Đồ án tốt nghiệp xác định cộng đồng vi sinh bằng phương pháp pcr và dgge từ rơm trước và sau khi xử lý trồng nấm rơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM Ngành CÔNG NGHỆ SIN[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH CN NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực : HOÀNG NGỌC PHƯƠNG THẢO MSSV: 0851110222 Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật môi trường sống nhằm tìm hiểu thêm đa dạng sinh học mong muốn nhà khoa học giới Trước đây, để phân tích cộng đồng vi sinh vật môi trường tự nhiên, nhà khoa học phải nuôi cấy phân lập qua nhiều công đoạn khác nhau, tốn thời gian công sức lại không đem đến kết mong muốn Trong số tất vi sinh vật tự nhiên, khoảng 99% không phát kỹ thuật ni cấy Vì vậy, sinh học phân tử, phương pháp nhận biết độc lập, khuếch đại giải trình tự gen 16S rDNA, thường sử dụng để có liệu đầy đủ cộng đồng sống môi trường cụ thể, sinh học phân tử đời khắc phục khó khăn cịn hạn chế cơng nghệ sinh học, nhằm góp phần xác định cộng đồng vi sinh vật môi trường nhanh chóng mà khơng phải qua nhiều giai đoạn ni cấy phân lập, qua giúp nhà khoa học hiểu biết nhiều đa dạng sinh học, từ đưa vào ứng dụng nhằm phục vụ cho thực tiễn Áp dụng sinh học phân tử để nghiên cứu cộng đồng vi sinh có rơm rạ giai đoạn trước sau xử lý trồng nấm cần thiết Định danh hệ vi sinh vật có mẫu rơm việc ly trích thu nhận DNA trực tiếp, so sánh thay đổi hệ vi sinh mẫu rơm giai đoạn tiền xử lý trước đưa vào trồng nấm, từ bổ sung hệ vi sinh phù hợp vào giai đoạn rơm tiền xử lý nhằm rút ngắn thời gian ủ rơm trước đưa vào trồng nấm, đem lại hiệu kinh tế cao cho người dân Đây bước khởi đầu quan trọng cho có thêm kiến thức đa dạng sinh học nguồn chất này, góp phần ứng dụng cho nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp Tình hình nghiên cứu Ly trích DNA vi sinh vật trực tiếp từ rơm rạ để tìm hiểu cộng đồng vi sinh vật thực số phịng thí nghiệm nơng nghiệp nước Tuy có quy trình ly trích DNA khác chung mục đích thu nhận DNA nhóm vi khuẩn phục vụ cho nghiên cứu Ở Việt Nam, rơm rạ nguồn lượng lớn chưa ứng dụng nhiều so với vai trò mà mang lại Rơm rạ nói riêng từ biomass nói chung khơng sử dụng cách hiệu Phần lớn chúng đốt bỏ trở lại ruộng sau thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho hộ nhà nông, làm chất trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc…gây lãng phí nguồn lượng tiềm Việc ly trích thu nhận trức tiếp DNA nhóm vi khuẩn từ rơm chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều, chủ yếu phân lập ly trích từ chủng vi sinh cho mục đích nghiên cứu khác Mục đích nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm - Xác định nhóm vi khuẩn rơm trước sau xử lý trồng nấm phương pháp PCR DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 đoạn 16S rDNA - Thành lập phân loài nhóm vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Nhiệm vụ nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh trực tiếp từ rơm xử lý trồng nấm - Tiến hành tinh kiểm tra độ tinh DNA nhóm vi khuẩn - Sử dụng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA vi khuẩn Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose - Xác định nhóm vi khuẩn rơm phương pháp DGGE vùng V3 thc đoạn gene 16S rDNA - Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 đoạn 16S rDNA Đồ án tốt nghiệp - Hình thành phân lồi hệ vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Phương pháp nghiên cứu - Hình thức thu mẫu: Thu mẫu rơm trước sau xử lý trồng nấm - Ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh phương pháp SDS - Tinh DNA kit: GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit - Xác định nhóm vi khuẩn phương pháp PCR khuếch đại đoạn gene 16S rDNA dựa vào cặp mồi 27F 5’ – GA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3’ 1492R 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT CG ACT T – 3’, sau tinh sản phẩm PCR trước phân tích DGGE - Phương pháp DGGE sử dụng để xác định hệ vi khuẩn mẫu: + PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA vi khuẩn thực với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn 517R 5’ – ATT AC GCG GCT GCT CC – 3’ 357F – GC 5’ – CGC CCG CGC GCG GGC GGG GGG GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ + Thực phương pháp DGGE gel polyacrylamide + PCR vùng V3 đoạn gene 16S rDNA sau DGGE với cặp mồi 357F 5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ 517R 5’ – ATT ACC GCG GCT GCT GG – 3’ Tinh thu nhận DNA từ gel polyacrylamide Kit QIAEX II trước bước vào giải trình tự lồi + Giải trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA vi khuẩn + Kết giải trình tự so chuỗi chương trình BLAST ngân hàng liệu gene NCBI Kết nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm rơm - Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào khuếch đại đoạn gene 16S rDNA phản ứng PCR - Xác định nhóm vi khuẩn mẫu phương pháp DGGE vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA Đồ án tốt nghiệp - Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA vi khuẩn - Hình thành phân lồi cộng đồng vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm chương: - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Vật liệu phương pháp - Chương 3: Kết thảo luận - Chương 4: Kết luận kiến nghị Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rơm rạ 1.1.1 Thành phần cấu tạo rơm rạ Cây lúa ln giữ vị trí trung tâm nơng nghiệp kinh tế Việt Nam Hình ảnh đất Việt thường mơ tả địn gánh khổng lồ với hai đầu hai vựa thóc lớn Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Đồng Bằng Sông Hồng (ĐBSH) Khoảng 80% số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu dựa vào hình thức canh tác thủ cơng truyền thống [8] Việc sản xuất lúa gạo tạo lượng lớn phế phẩm từ lúa bao gồm rơm trấu Rơm trấu hai số nhiều nguồn biomass phổ biến có tiềm Việt Nam Rơm rạ thành phần hỗn hợp nhiều hợp chất hóa học khác tạo nên thành phần cấu trúc cao phân tử gồm cacbonhydrate, lượng nhỏ protein khoáng Nghiên cứu tế bào qua kính hiển vi cho thấy mơ hình cấu tạo phức tạp rơm Các phần phân đoạn thực vật nói chung rơm rạ nói riêng gồm: đốt (mắt), lóng (thân) Tỷ lệ cấu trúc phân đoạn loài tương đối khác nhiều yếu tố: Loài, vụ mùa, đất, điều kiện khí hậu…Như hệ quả, thành phần hóa học phần phân đoạn thực vật khác cấu tạo lồi khác [17] Thành phần hóa học rơm rạ tính theo khối lượng khô gồm cellulose 60 %, lignin 14%, đạm hữu (protein) 3,4%, chất béo (lipid) 1,9% Nếu tính theo nguyên tố cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, N khoảng 0,92% , lượng nhỏ photpho (P), lưu huỳnh (S) kali (K) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Thành phần cấu tạo hóa học phần phân đoạn rơm dạng lúa: lúa ngắn ngày lúa dài ngày (Antongiovanni cộng sự, 1991) [17] Lúa dài ngày Thành phần cấu tạo Lóng Đốt (mắt) Lúa ngắn ngày Lá Lóng Đốt (mắt) Lá g/kg DM Nitơ tổng 34 70 38 26 39 35 Thành tế bào 782 737 787 766 773 800 Tro 100 162 211 184 182 193 Silica 28 26 103 29 55 67 Cellulose 411 327 323 433 332 364 Hemicellulose 245 286 256 242 331 283 Rơm rạ có hai đặc tính là: Hàm lượng N thấp (< 1%), nghèo khoáng vitamin, chứa nhiều xơ thơ nên tỷ lệ tiêu hóa thấp Việc tiêu hóa xơ nhờ hoạt động lên men vi sinh vật đường tiêu hóa Chất xơ rơm chủ yếu cellulose, hemicelluloses lignin Giữa chúng có liên kết hóa học tạo nên bền vững màng tế bào thực vật Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo thành micell bền vững Cellulose có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử polymer mạch thẳng, đơn vị disaccharide gọi cellobiose, có cấu trúc từ hai phân tử D – glucose Cấu trúc bậc bậc phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với lực liên kết hydro [2] Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên bền vững, phân tử cellulose gồm từ 7000 – 14000 đơn vị glucose tạo thành Hemicellulose heteropolysaccharide với cellulose có màng tế bào thực vật Hemicellulose khơng hịa tan nước hòa tan dung dịch kiềm bị Đồ án tốt nghiệp thủy phân acid dễ dàng so với cellulose Khi bị thủy phân, từ hemicelluloses tạo glucose, fructose, mantose, galactose, cuabinose xylose Thành phần thứ ba đáng ý xơ lignin Lignin kèm với cellulose hemicellulose thành phần tế bào, không hịa tan nước, dung mơi hữu bình thường bền vững enzyme hệ sinh vật cỏ Nhưng tác dụng kiềm lignin phần bị phân giải chuyển vào dung dịch Trong cỏ lồi nhai lại có vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải cellulose Cellulose hemicellulose hợp chất tiêu hóa Nhưng phần lớn cellulose tham gia cấu tạo vách tế bào rơm nên enzyme hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động Lớp thành tế bào tạo thành chủ yếu từ phức chất lignohemicellulose mà enzyme vi sinh cỏ phân giải vơ chậm Điều cản trở lớp giàu cellulose trước tác động enzyme vi sinh vật, cản trở phân giải chất chứa tế bào Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa rơm rạ chất xơ khác, nhà nghiên cứu tiến hành xử lý rơm nhiều phương pháp như: lý học, hóa học, vi sinh vật học [1] 1.1.2 Cộng đồng vi sinh vật phân giải cellulose Rơm rạ có từ 400 - 430 g xơ kg chất khơ khó phân hủy Về nguyên tắc rơm rạ hệ vi sinh cỏ phân giải, nhiên bị lignin hóa cao nên khả tiêu hóa thực tế bị hạn chế Sự liên kết chặt chẽ lignin với cacbonhydrate tạo thành phức hợp lingo – hemicellulose/cellulose vách tế bào thực vật Liên kết có lợi cho thực vật lại bất lợi cho trình lên men vi sinh vật, làm cản trở tác động enzyme vi sinh vật Các biện pháp xử lý nhằm làm thay đổi số tính chất hóa lý rơm để làm tăng khả phân giải vi sinh vật với thành phần xơ Cellulose thành phần chủ yếu vách tế bào thực vật Hàng ngày, hàng giờ, lượng lớn cellulose tích lũy lại đất sản phẩm tổng hợp thực vật thải ra, cối chết đi, cành rụng xuống Một phần không nhỏ người thải dạng rác thải, giấy vụn, phôi bào, mùn cưa… Nếu khơng có Đồ án tốt nghiệp trình phân giải sinh vật lượng chất hữu khổng lồ tràn ngập trái đất Cellulose khó phân giải, vi sinh vật phân hủy cellulose phải có hệ enzyme gọi cellulase bao gồm enzyme khác Enzyme C1 có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình khơng gian thành dạng cellulose vơ định hình, enzyme gọi cellobiohydrolase Enzyme thứ hai endoglucanase có khả cắt đứt liên kết β-1, bên phân tử tạo thành chuỗi dài Enzyme thứ exo – gluconase tiến hành phân giải chuỗi thành Disaccharide gọi Cellobiose Cả hai loại enzyme endo exo – gluconase gọi Cx Enzyme thứ β – glucosidase tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose [2] Cellulose tự nhiên C1 cellulose vơ định hình CX Β - glucosidase cellobiose glucose Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả phân hủy cellulose nhờ có hệ cellulase ngoại bào Cellulase tổng hợp từ nhiều chủng vi sinh khác nhau: + Cellulase từ vi khuẩn: Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorenscens, Acetobacter Xylium, vi khuẩn cỏ, Clostridium… + Cellulase từ xạ khuẩn: Các loài Actinomyces, Streptomyces… + Cellulase từ nấm: Aspergylus niger, Aspergylus Oryzae, Tricoderma, Mucor pusillus [22] Trong vi nấm nhóm có khả phân giải mạnh tiết mơi trường lượng lớn enzyme đầy đủ thành phần Các nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose đáng ý Tricoderma Hầu hết loài thuộc chi Tricoderma sống hoại sinh đất có khả phân hủy cellulose Chúng tiến hành phân hủy tàn dư thực vật để lại đất, góp phần chuyển hóa lượng chất hữu khổng lồ Tricoderma sống tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá hủy vật liệu Trong nhóm vi nấm, ngồi Đồ án tốt nghiệp Tricoderma cịn có nhiều giống khác có khả phân giải cellulose Aspergillus, Fusarium, Mucor… Nhiều loài vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Thường đất có lồi vi khuẩn có khả tiết đầy đủ loại enzyme, hệ enzyme cellulase Nhóm tiết loại enzyme hệ enzyme cellulase Nhóm tiết loại enzyme này, nhóm khác tiết loại khác, chúng phối hợp với để phân giải chất mối quan hệ hỗ sinh Nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm Pseudomonas, Cellulomonase, Achromobacter Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm Clostridium đặc biệt nhóm vi khuẩn sống cỏ động vật nhai lại Chính nhờ nhóm vi khuẩn mà trâu bị sử dụng cellulose có cỏ, rơm rạ làm thức ăn Đó cầu khuẩn thuộc chi Rumonococcus có khả phân hủy cellulose thành đường acid hữu Ngoài vi nấm vi khuẩn, xạ khuẩn niêm vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Người ta thường sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt chi Streptomyces việc phân hủy rác thải sinh hoạt Những xạ khuẩn thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng, phát triển tốt nhiệt độ 45 – 50 0C thích hợp với trình ủ rác thải [2] Nhìn chung, hệ vi sinh vật rơm rạ đa dạng mặt phân loại chức Tổng cộng có 259 chủng vi khuẩn 45 loài nấm phân lập với đặc tính chức khác Sự đa dạng cộng đồng vi sinh vật rơm rạ đánh giá việc giải trình tự 16S rDNA cho kết luận có 17 họ vi khuẩn họ nấm có rơm Bacillaceace, Burkholderiaceae, Enterobacteraceae Pseudomonadaceae họ phổ biến Hoạt động phân giải cellulose phát Bacilliaceae, Enterobacteriaceae, Flexibateraceae, Microbacteriaceae Paenibacillaceae Hoạt tính phân giải chitin phổ biến loài Flexibacterceae, Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Oxalobacteriaceae, Staphylococcaeae Xanthomonadaceae Các tác nhân gây bệnh lúa tiềm Đồ án tốt nghiệp họ Nectriaceae Trichocomaceae phát từ việc phân lập rơm Các loài nấm vi khuẩn đóng góp đáng kể vào phân hủy rơm rạ [8] Hệ vi sinh vật phân giải cellulose lên men kỵ khí hiếu khí, bình nhiệt nhiệt, bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn tìm thấy nhiều đất, nước, đường tiêu hóa số động vật…nơi cung cấp lượng cellulose dồi để vi sinh vật phân giải phát triển 1.2 Các phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số 1.2.1 Nguyên tắc yêu cầu Ly trích thu nhận DNA tổng số nhu cầu cần thiết thực nghiệm công nghệ gene tiến hành với DNA (hay RNA) DNA cần phải đảm bảo độ tinh khiết độ nguyên vẹn cấu trúc để thực khâu nghiên cứu Có nhiều phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số cho phù hợp DNA phân tử có kích thước lớn, thao tác cần tránh tác nhân học hay hóa học mạnh làm đứt hay gãy phân tử [20] 1.2.2 Một số phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử phải bắt nguồn từ DNA Do cần phải tách chiết lượng DNA đủ lớn tinh Để ức chế hoạt động enzyme nội bào phân tử DNA phải tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp Một số phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số: 1.2.2.1 Phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh vật môi trường tự nhiên Vi sinh vật tự nhiên đa dạng, mức độ đa dạng vi sinh vật thay đổi theo mơi trường Những vi sinh vật tìm thấy thường tế bào đơn tập đoàn vi sinh vật Sự phức tạp tính di truyền cộng đồng vi sinh vật đánh giá thông qua việc xác định tổ hợp DNA, chưa kể có mặt gene vi sinh vật chưa khám phá [15] 10 Đồ án tốt nghiệp Sự đời kỹ thuật dựa phân tử acid nucleic dẫn tới thay đổi lớn việc phát vi sinh vật môi trường tự nhiên (Liesack cộng sự, 1992; Ward cộng sự, 1990) Với kỹ thuật phát số thay đổi lớn việc tìm hiểu cấu trúc vận động vi sinh vật cộng đồng môi trường tự nhiên (Lionet cộng sự, 2003) Mặc dù phương pháp kỹ thuật dựa phân tử acid nucleic phá vỡ hạn chế việc chọn lọc tính chất đặc trưng việc ly trích DNA (Head cộng sự, 1998) Sự phục hồi tính đa dạng vi khuẩn chịu ảnh hưởng việc ly trích DNA, độ tinh khiết DNA từ mơi trường có đạt u cầu hay không? Sự diện thành phần khác môi trường làm ảnh hưởng cản trở phát DNA thể qua kết ly trích tinh Vì việc lựa chọn phương pháp ly trích tinh quan trọng cho DNA vi sinh vật từ môi trường tự nhiên [10] Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng yếu tố khơng ly trích hồn toàn tế bào vi khuẩn DNA bị hư hỏng (Miller cộng sự, 1999) Rõ ràng việc áp dụng quy trình ly trích DNA phù hợp với mẫu cụ thể cần thiết cho việc đánh giá đa dạng vi sinh vật Phương pháp ly trích DNA cần phải đơn giản, nhanh chóng hiệu Chất lượng DNA quan trọng ảnh hưởng đến hiệu khuếch đại DNA sau Do ly trích DNA coi bước phân tích độc lập phân tích đa dạng vi sinh vật (Abriouel cộng sự, 2006; Cankar cộng sự, 2006) Việc ly trích thường kết hợp với chất tẩy, tác nhân vật lý, dung môi enzyme để thu nucleic acid (Sokollek cộng sự, 1998; Nanda cộng sự, 2001; Gonzaslez cộng sự, 2004; Gullo cộng sự, 2006; Haruta cộng sự, 2006; Ndoye cộng sự, 2006) [6] Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ mơi trường tự nhiên thường sử dụng:  Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Đây xem phương pháp thích hợp nhất, đơn giản nhanh chóng thu nhận DNA vi sinh vật với hiệu cao, phục vụ cho trình PCR J Zhou cộng (1996) 11 Đồ án tốt nghiệp sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) ủ mẫu – diện Sodium dodecyl sulfate (SDS), hexadecyltrimethylammonium bromide, proteinase K [9]  Phương pháp Cetyl – Trimetyl – Ammoniumbromide (CTAB) ly trích DNA: Đây phương pháp dùng chiết xuất acid nucleic có hiệu cao, CTAB dung mơi có khả hịa tan cao acid nucleic, mà CTAB dùng với vai trị chất tách chiết acid nucleic Ly trích DNA vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB mô tả Ausubel cộng (1992) Ly trích DNA cần phải có hai yếu tố hiệu suất độ tinh khiết Phương pháp ly trích DNA cho hiệu suất cao thường chứa tạp chất ảnh hưởng đến q trình thí nghiệm sau, phương pháp cho độ tinh khiết cao lại tỷ lệ nghịch với hiệu suất (Zimmermann cộng sự, 1998) Trong nghiên cứu Jara C (2008), phương pháp ly trích tốt phương pháp CTAB [6]  Phương pháp Benzyl chloride: Đây phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu Nó phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 650 C Ưu điểm phương pháp đơn giản, nhanh chóng mang lại kết cao Phương pháp Zhu cộng (1993) sử dụng để ly trích DNA thực vật, nấm vi khuẩn [21]  Phương pháp đóng băng tan băng: Đây phương pháp Ellingsue cộng (2002) Phương pháp sử dụng kỹ thuật đóng băng tan băng - 650C ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng thành phần bên tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên [9] Một so sánh kết hợp phương pháp ly trích DNA trực tiếp từ cộng đồng vi sinh vật Juria R (2004) báo cáo Lựa chọn ứng dụng quy trình vào thử nghiệm ly trích DNA quan trọng Có hai hướng chính: (1) ly trích từ tế bào vi sinh phân lập (2) ly trích trực tiếp từ mẫu ban đầu mà không qua phân lập chủng vi sinh (Saano cộng sự, 1995) Trong hai 12 Đồ án tốt nghiệp hướng trên, số phương pháp khác sử dụng ly trích DNA gồm chu kỳ đóng băng tan băng, đun sôi, dùng nitơ lỏng, nghiền nhỏ, thẩm thấu, SDS, Lysozyme số cách khác (Sorensen cộng sự, 2002) Ở đây, sử dụng phương pháp ly trích DNA trực tiếp từ đất theo Ogram cộng (1987) có sửa đổi để phù hợp [11] 1.2.2.2 Phương pháp ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm rạ Để thu nhận DNA vi khuẩn đảm bảo độ tinh cần loại bỏ hết thành phần tạp nhiễm, quan trọng protein Sự ly trích DNA dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích cuối thu nhận DNA trạng thái cịn ngun vẹn tối đa, khơng bị phân hủy tác nhân học hay hóa học Việc thu nhận DNA cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào Sau công đoạn tách chiết, DNA tinh Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận DNA dạng cặn tủa dể bảo quản cần hịa tan nước khử ion dung dịch TE theo nồng độ mong muốn  Một số phương pháp ly trích DNA vi khuẩn từ rơm rạ: Rơm rạ thành phần sản xuất methanol, khí gây hiệu ứng nhà kính, rơm nguồn phế phẩm ngành nông nghiệp Cộng đồng vi sinh phân giải rơm rạ điều kiện hiếu khí nhà khoa học nghiên cứu phương pháp sinh học phân tử Việc ủ rơm phân tích giai đoạn khác cho kết cộng đồng vi sinh khác qua PCR điện di mẫu (Sabine Weber cộng sự, 2011) [19] Ngoài ra, cộng đồng vi sinh có đa dạng khác nguồn rơm rạ pH khác Cộng đồng vi sinh rơm điều kiện pH khác kiểm tra cách sử dụng phương pháp in – vitro với số sửa đổi Sung cộng (2006) DNA vi khuẩn ly trích từ rơm theo phương pháp mô tả Purdy cộng (1996) [12] 13 Đồ án tốt nghiệp Các mẫu thân rơm sử dụng 0,5 g trọng lượng tươi để phân tích DNA tổng số vi khuẩn Việc ly trích thực theo phương pháp tan băng theo Zhou cộng (1996), Tun cộng (2002) [5] Một nghiên cứu khác ly trích DNA vi sinh vật phân giải cellulose phương pháp Benzyl Chloride (Zhu cộng sự, 1993), sau để loại bỏ thành phần tạp có mẫu chiết xuất cách sử dụng Geneclean spin kit (BIO101, Carlsbad, Calif.) giai đoạn tinh [18] 1.2.2.3 Phương pháp ly trích thu nhận DNA vi khuẩn từ dịch khuẩn nuôi cấy Để ly trích DNA vi khuẩn từ dịch khuẩn ni cấy, Ghazanfar cộng (2010) sử dụng quy trình Roger S cộng (1994) quy trình cải tiến CTAB Sau ly trích, DNA tổng số điện di gel agarose 1% điện 100 Volts phút đo Nanodrop để xác định nồng độ độ tinh Phương pháp sử dụng CTAB nóng, dung mơi có khả hòa tan cao acid nucleic Ở nhiệt độ cao, CTAB cịn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào màng nhân để giải phóng tối đa lượng acid nucleic dung dịch làm biến tính số protein, đặc biệt enzyme thủy phân acid nucleic Giúp cho việc ly trích DNA đạt hiệu tốt [15] 1.3 Phương pháp PCR ứng dụng 1.3.1 Phương pháp PCR Phương pháp PCR Karl Mullis cộng phát minh vào năm 1985, cách mạng sinh học phân tử PCR phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc đoạn ADN theo luật số mũ Phản ứng nhân gene thực với enzyme ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP dTTP) Mỗi chu kỳ phản ứng nhân gene gồm bước: Bước biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép Bước bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn khuôn Bước kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với trình trùng hợp gắn dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên theo nguyên tắc bổ 14 Đồ án tốt nghiệp sung Tính đặc hiệu phản ứng quy định mồi chép trực trình tự sợi khn hai mồi Như vậy, kết tạo hàng triệu phiên sợi khuôn vài Mồi cho phản ứng đoạn DNA có kích thước 20 – 30 nucleotice thiết kế theo trình tự đoạn gene cần khuếch đại dựa theo liệu có sẵn Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức tồn phản ứng, tức chúng phải bám đặc hiệu vào vị trí riêng cho mồi Sở dĩ chúng không bám vào vị trí đặc hiệu khơng thể khuếch đại đoạn gene đích Với gene rDNA cặp mồi thiết kế chúng nhân gene từ nhiều đối tượng Ngược lại, nhiều trường hợp dùng mồi khơng đặc hiệu nhân sản phẩm PCR khơng đặc hiệu Tuy nhiên, hai kết dùng cho xác định loại vi sinh vật Thí nghiệm phản ứng PCR lần dùng mảnh Klenow enzym DNA polymerase I từ E.coli Tuy nhiên, enzyme bị biến tính 94 oC cần phải bổ sung enzyme sau chu kỳ phản ứng Đến trình cải thiện dùng enzyme Taq DNA polymerase (Taq = Thermus aquaticus) chịu nhiệt Enzyme tách từ vi khuẩn sống suối nước nóng Tốc độ xúc tác cho phản ứng enzyme nhanh, đạt khoảng 8000 bp/phút 755 oC Hoạt tính enzyme giảm nửa xử lý 92,5 oC 230 phút 40 phút 95 oC Như dùng enzyme khơng cần bổ sung enzyme sau chu kỳ phản ứng Phản ứng PCR sử dụng enzyme chịu nhiệt tạo nhiều phiên theo hàm số mũ Một sợi DNA ban đầu sau vài nhân lên 1011 phiên DNA Sau thực phản ứng PCR cần tiến hành số kỹ thuật để xác định sản phẩm điện di xác định kích thước sản phẩm PCR Phương pháp PCR nhanh chóng ý trở nên phổ biến nghiên cứu phát vi khuẩn hay virus nồng độ thấp mẫu môi trường bệnh phẩm Một số ứng dụng kỹ thuật PCR phát đối tượng vi sinh vật khác trình bày tạp chí 15 Đồ án tốt nghiệp chuyên ngành Journal of Clinical Microbiology, Applied Environmental Microbiology [23] 1.3.2 Ứng dụng phương pháp PCR trình xác định lồi vi sinh vật Kỹ thuật PCR sử dụng rộng rãi nghiên cứu xác định DNA nhiều đối tượng vi sinh vật Nguồn DNA đích đơi có số lượng trừ tiến hành nuôi cấy vi sinh vật Trong số trường hợp việc nuôi cấy thực với nhiều loài vi sinh vật virus trường hợp khác cần thời gian nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho việc lai xác định loài PCR đời khắc phục khó khăn Từ có đời kỹ thuật PCR kỹ thuật giải trình tự có tiến vượt bậc Chỉ cần dùng PCR nhân đoạn gen muốn giải trình tự thành hàng tỷ hồn tồn giống hệt sản phẩm khuếch đại đưa vào giải trình tự trực tiếp mà khơng cần phải chèn plasmid giải trình tự Sự phát minh kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm PCR giúp cho việc cải tiến phản ứng giải trình tự hiệu trước trở nên hiệu nhờ áp dụng enzyme polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự thực qua chu kỳ giống hệt PCR, mà ngày gọi phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự hiệu phản ứng tốt nhiều, đồng thời tối ưu hóa thành phần phản ứng dễ dàng nhiều Có thể nói đời hoàn thiện kỹ thuật PCR giúp tăng tốc giải trình tự khơng vấn đề hồn thiện mà vấn đề phạm vi áp dụng [25] Tiến hành PCR khuếch đại đoạn gene đặc trưng loài vi sinh vật nghiên cứu dựa cặp mồi đặc trưng loài vi sinh vật Mỗi vi sinh vật có cặp mồi chuyên biệt để dựa vào dễ dàng xác định chúng Sử dụng phương pháp PCR để xác định giống Lactobacillus thực thông qua việc sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm: Lac Lac 2, trình tự cặp mồi sau: 16 Đồ án tốt nghiệp Lac 5’ – AGC AGT AGG GAA TCT TCC A – 3’ Lac 5’ – ATT CCA CCG CTA CAC ATG – 3’ Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA thực với hai mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm Lac Lac 4, trình tự mồi sau: Lac 5’ – GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG – 3’ Lac 5’ – CAC CGC TAC ACA TGG AG – 3’ Sử dụng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA đoạn gene ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men [4] Các cặp mồi sử dụng khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA, ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men Trình tự cặp mồi NL ITS: Cặp NL: NL4 5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG – 3’ NL4 5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G – 3’ Cặp ITS: ITS1 5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’ ITS4 5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’ Bảng 1.2: Một số vi sinh vật nghiên cứu phương pháp PCR [23] Vi sinh vật Tài liệu Clostridium difficile Gumerlock et al (1991) Escherichia coli Jackson (1992) Helicobacter pylori Claton et al (1992) Litsteria monocytogenees Niederhauser et al (1992) Mycobacterium tuberculosis Altamirano et al (1992) Salmonella spp Rahn et al (1992) Staphylococcus spp Murakami et al (1991) Yersinia Nakajima et al (1992) 17 Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Ứng dụng phương pháp PCR q trình xác định lồi vi khuẩn Phương pháp PCR phương pháp ứng dụng rộng rãi việc xác định loài vi sinh vật Đối với loài vi khuẩn vậy, người ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gene vi khuẩn Kết thu từ phản ứng PCR thu nhận đoạn gene với kích thước mong muốn Mỗi lồi vi khuẩn có cặp mồi chuyên biệt, dựa cặp mồi chuyên biệt kết hợp với yếu tố cần thiết phản ứng PCR việc xác định loài vi khuẩn trở nên đơn giản Ví dụ mồi cho vi khuẩn Haemophilus influenza (gene bexA): Hib 1: GCG AAA GTG ACC TCT TAT CTC TC Hib 2: GCT TAC GCT TCT ATC TCG GTG AA Các vi khuẩn khó ni cấy thường có mặt ngồi mơi trường tự nhiên xác định trực tiếp PCR, ví dụ Legionella, Samonella, Shigella Vibrio cholera Chỉ cần từ 10 – 1000 tế bào vi khuẩn tùy theo kỹ thuật đủ để thực phản ứng PCR Nhờ khuếch đại đoạn gene 16S rDNA đặc trưng vi khuẩn với cặp mồi chuyên biệt, người ta so sánh mối quan hệ gần hay xa vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết xác [24] 1.4 Ứng dụng DGGE xác định cộng đồng vi sinh 1.4.1 Phương pháp DGGE Điện di gel gradient biến tính (DGGE) phương pháp hữu hiệu để xác định đột biến đa dạng vi sinh vật DGGE có hai yếu tố sau: (1) Sự biến tính DNA nhiệt độ đặc biệt thay trình tự nucleotide cặp đơi; (2) Sự biến tính phần sợi kép DNA làm chậm lại q trình di chuyển gel polyacrylamide [3] DGGE kỹ thuật sử dụng sinh học phân tử trở thành phương pháp yếu để xác định đặc tính mật độ kết cấu động học Đây phương pháp mới, cung cấp nhanh chóng đặc tính, xác định đa dạng thành phần cấu trúc hệ vi sinh vật DGGE ứng dụng lĩnh vực 18 Đồ án tốt nghiệp y học để phát đột biến, gồm đoạn đơn nucleotide đa hình (SNPs) Khi phân tích DGGE, cần có số lượng ý nghĩa DNA để phát hiện, phản ứng chuỗi PCR sử dụng để khuếch đại đoạn gen trước Tất vấn đề đặc tính mẫu, ly trích DNA (hoặc RNA), chép ngược (nếu dung dịch chiết RNA), thiết kế mồi PCR, điều kiện cho phản ứng PCR, tinh PCR trước sử dụng kỹ thuật DGGE Phương pháp DGGE phương pháp có độ nhạy cao, nhanh chóng cung cấp đầy đủ đặc tính đặc trưng đa dạng thành phần cộng đồng vi sinh Đồng thời thay đổi cộng đồng vi sinh vật dễ dàng chứng minh Phân tích DGGE sử dụng cho việc phân tách mảnh DNA sợi đôi giống hệt chiều dài, khác trình tự Trong thực tế, điều đề cập đến việc phân tách đoạn gene mong muốn phương pháp PCR Kỹ thuật khai thác (trong số yếu tố khác) khác biệt kết nối ổn định G C (3 liên kết hydro kết nối) trái ngược với kết nối A – T (2 liên kết hydro) Một hỗn hợp gồm đoạn DNA khác trình tự khác điện di môi trường polyacrylamide sợi đôi đoạn DNA di chuyển tốt hơn, phân tử DNA biến tính lại trở nên hiệu khơng di chuyển gel Nói chung, đoạn DNA G – C ổn định cịn sợi đơi đạt đến nồng độ cao nồng độ ban đầu Như vậy, đoạn DNA chuỗi khác tách gel polyacrylamide [20] 1.4.2 Các ứng dụng DGGE xác định loài vi sinh vật Việc sử dụng kỹ thuật PCR DGGE giúp cho nhà khoa học tìm hiểu đa dạng sinh học vi sinh vật quần thề sinh vật (Muyzer cộng sự, 1996) DGGE sử dụng cho việc nghiên cứu đa dạng sinh thái vi sinh vật mẫu nguyên thủy hay gọi mẫu môi trường (Heure cộng sự, 1997) Thêm vào phương pháp cịn cho phép phân tích đoạn gen có kích thước lớn 16S rRNA thường nhân cặp mồi thông dụng Trên 19 ... nghiên cứu - Ly trích thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm - Xác định nhóm vi khuẩn rơm trước sau xử lý trồng nấm phương pháp PCR DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng... rDNA Đồ án tốt nghiệp - Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA vi khuẩn - Hình thành phân lồi cộng đồng vi khuẩn có rơm trước sau xử lý Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp. .. DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước sau xử lý trồng nấm rơm - Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào khuếch đại đoạn gene 16S rDNA phản ứng PCR - Xác định nhóm vi khuẩn mẫu phương pháp DGGE