isoniazid (INH hay H), Pyrazinamid (PZA hay Z) Ethambutol (EMB hay E) Đây thuốc lựa chọn để điều trị cho bệnh nhân bị lao Kháng lao hàng gồm nhiều thuốc, chia làm nhóm A, B, C, D: Nhóm A gồm thuốc thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolones Levofloxacin, Moxifloxacin, Gatifloxacin Nhóm B thuốc tiêm hàng hai Amikacin, Capreomycin, Kanamycin Nhóm C thuốc hàng hai chủ đạo khác Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide Nhóm D thuốc bổ sung, khơng thuộc nhóm chủ đạo như: Isoniazid liều cao, Pyrazinamide, Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem [18] Đây thuốc dùng bệnh nhân bị kháng với thuốc lao hàng một, hay dùng số trường hợp đặc biệt Các thuốc thường có nhiều tác dụng phụ việc sử dụng thuốc phức tạp thuốc kháng lao hàng Ngoài ra, giá thành thuốc kháng lao hàng hai đắt nhiều Nhận diện nhanh chủng kháng thuốc, đặc biệt chủng kháng RMP INH, tạo điều kiện để áp dụng kịp thời biện pháp điều trị thích hợp; điều vô quan trọng giảm lan truyền chủng kháng thuốc Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Có thể phân loại lao kháng thuốc dựa vào tính kháng loại thuốc chống lao hàng sau[18]: Nếu vi khuẩn kháng loại loại thuốc kháng lao hàng mà Rifampicin gọi kháng loại thuốc Nếu vi khuẩn lao kháng với loại thuốc chống lao hàng khơng kháng Rifampicin gọi kháng nhiều loại thuốc Nếu vi khuẩn kháng Rifampicin, có khơng kháng thêm thuốc khác trừ Isoniazid gọi kháng Rifampicin Vi khuẩn kháng đồng thời với hai thuốc chống lao Isoniazid Rifampicin gọi lao đa kháng thuốc (MDR-TB) Dựa tính kháng thuốc với thuốc chống lao hàng hai để phân loại lao siêu kháng thuốc Lao tiền siêu kháng: Lao đa kháng có kháng thêm với thuốc thuộc nhóm Fluoroquinolone với ba thuốc tiêm hàng hai Capreomycin, Kanamycin, Amikacin Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB): Lao đa kháng có kháng thêm với thuốc thuộc nhóm Fluoroquinolone thuốc ba thuốc tiêm hàng hai (Capreomycin, Kanamycin, Amikacin) Ngồi cịn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị: - Lao người bệnh lao chưa dùng thuốc chống lao dùng thuốc tháng Lao phổi bệnh nhân lao mắc thể lao phổi - Lao tái trị người bệnh lao dùng thuốc chống lao từ tháng trở lên người bệnh điều trị khỏi lao từ lần trước điều trị thất bại trước nhiều nguyên nhân Lao phổi tái trị bệnh nhân lao tái trị mắc thể lao phổi Trong lao tái trị người bệnh tái nhiễm ngoại sinh (chủng vi khuẩn khác với chủng vi khuẩn ban đầu) tái phát (chủng vi khuẩn giống với chủng vi khuẩn ban đầu) [64], [21] 1.2.2 Tính kháng thuốc vi khuẩn lao Kháng thuốc tượng giảm độ nhạy cảm vi khuẩn lao với thuốc điều trị lao in vitro với nồng độ vừa đủ hợp lý vài chủng kiểm tra so với chủng hoang dại chưa tiếp xúc với thuốc điều trị lao [53] Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Kháng thuốc tiên phát kháng thuốc xảy bệnh nhân trước chưa sử dụng liệu pháp điều trị chống lao nào; kháng thuốc thứ phát kháng thuốc sau bệnh nhân lao có tiếp xúc với thuốc Kháng thuốc tự nhiên tính kháng thuốc chủng kiểu dại Ví dụ M.tuberculosis kháng tự nhiên với penicilin [43] Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên khác tùy loại loại thuốc đặc hiệu: Rifampicin 1/108, Isoniazid 1/106, Streptomycin Ethambutol 1/105 Trong trình nhân lên vi khuẩn tính kháng thuốc phát sinh đột biến ngẫu nhiên Khi khơng có mặt thuốc, chủng mẫn cảm phát triển lấn áp chủng có đột biến khác Khi có mặt thuốc tạo thành áp lực chọn lọc chủng đột biến kháng thuốc trở nên ưu và lây lan sang người khác làm cho người bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc từ đầu [43] Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao giống chế kháng kháng sinh loại vi khuẩn khác hạn chế xâm nhập kháng sinh vào bên thành tế bào sản xuất men (enzzyme) để phá hủy kháng sinh che chắn hay làm biến đổi đích tác động kháng sinh làm kháng sinh hiệu lực Ở 70-80% vi khuẩn lao kháng INH người ta nhận thấy có biến đổi gen katG làm giảm hoạt tính men catalase-peroxidase làm giảm tác dụng INH vi khuẩn lao [5] INH khả ức chế tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao mà vi khuẩn lao kháng thuốc Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có chứa đột biến gen rpoB làm cho RMP khả ức chế men RNA-polymeraza vi khuẩn lao Tùy loại thuốc với chế tác động khác có chế kháng thuốc khác Cơ chế kháng số thuốc vi khuẩn lao trình bày hình 1.3 Khoa Sinh học Khố 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao 1.2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước tính kháng thuốc vi khuẩn lao Theo WHO, năm 2014 số lượng ước tính ca nhiễm đa kháng thuốc (MDR/RR-TB) siêu kháng thuốc (XDR-TB) số bệnh nhân nhiễm 480.000, khoảng 25% số chẩn đoán báo cáo Trong năm 2014, ước tính có 190.000 người chết MDR-TB Đến năm 2015, có báo cáo xuất XDR-TB 105 quốc gia; khoảng 9,7% bệnh nhân nhiễm MDR-TB bị XDR-TB Và tính đến năm 2016 ước tính có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB có 153.000 ca báo cáo 130.000 ca điều trị [67] Việt Nam nằm nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc cao giới, xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015) Bên cạnh đó, Việt Nam 20 quốc gia xảy 80% trường hợp nhiễm TB giới Hiện tượng kháng thuốc giám sát từ năm 1978, tỉ lệ giảm dần đến năm 1998 Năm 19961997 Việt Nam tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao tồn cầu WHO cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao 32,5% có Khoa Sinh học Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 2,3% kháng đa thuốc Nghiên cứu năm 2005-2006 tỷ lệ kháng thuốc tiên phát có giảm không đáng kể 30,9%; kháng thuốc thứ phát bệnh nhân lao điều trị 58,9% đặc biệt tỷ lệ đa kháng lao (kháng tiên phát) không giảm 2,7% bệnh nhân lao tái trị 19.3% Vào năm 2006, tỉ lệ kháng thuốc lại tăng 12,52% so với năm 1978 (30,7% 18,18%) Những nghiên cứu đơn lẻ số cá nhân quanh thời điểm cho thấy kết kháng thuốc tương tự [3] Lê Ngọc Hưng cộng (2008) nghiên cứu 193 bệnh nhân lao phổi tái trị Bệnh viện Phổi trung ương cho thấy tỷ lệ kháng đa thuốc 62,9% [8] Chu Thị Mão cộng (2007) tiến hành nghiên cứu bệnh nhân lao phổi cho thấy tỷ lệ lao đa kháng 4% [9] Lê Thị Kim Hoa (2008) nghiên cứu bệnh nhân lao lao tái trị cho thấy tỷ lệ đa kháng lao 8,5% lao tái trị 40,3% [7] Trong năm gần đây, tỉ lệ tính kháng thuốc báo cáo: ví dụ kháng INH 16% - 25%, tỉ lệ MDR-TB 2%-4% bệnh nhân điều trị lần đầu, 17%-18% với bệnh nhân điều trị tái trị Năm 2017, theo WHO, Việt Nam tỷ lệ ước tính lao kháng MDR/RR-TB thể lao 4,1% 17% thể lao tái trị Có thể thấy, tình hình kháng thuốc lao Việt Nam theo dõi, tập trung nhiều vào nhóm vi khuẩn lao đa kháng thuốc 1.3 Isoniazid điều trị lao 1.3.1 Dược lý chuyển hóa Isoniazid Isoniazid (viết tắt INH), hydrazid axit isonicotinic tổng hợp lần Praha năm 1912 đến năm 1952 biết tác dụng INH với vi khuẩn lao Isoniazid có cấu trúc đơn giản chứa vịng pyridine nhóm hydrazide có tác dụng kìm hãm sinh trưởng diệt vi khuẩn lao tế bào Cơ chế tác dụng thuốc thông qua ức chế hình thành axit mycolic có thành tế bào vi khuẩn lao [15] Tuy nhiên, INH phát bị kháng M.tuberculosis liên quan tới đột biến nhiều gen, bao gồm katG, ahpC, inhA, kasA, ndh INH tiền thuốc cần hoạt hóa Khoa Sinh học 10 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà catalase/ peroxidase mã hóa katG INH hoạt hóa can thiệp vào q trình tổng hợp thành phần thiết yếu vi khuẩn lao mycolic acid cách ức chế NADH-dependent enoyl-ACP reductase mã hóa inhA Hai chế phân tử nguyên nhân dẫn đến tính kháng Isoniazid: đột biến katG inhA Sau uống, INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% dạng tự do, phần kết hợp với axit amin máu thành hydrazol; INH dạng tự hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao Phần cịn lại chuyển hóa gan tạo thành hợp chất khơng có tác dụng với vi khuẩn lao Tại gan, 50% - 90% INH acetyl hóa enzyme NAT2 Hình 1.4 tạo thành acetyl Isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl hydrazine Một đường khác INH bị thủy phân trực tiếp tạo hydrazin Sau NAT2 xúc tác q trình acetyl hóa hydrazin tạo acetyl hydrazin diacetyl hydrazin INH, Acetyl hydrazine hydrazin bị oxi hóa cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) tạo thành hợp chất trung gian gây độc cho thể Enzyme glutathione S-transferase (GST) kết hợp với chất trung gian với glutathione loại bỏ chất chuyển hóa độc hại Các chất chuyển hóa INH thải trừ khỏi thể chủ yếu qua hệ tiết niệu (chiếm 80%) Dưới 10% liều INH đào thải qua phân [40] CYP2E1: cytochrome P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid gan [40] Khoa Sinh học 11 Khoá 2016-2018 ... quan đến yếu tố di truyền gen NAT2 bệnh nhân lao phổi, chúng tơi đề xuất đề tài ? ?Khảo sát tính kháng thuốc vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị Isoniazid đánh giá ảnh hƣởng gen NAT2 bệnh. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ... VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Vũ Thị